中国汉族人HIV—1辅助受体等相关基因CCR5、CCR2b、CXCR4和SDF1编码区SNP位点调查

目的：调查中国汉族人群中HIV－1感染相关基因CCR5、CCR2b、CXCR4及SDF1编码区的基因多态性特点，为我国的艾滋病防治提供基础数据。方法：CCR5用2对引物进行PCR扩增，用PCR产物做模板直接测序。CCR2b编码区经PCR扩增后，用测序引物逐段分别测序。CXCR4（cDNA编号AF147204）编码区用2对引物进行PCR扩增，然后测序。SDF1编码区用4对引物进行PCR扩增，然后分别测序。样本总数为45例，测序结果用DNAstar综合分析，寻找和鉴定SNP位点。结果：CCR5基因编码区共发现6个SNP位点，4个引起氨基酸改变，1个单碱基缺失，引起移码突变和翻译提前终止。184A→G、503G→T、668G→A、999→T等位基因频率分别为1．1％、21．1％、8．9％和10．0％。CCR2b编码区共发现8个SNP位点，6个错义突变，即43位G→C、190位G→A、260－位C→A、302位C→A、315位G→C、433位G→A，突变频率分别为：30．0％、27．8％、32．2％、5．6％、10．0％和3．3％。CXCR4编码区共发现7个SNP位点，3个错义突变即38位C→T、90位A→T、712位A→C，1个终止突变：106位G→T，基因突变频率分别为：4．4％、4．4％、10．0％和3．3％。在SDF1编码区发现1个错义SNP位点：192位G→T，突变频率为8．9％；1例单碱基缺失：100位T缺失（100ΔT），引起34位氨基酸移码突变。结论：中国汉族人HIV－1相关基因编码区有自己的多态性特点。4个HIV－1相关基因编码区共工到22个SNP位点，17个为首次报道；2个单碱基缺失均导致移码突变和翻译提前终止，1个已经报道。它们对HIV－1感染和艾滋病病程的影响值得进一步研究。     

内引物在环媒恒温基因扩增技术中的作用研究

目的研究内引物在环媒恒温基因扩增（LAMP）中的作用,确定利用LAMP的同一套特异性引物区别具有单核苷酸差异的不同株型或同一株型的病原菌基因的可行性。方法采用PCR介导定点突变法对沙门氏菌invA基因定点突变,使其T669→A669、T725→A725,用原LAMP特异性引物扩增含单核苷酸差异序列,观察扩增结果。结果制备的点突变模板C大小与预期值（1 371 bp）一致。LAMP扩增的伤寒沙门氏菌CMCC50098标准株DNA产物的电泳条带呈梯状,而扩增模板C未扩出反应产物。结论LAMP不能利用同一套引物扩增具有单核苷酸差异的不同株型或同一株型的病原菌,即可利用同一套引物区分这些病原菌。     

云南省间日疟原虫SSUrRNA基因片段的体外扩增、克隆及序列分析

根据已知间日疟原虫、其它相关原虫及人小亚单位核糖体核糖核酸(SSUrRNA)基因序列,借助计算机程序分析,设计一对寡聚核苷酸引物。采用聚合酶链式反应(PCR)技术,从云南省两例间日疟患者血样DNA抽提物中,均扩增出长约641个碱基对(bp)的SSUrRNA基因特定片段;双脱氧链末端终止法测序结果表明,两份样本扩增片段DNA序列完全相同,但与背景序列比较,在第269位出现碱基置换由G变为A,而在第630位则缺失一碱基C,从而导致该两处限制性内切酶位点的改变。     

白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因部分序列比较研究

目的通过对白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因部分序列的比较，探讨两相细胞在DNA水平的差异。方法分别抽提7株来自同一亲本且对氟康唑敏感性不同的白念珠菌菌丝相与酵母相基因组DNA，根据ERG11基因编码序列设计一对引物，对ERG11基因第948位点至第1254位点307bp的碱基序列进行PCR扩增，以PCR产物直接测序比较两相在该片段碱基序列上的差异。结果7株白念珠菌菌丝相与酵母相在该片段的碱基序列无差异。结论白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因的第948位点至第1254位点序列无差异。     

双碱基延伸法结合荧光偏振法快速检测新甲型HINl耐药位点方法的建立

目的建立一种利用双碱基延伸法与荧光偏振技术（Fluorescence polarization,FP）快速检测甲型H1N1流感病毒NA基因耐药突变位点的新方法。方法从GenBank随机下载30条甲型HINl的NA（neuraminidase）基因序列,通过MEGA分析,利用Primer Premier软件设计3条特异引物,其中一对引物通过RT—PCR用于扩增含有耐药位点H275Y的NA基因,第3条引物是应用双碱基延伸终止法与荧光偏振技术检测NA基因对达菲类药物耐药位点H275Y的突变情况,再随机选取50株甲型HINl流感病毒进行检测,与测序结果进行比对,验证检测结果的准确性。结果50株甲型H1N1流感病毒的NA蛋白第275位氨基酸均为组氨酸,未发生HY的替换,在灵敏度与特异性方面,与传统的基因测序结果一致性均达100％。结论本方法操作简便、敏感性及特异性高、判读结果直观明确、检测费用低,能实现对耐药位点突变的快速、准确检测,可应用于与SNP相关疾病的快速分型和突变位点的实时监测和临床检测。     

用专一性针对点突变的多聚酶链反应检测抗乙胺嘧啶恶性疟原虫

恶性疟原虫乙胺嘧啶抗性株的检测,以往大多采用体外微量法。本文报道了用多聚酶链反应(PCR)技术检测乙胺嘧啶抗性株。该检测方法的原理是:恶性疟原虫对乙胺嘧啶产生抗药性的关键在于其二氢叶酸还原酶胸苷酸合成酶(DHFR-TS)基因编码区第323位碱基发生突变,利用该单碱基突变,设计一对专一性引物位于突变部位内,使引物与靶DNA 3’端完全互补,在DNA多聚酶的催化下,靶DNA得到扩增。由于与引物     

1例携带HFE基因剪切突变的遗传性血色病患者家系调查

目的探讨1例新型的遗传性血色病(HH)患者家系HFE基因突变形式。方法对确诊的1例HH患者分析其与5位相关亲属的血色病基因,提取血液基因组DNA,采用PCR扩增相关基因HFE、HJV、HAMP、转铁蛋白受体(TfR)2、SLC40A1的外显子、内含子剪切序列,琼脂糖凝胶电泳、纯化后,双向直接测序检测突变位点。结果先证者肝功能异常,血清铁(SI)、总铁结合力(TIBC)、铁蛋白(SF)、转铁蛋白饱和度(TS)均升高,HFE基因外显子EXON2的区间序列2号内含子第4个碱基出现T→C纯合突变(IVs 2+4T→C,C/C纯合,splicing,异常),HJV、HAMP、TfR2、SLC40A1未见异常,患者儿子出现与其相同纯合突变,3位亲属存在杂合突变,1位亲属无异常突变。结论基因检测在血色病诊断中起着重要作用,HFE基因IVs 2+4T→C突变可能是新型的中国HH的致病遗传基因突变类型。     

先天性长QT综合征KCNQ1基因定点突变的研究

目的利用聚合酶链反应(PCR)技术对长QT综合征(LQTS)KCNQ1基因进行定点突变的研究。方法利用PCR定点突变技术，首先设计两对引物(包含预定的突变)，通过3轮PCR扩增，扩增出含有所需突变位点的片段，然后将片段克隆入T载体中，通过酶切连接的方法将突变点引入到pIRES2-EGFP-KCNQ1中，随后用Effectene转染试剂介导转染HEK293细胞。结果在真核表达载体pIRES2-EGFP—KCNQ1基础上获得了KCNQ1 cDNA C682T的突变体，测序结果表明在序列中发生了预期的突变。结论KCNQ1定点突变体的构建为进一步的功能研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌临床分离株热休克蛋白60基因序列分析

目的分析幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)临床分离株热休克蛋白60基因编码区序列特征。方法对分离自我国不同地区、患有不同胃肠疾病患者的63株Hp提取基因组DNA并设计hsp60特异性引物,采用聚合酶链反应(PCR)扩增hsp60基因,经1%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收、纯化PCR产物并测序,用DNAstar 5.0软件中的Clustal W程序对hsp60基因序列及由该序列翻译的氨基酸序列进行比较分析。结果成功特异性扩增并纯化到hsp60全基因序列。经序列比对,发现不同胃肠疾病来源的hsp60基因核苷酸序列在877、1 399以及1 579位点处存在单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)。其中来源于非胃癌患者的Hp在以上三位点处分别有8株(8/48,16.67%)G→A置换,9株(9/48,18.75%)C→G置换,7株(7/48,14.58%)A→G置换;胃癌患者来源的Hp在以上三位点处分别有3株(3/18,16.67%)G→A置换,1株(1/18,5.55%)C→G置换,2株(2/18,11.11%)A→G置换。将核苷酸序列翻译为氨基酸序列后,在以上三位点所对应的氨基酸序列,即293、467以及527位点处分别发生了由缬氨酸(V)到异亮氨基酸(I)、谷氨酰胺(Q)到谷氨酸(E)以及苏氨酸(T)到丙氨酸(A)的改变。结论我国Hp临床分离株热休克蛋白60基因序列存在单核苷酸多态性位点。     

突变敏感性分子开关快速筛查肥厚性心肌病MYH7基因Ala26Val突变

目的利用高保真聚合酶介导的突变敏感性分子开关联合琼脂糖凝胶电泳,建立对肥厚性心肌病MYH7基因Ala26Val突变进行快速筛查的技术平台。方法应用PCR反应扩增包含MYH7基因Ala26Val突变区域的基因序列,通过基因克隆技术与反向PCR体外定点突变技术,分别得到MYH7基因Ala26Val突变的野生模板与突变模板,并通过基因测序分析进行确证。设计与Ala26Val突变位点配对及三末端不配对的3′硫化修饰正向引物,在其下游设计一条反向引物,分别构成野生引物对与突变引物对,进行高保真DNA聚合酶介导的双向引物延伸反应,利用凝胶成像系统对其PCR结果进行分析。结果当突变引物对与突变模板配对时,引物被延伸,有PCR产物;与野生模板不配对时,引物却不能被延伸,无PCR产物。同样,野生引物对只有与野生模板匹配时得以延伸,而与突变模板不匹配时则不能延伸。结论高保真DNA聚合酶偶联硫化修饰引物构成的突变敏感性分子开关能够快速筛查肥厚性心肌病MYH7基因Ala26Val突变,达到非此即彼的二元化效果,该分子开关在肥厚性心肌病基因筛查中具有巨大的潜在应用价值。     

逆转录-套式PCR鉴定福建省登革Ⅰ型病毒

目的检测急性感染者血清中的登革病毒,并判定其型别。方法从血清中提取病毒RNA,使用通用引物和型特异性引物,用逆转录-套式PCR方法扩增登革病毒特异性核酸片段,电泳后观察判定型别。同时还将扩增产物进行测序分析。结果用通用引物扩增5份标本,均出现511bp扩增带,在型特异性引物的扩增下均出现482bp的扩增带,初步判断为DVⅠ病毒。经测序分析进一步确定为DVⅠ病毒。结论运用此方法证实2004年福建省登革热流行系DVⅠ病毒引起。     

旋毛虫亲肌肉抗原的基因克隆和序列分析

目的克隆一个新的旋毛虫基因即亲肌肉抗原(myophilin)并分析其序列同源性,为旋毛虫病疫苗的研制奠定基础。方法检索GenBank旋毛虫基因组数据库,获得旋毛虫亲肌肉抗原的cDNA序列,利用Primer5.0软件设计引物(上、下游引物分别含NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点)。收集云南株旋毛虫肌幼虫,提取总RNA,并以此为模板进行RTPCR。将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,目的基因切胶回收后与克隆载体pMD-19T分别用NdeⅠ、XhoⅠ双酶切,酶切产物以3︰1的比例与pMD-19T连接,然后转化到DH5a大肠埃希菌感受态细胞中,用Amp抗性培养基培养,阳性克隆提质粒后做PCR及双酶切鉴定,阳性菌液进行测序,测序结果与检索基因核苷酸序列通过DNAMAN软件比较,分析其同源性。结果 RT-PCR扩增出旋毛虫亲肌肉抗原全长基因序列,大小为579bp;亲肌肉抗原基因重组质粒经双酶切得到的片段大小分别为579、2 300和300bp,与预期值相符;该基因序列与检索基因核苷酸序列相比,同源性为100%。结论成功克隆出旋毛虫亲肌肉抗原基因,为旋毛虫病疫苗的研制奠定了基础。     

华支睾吸虫磷脂酶A2基因生物学特性的初步研究

目的对新发现的华支睾吸虫磷脂酶A2（CsPLA2）基因进行生克隆、原核表达,确定该蛋白是否为成虫分泌/排泄蛋白（excretory-secretory protein,ESP）。方法利用多种生物信息学分析软件,从华支睾吸虫全长cDNA质粒文库中识别出CsPLA2样基因,分析该基因表达蛋白的生物学功能特征;将CsPLA2克隆入原核表达质粒pET28a（＋）,并在大肠埃希菌BL21/DE3中诱导表达,蛋白表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行鉴定;应用Western blot确定CsPLA2是否为ESP;应用免疫荧光方法观察CsPLA2在成虫的组织定位。结果该基因编码307个氨基酸,含有信号肽序列,具有PLA2功能域和活化位点,与谷蛀虫同源蛋白相比,一致性为45%,相似性为52%。PCR、双酶切及DNA测序结果表明pET28a-CsPLA2重组质粒构建成功,SDS-PAGE显示目的基因在大肠埃希菌BL21/DE3中高效表达,表达产物为包涵体。Western blot结果表明CsPLA2是华支睾吸虫的ESP组分之一。虫体免疫组织化学定位显示CsPLA2定位于虫体的腹吸盘、肠支、睾丸处。结论新发现一个CsPLA2基因,其表达的蛋白定位于虫体的腹吸盘、肠支、睾丸处,为华支睾吸虫成虫ESP组分之一。该基因可在原核表达系统中高效表达。     

Increased in vivo phosphorylation of insulin receptor at serine 994 in the liver of obese insulin-resistant Zucker rats

Serine phosphorylation of the insulin receptor (IR) has been proposed to exert an inhibitory influence on its tyrosine kinase activity. Previous works using site-directed mutagenesis suggested that serine 994 of the IR (IR Ser 994) might be part of an inhibitory domain of the receptor. In this study we examined whether this residue is subjected to phosphorylation in vivo. We used a site-phosphospecific antibody to determine the extent of phosphorylation of IR Ser 994 in insulin target tissues from two animal models of insulin resistance with different IR kinase (IRK) activity: obese (fa/fa) Zucker rats and transgenic mice overexpressing bovine growth hormone (PEPCK-bGH mice).Phosphorylation at IR Ser 994 was markedly increased in liver of obese rats. This alteration appeared to be tissue-selective since no phosphorylation on Ser 994 was detected in IRs isolated from skeletal muscle of these animals. On the other hand, the phosphorylation level of IR Ser 994 was very low in liver of PEPCK-bGH mice and did not differ from that of the control group. We have also demonstrated that protein kinase (PK) C isoforms alpha, betaI and zeta are able to promote the in vitro phosphorylation of the IR on Ser 994. Differential findings in these two models of insulin resistance might thus reflect increased PKC activity resulting from increased lipid availability in obese Zucker rats. Our results suggest that Ser 994 is a novel in vivo IR phosphorylation site that might be involved in the regulation of the IRK in some states of insulin resistance.     

亚洲牛带绦虫泛素缀合酶基因及其蛋白质结构与功能的生物信息学分析

目的分析和预测亚洲牛带绦虫泛素缀合酶基因及其编码蛋白的结构与功能特性,用于指导其生物学功能的实验研究。方法利用美国国家生物技术信息中心和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种工具,结合其它生物信息学分析软件包,如VectorNTIsuite,从亚洲牛带绦虫成虫cDNA质粒文库中识别出泛素缀合酶基因及其编码区,分析、预测该基因编码的蛋白质的理化特性、翻译后的修饰位点、功能域、亚细胞定位、拓扑结构、二级结构等。结果该序列为全长基因,编码区为76bp-537bp,编码154个氨基酸。该序列为泛素缀合酶基因同源序列。其编码蛋白的理论分子量为17397.1,亚细胞定位在细胞核。预测该蛋白无跨膜区。与吸虫属的泛素缀合酶进化关系最近。结论应用生物信息方法从亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中筛选出了亚洲牛带绦虫泛素缀合酶cDNA全长序列并预测得到其结构与功能方面的信息。     

心脏高表达基因hhole通过ERK结合位点抑制心肌肥厚信号分子ANF的转录活性

目的探讨心脏高表达基因hhole调控心肌肥厚信号分子ANF的转录活性的分子机制。方法利用生物信息学在线软件分析hhole蛋白的分子结构。利用酶切法和环状诱变技术突变得到hhole基因的突变体重组质粒。将突变体和野生型的重组质粒分别转染HEK293细胞系,测定荧光素酶报告基因ANF的转录活性。结果生物信息学分析发现hhole蛋白含有ERK结合位点和多聚脯氨酸序列。利用酶切法构建了4个截短突变体重组质粒,环状质粒定点诱变的方法构建了3个定点突变的突变体。荧光报告系统分析发现pCMV-tag2B-TD与pCMV-tag2B-hhole全长均能强烈地抑制ANF的转录活性。结论 hhole蛋白主要通过其ERK结合位点抑制心肌肥厚信号分子ANF的转录活性。     

快速检测牛羊猪种布鲁杆菌多重PCR的建立

目的 建立一种能同时快速检测并能鉴别牛、羊、猪种布鲁杆菌的多重PCR方法.方法 根据IS711插入序列设计1条公共引物和3条牛、羊、猪种布鲁杆菌(544A、16M、1330S)特有序列引物,进行多重PCR反应;选择耶尔森菌O:9、大肠埃希菌O157:H7、鼠伤寒沙门菌47729进行多重PCR反应的特异性检测;倍比稀释定量法观察牛种布鲁杆菌多重PCR反应的敏感性.结果 牛、羊、猪种布鲁杆菌多重PCR反应扩增片段产物长度分别为485、731、248 bp;耶尔森菌O:9、大肠埃希菌O157:H7、鼠伤寒沙门菌47729加入布鲁杆菌中进行多重PCR反应.扩增结果呈阴性;牛种布鲁杆菌多重PCR反应敏感性为0.0967 Pg.结论 成功建立快速检测牛、羊、猪种布鲁杆菌多重PCR扩增反应方法,且其特异性、敏感性较好.     

我国多斑按蚊复合体成员种的分子鉴别研究

目的建立我国多斑按蚊复合体5成员种的分子鉴别方法。方法测定并分析各成员种的rDNA-ITS2序列,并设计种特异引物,应用PCR法鉴别。结果多斑按蚊复合体5成员种的ITS2序列长度和GC含量分别为伪威氏按蚊328bp、58.54％、多斑按蚊330bp、57.85％、威氏按蚊337bp、59.05％、达罗毗按蚊334bp、58.68％和塞沃按蚊338bp、57.69％,各种内的ITS2序列保守,而种间的差异率范围为9.7％～18.9％。应用5.8S引物和5个种特异引物可以分别扩增出119、186、231、327和406bp等5条清晰不同的种特异条带,以鉴别各蚊种。结论基于ITS2序列差异建立的我国多斑按蚊复合体5成员种的PCR鉴别简便易行、可靠。     

复合PCR检测医学常见重要真菌的研究

目的　建立复合PCR用于快速检测白念珠菌和非白念珠菌医学真菌。方法　设计白念珠菌特异引物用于扩增白念珠菌DNA ;11种医学真菌 (白念珠菌、热带念珠菌、假热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、解脂念珠菌、克鲁斯念珠菌、季也蒙念珠菌、新型隐球菌、烟曲霉和黄曲霉 )的DNA用医学真菌通用引物扩增 ;建立由上述两组引物组成的复合PCR ,在一次试验中区分白念珠菌和非白念珠菌真菌。结果　白念珠菌引物只特异扩增白念珠菌DNA ,扩增产物为 779bp ;通用引物扩增上述 11种医学真菌DNA ,扩增产物为 2 6 0bp左右。 12种常见致病细菌、乙肝病毒及人血液白细胞和组织细胞DNA均不被这两种引物扩增。复合PCR扩增白念珠菌DNA产生两条DNA片段 ,其长度分别为 779bp和 2 5 8bp ;非白念珠菌DNA只产生一条 2 6 0bp左右的片段。结论　复合PCR可在一次试验中检出白念珠菌和非白念珠菌 ,因此 ,复合PCR对于医学真菌的检测是一种较快速、敏感和特异的方法。