基于toxR基因的PCR检测副溶血性弧菌的方法建立

目的建立基于toxR基因的PCR检测副溶血弧菌的方法,并通过实验条件摸索,优化反应体系条件,验证PCR方法检测副溶血弧菌的优势。方法应用基于toxR基因的环引物PCR法和已报道的PCR法对副溶血性弧菌和食品样品进行检测,并优化反应条件。对两种检测方法的灵敏度、特异度和检测时间进行比较。结果环引物PCR法可以使副溶血性弧菌扩增出大小180 bp的toxR基因片段,两种方法检测副溶血性弧菌的特异度均为100%,检出限分别为4×103CFU/mL和5×104CFU/mL,检测所需时间分别为2 h 50 min和3 h10 min。结论基于toxR基因的环引物PCR法检测副溶血性弧菌的特异性更强,检出限更低,检测所需时间更短,能够较好地满足卫生防疫机构快速检测副溶血性弧菌的需要。     

TaqMan探针双重荧光PCR法检测副溶血性弧菌毒力基因

目的建立同时检测副溶血性弧菌毒力基因tdh和trh的双重荧光PCR方法。方法筛选副溶血性弧菌tdh和trh毒力基因的特异性引物和探针,建立基于TaqMan探针双重荧光PCR扩增体系,进行特异性、灵敏度实验,并对本实验室保存的54株副溶血性弧菌进行tdh、trh毒力基因的检测,以了解不同来源的副溶血性弧菌携带毒力基因的状况。结果建立的双重荧光PCR方法特异度强(100%),最低检测浓度达到20 cfu/ml,对本实验室保存的副溶血性弧菌进行毒力基因的检测结果显示,从临床分离的10株副溶血性弧菌和海产品样品中分离的1株副溶血性弧菌均为tdh扩增阳性,trh扩增阴性。结论所建立的方法特异性好,灵敏度高,适用于副溶血性弧菌的毒力基因检测。     

荧光PCR检测副溶血性弧菌

[目的]建立荧光PCR检测副溶血性弧菌的快速方法。[方法]根据基因库公布的副溶血性弧菌的耐热直接溶血素基因（TDH）的保守序列,设计一对引物,用FAM荧光剂标记探针的5＇,进行特异性和灵敏性分析,使用于食物中毒样品的快速检测。[结果]检测灵敏度为170.8fg/μl,菌液的灵敏度为30~70cfu/ml。用此反应体系检测53株副溶血性弧菌均出现特异的荧光信号,未见与其它试验种属细菌交叉。对3起食物中毒样品45份用荧光PCR法和国标法检测副溶血性弧菌,荧光PCR检测阳性22份,国标法阳性20份。荧光PCR检测从样品处理到结果只需8h。[结论]荧光PCR检测副溶血性弧菌灵敏度高、特异性强、简便快速,可用于副溶血性弧菌引起食物中毒的快速诊断和海产品副溶血性弧菌的快速检测。     

副溶血性弧菌的免疫捕获PCR检测

目的:将免疫捕获PCR法应用于副溶血性弧菌检测。方法:将脱毒后的副溶血性弧菌作为抗原免疫家兔,得到抗血清包被PCR管,对待检的副溶血弧菌进行免疫捕获,利用捕获到的菌体作为模板进行PCR检测。结果:PCR体系对副溶血性弧菌的tlh基因扩增具有特异性;抗体对副溶血弧菌起到一定程度的富集作用,包被抗血清后使PCR扩增出来的阳性结果更为明显,而抗血清本身没有扩增出DNA条带。结论:该检测方法能够对副溶血性弧菌进行特异性的检测,同时包被抗体的捕获对提高检测灵敏度起到一定的作用。     

实时荧光定量PCR联合检测诺如病毒和副溶血性弧菌的方法建立与应用

目的建立实时荧光定量PCR法联合检测诺如病毒和副溶血性弧菌的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒和副溶血性弧菌tlh基因设计特异性引物。通过调整引物浓度和优化反应条件,建立多重荧光定量PCR检测体系,对方法的灵敏度和特异性进行验证。结果多重荧光定量PCR检测方法对诺如病毒、副溶血性弧菌、轮状病毒、沙门菌、志贺菌、大肠杆菌O157等样本进行检测,未发生交叉反应。结论本研究建立的实时荧光定量PCR法同时检测诺如病毒和副溶血性弧菌灵敏度高、特异性好,能用于食品携带病原微生物和感染性腹泻暴发中诺如病毒和副溶血性弧菌的检测。     

055 副溶血性弧菌溶血素基因及其检测的研究进展

副溶血性弧菌是一种重要的食源性致病菌，可引起急性胃肠炎和原发性败血症。副溶血性弧菌能够产生3类溶血素，包括不耐热溶血素（TLH）、耐热直接溶血素（TDH）和TDH相关溶血素（TRH）。TLH、TDH和TRH分别由tlh、tdh和trh基因编码。副溶血性弧菌溶血素基因的检测通常采用PCR和核酸杂交，复合PCR和实时荧光定量PCR是未来检测技术应用的趋势。     

环介导等温扩增技术检测副溶血性弧菌的优势

目的 建立一种利用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术快速检测副溶血性弧菌的方法.方法 采用LAMP技术扩增副溶血性弧菌,并与实时聚合酶链反应(Real-time PCR)检测法和Vitek 32自动微生物分析鉴定方法作对比.结果 LAMP技术与Real-time PCR检测法检测结果一致,12株副溶血性弧菌得到阳性扩增结果,1株创伤弧菌得到阴性扩增结果;Vitek 32自动微生物分析鉴定方法结果为12株副溶血性弧菌和1株创伤弧菌.结论 利用LAMP技术扩增副溶血性弧菌比Real-time PCR检测法和Vitek 32自动微生物分析鉴定方法有一定优势,LAMP技术为副溶血性弧菌的检测提供了新的手段.     

多重PCR快速检测5种重要致病性弧菌

目的建立一种快速检测霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌和溶藻弧菌5种重要致病性弧菌的多重PCR方法。方法以霍乱弧菌omp W基因、副溶血性弧菌toxR基因、创伤弧菌vvh A基因、拟态弧菌VMH基因和溶藻弧菌gyr B基因为靶基因设计特异性引物,优化建立多重PCR反应体系,系统评价其特异性和检测下限值。结果成功构建致病性弧菌多重PCR检测方法。评价结果显示其特异性为100%,霍乱弧菌、副溶血性弧菌和拟态弧菌的检测下限值为100 CFU/ml,创伤弧菌和溶藻弧菌的检测下限值为1 000 CFU/ml;多重PCR的弧菌检出率明显高于传统分离培养方法(56%vs 17%)。结论该多重PCR方法快速、灵敏、特异性好,可用于海环境和水产品中致病性弧菌的监测。     

副溶血性弧菌tdh基因的分子信标PCR技术检测

目的采用分子信标PCR技术进行副溶血性弧菌tdh基因检测。方法在反应体系中加入分子信标探针。对13株副溶血性弧菌和其他细菌分别进行tdh基因实时和终点法荧光检测。结果2株副溶血性弧菌和阳性质粒的终点法检测荧光值分别为114．9，95．2，90．0。实时PCR检测的CT值分别为26．2，26．8，32．0。其他肠道细菌终点法检测荧光值为47．0～69．1；CT值〉32．0或无值，与琼脂糖电泳分析结果一致。结论分子信标PCR技术可以准确、快速、实时、简便地进行副溶血性弧菌tdh基因检测。     

副溶血性弧菌流行群特异多重PCR鉴定

目的建立适于基层单位应用的针对副溶血性弧菌流行群的特异多重PCR方法。方法查找副溶血性弧菌的基因序列,将当前流行群的序列和以往副溶血性弧菌的序列进行比较,设计针对流行群的PCR引物,并进行多重PCR扩增。结果运用群特异多重PCR法可特异性的扩增出当前流行群副溶血性弧菌的目的基因片段,可大大缩短鉴定时间。结论群特异多重PCR法能快速鉴定当前副溶血性弧菌流行群,有利于流行病学溯源等。     

应用PCR法检测沙门菌

目的 研究沙门菌的PCR检测方法.方法 引物选择沙门菌的hilA基因,应用PCR法检测沙门菌.结果 PCR能检测经选择性增菌液培养的沙门菌,扩增片段在497 bp.结论 应用PCR检测沙门菌,具有快速、特异、灵敏和简便的特点.     

PCR和毛细管电泳技术检测沙门氏菌等5种病原菌的方法研究

目的采用多重PCR技术检测结合毛细管电泳成像技术建立快速检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157的方法。方法根据沙门氏菌hilA基因、志贺氏菌ipaH基因、副溶血性弧菌TDH基因、金黄色葡萄球菌的pSa-442 Sau3AI fragment基因及大肠杆菌O157的rfbE基因设计异性特PCR引物,被检样品经4 h振荡培养后金属浴裂解制备DNA模板,使用全自动毛细管电泳核酸检测系统分析PCR扩增产物。结果在580 bp、423bp、257 bp、245 bp和194 bp处分别出现预期的特异性DNA条带,且无非特异扩增条带出现。敏感性试验显示在模拟标本中的检测灵敏度,沙门氏菌为101-2cfu/ml、志贺氏菌为101cfu/ml、副溶血性弧菌为102cfu/ml、金黄色葡萄球菌为102cfu/ml、大肠杆菌O157为101cfu/ml。结论该方法操作方便、特异性和灵敏度高、分辨率高,可同时完成5种病原菌的检测,在公共卫生突发事件中具有实用价值。     

副溶血性弧菌及其引起的食物中毒检验研究进展

在沿海地区 ,副溶血性弧菌是引起食物中毒的重要病原菌。近年来 ,由副溶血性弧菌与其它细菌混合感染引起食物中毒屡见报道 ,主要是生食或加热不彻底的熟食。 1995年以前检出频率最高的副溶血性弧菌血清型为O4 :K8,1996年以后由产生耐热的直接溶血毒素 (TDH)的O3:K6取而代之。用于副溶血性弧菌的快速检验法有噬菌体裂解法、PCR法、PFGE法。采用免疫磁株法可有效地收集、浓缩神奈川现象阳性的副溶血性弧菌 ,可显著提高环境样品及食品中病原性副溶血性弧菌的检出率     

三亚市食物中毒中人感染副溶血性弧菌的毒力基因及耐药性研究

目的 了解三亚市食物中毒中人感染副溶血性弧菌携带毒素基因及耐药性情况,为副溶血性弧菌食物中毒病人的治疗提供参考依据.方法 利用19种不同的抗生素药敏纸片,采用K-B扩散法进行耐药检测;用荧光定量PCR扩增法,以检测菌株的TDH和TRH基因.结果 经检测的30份菌株,28株携带有TDH基因,阳性率93％,所有菌株均没携带TRH基因.30份菌株对诺氟沙星、头孢曲松、氧氟沙星、头孢哌酮、庆大霉素、氯霉素、头孢克洛、氨苄青霉素、妥布霉素、环丙沙星、洛美沙星、依诺沙星、亚胺培南、萘啶酸未见有耐药株;青霉素G、苯唑西林、羧苄青霉素全部耐药;头孢噻吩、链霉素部分耐药.结论 带有TDH毒力基因是三亚市近年来引起食物中毒中人感染副溶血性弧菌主要分子流行病学特征,所分离菌株对大多数常见抗生素敏感性高.研究结果为评价引起食物中毒的副溶性弧菌的分子流行病学特征和制定可行的防控措施提供了科学依据.     

副溶血性弧菌五种致病性检测方法比较研究

目的 探索对人致病的副溶血性弧菌的检测方法,评价5种检测方法对副溶血性孤菌致病性测定的有效性.方法采用耐热溶血毒素tdh基因和耐热直接溶血毒素相关毒素trh基因实时荧光定量PCR检测、并与神奈川溶血试验、小鼠腹腔注射和灌胃法对比,分别检测分离自腹泻者和自然环境中副溶血性弧菌标本.结果两类来源的副溶血性弧菌在tdh基因的...     

国境口岸猴痘病毒实时荧光PCR检测方法的建立

〔目的〕建立快速、特异的猴痘病毒实时荧光PCR检测方法。〔方法〕制备猴痘病毒阳性样本,设计并合成相应的扩增引物及荧光标记探针,摸索最佳反应条件。〔结果〕本方法对模拟猴痘病毒样本的检测灵敏度达到102拷贝/反应。本方法快速、灵敏,并具有较高的特异性和重复性,可在3h内准确检测出猴痘病毒核酸。〔结论〕本方法适合国境口岸猴痘病毒快速检测,对防止猴痘病毒传入我国,保障我国的国境口岸卫生安全具有重要意义。     

食品中副溶血弧菌荧光定量PCR方法快速检测

目的利用荧光定量PCR技术，建立食品中副溶血弧菌污染的快速、准确的定量检测方法。方法根据副溶血弧菌gyrase基因序列设计合成副溶血弧菌FQ-PCR诊断试剂盒，研究其灵敏度、特异性，并应用于模拟食品样本检测。结果在31株不同菌株的检测中，8株副溶血弧菌结果均为阳性，而其他23株弧菌科及其他菌属的菌株均为阴性；纯菌条件下定量检测低限10cfu／ml；对模拟样本直接进行，检测低限为10^3cfu／g，经培养增菌后，检测低限则达到2cfu／g。结论该方法特异性强、敏感性高，操作简便快速，检验周期仅需36h，扩增与检测在封闭单管进行，可避免常规PCR方法易污染缺陷，具有很好的推广应用前景。     

Efficiency of real-time polymerase chain reaction assay to detect Vibrio vulnificus in seawater

The growth of Vibrio vulnificus in an enriched culture of seawater during the summer in Japan was monitored by a plating technique used as the culture method and a real-time polymerase chain reaction (PCR) assay as the molecular method. V. vulnificus was detected by the real-time PCR assay in the samples of August and September but not by the culture method. Vibrio parahaemolyticus, however, was detected among all of the samples with both the culture method and real-time PCR assay. In the analysis of the bacterial populations in enrichment culture, it was demonstrated that the growth of V. vulnificus on agar media was inhibited by the rapid growth of V. parahaemolyticus after 4h of incubation and the 100 times larger initial populations of bacteria other than V. vulnificus and V. parahaemolyticus. These findings demonstrate that V. vulnificus detection by culture methods is a failure, and molecular methods are effective and detect V. vulnificus accurately.     

应用PCR技术检测霍乱肠毒素

聚合酶链反应(PCR)是一种快速检测霍乱弧菌肠毒素(CT)的方法。用PCR法检测从水和水产品分离的8株O1群霍乱弧菌CT，结果均为阴性。CT的检测对了解水和水产品中分离株是否对公共卫生构成威胁有重要意义。O1群霍乱弧菌的霍乱肠毒素A亚单位(ctxA)基因引物也能扩增0139。     

宁波地区腹泻患者细菌性病原检测与分析

摘要：目的　了解宁波地区腹泻患者病原菌构成和耐药性,为防控感染性腹泻提供依据。方法　病原菌检
测采用直接分离与增菌分离相结合的方法;细菌筛检和鉴定采用生化和生化鉴定试剂条ＡＰＩ等法,鉴定到
种、群;病原菌血清分型采用血清凝集法;药敏试验采用Ｋ Ｂ法;耐药基因检测采用ＰＣＲ 法,统计学分析
采用ＳＰＳＳ１１．０软件包进行,率的比较采用χ
２ 检验和犉分析。结果　９２５６份标本中检出８类１６种３４７３
株病原菌,检出率为３７．５２％,其中,副溶血性弧菌、沙门菌和气单胞菌的检出率分别为１６．１３％ （１４９３／
９２５６）、３．９９％ （３６９／９２５６）和３．４４％ （３１８／９２５６）,副溶血性弧菌的检出率明显高于其他病原菌（χ
２＝
２１．６８,犘＜０．０１）;血清分型发现副溶血性弧菌的Ｏ３ 群（３４９／４８０）、沙门菌的甲型副伤寒菌（１６８／３６９）、
志贺菌的躈氏志贺菌（１１７／１７５）、致病性大肠埃希菌Ｏ１１９ （２８／６６） 为各病原菌的优势菌,检出了躈氏
１Ｃ、２Ｃ 和４Ｃ 志贺菌新亚型;药敏试验显示病原菌对大多数抗生素敏感,但有４５株为多重耐药菌,其中
气单胞菌２３株、志贺菌８株、致泻性大肠埃希菌８株、金黄色葡萄球菌３株、变形杆菌２株、沙门菌１株,
占总菌数的２．４５％,检出了犫犾犪 犜犈犕、狊狌犾犾和犪犪犮犮等３种耐药基因。结论　宁波地区感染性腹泻病原构成
复杂,副溶血性弧菌是最主要的流行病原菌;检出躈氏Ｃ 型志贺菌提示其血清型可能或正在转换,需加强
对志贺菌变迁的监测,以预防疾病的暴发;致病性不强的气单胞菌和类志贺邻单胞菌检出率较高,应引起
关注;耐药菌株中有２．４５％的病原菌为超广谱β 内酰胺酶（ＥＳＢＬ） 菌株,涉及多个菌属,提示临床治疗
中合理用药是减少耐药菌的传播和扩散的关键。
关键词：感染性腹泻;病原菌;分离鉴定;药敏
中图分类号：Ｒ５１２．５　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００９ ６６３９ （２０１４）０２ ００９６ ０６