表皮干细胞增殖分化的调控机制

表皮干细胞是皮肤组织的特异性干细胞，具有自我更新和强大的增殖潜能，被认为是皮肤组织工程理想的种子细胞。表皮干细胞增殖与分化调控确切机制目前尚不清楚。现有研究主要集中在MAPK、Wnt、Notch、骨形态发生蛋白等信号转导通路上，通过信号转导通路的激活，引起与细胞增殖分化相关基因的表达，以调控表皮干细胞的增殖分化。近来有研究显示端粒酶活性的丧失及其增殖相关基因表达的改变可能是造成表皮干细胞体外复制和扩增受限的主要原因。表皮干细胞的研究已引起越来越多研究者的关注，目前已广泛应用于组织修复的实验及临床研究，展现出良好的应用前景。     

大鼠气管干细胞增殖分化过程中Wnt／β-Catenin信号分子的表达

背景；干细胞和细胞外基质的互相作用需要Wnt信号途径的参与。在气管损伤后的修复过程中，不同的分子信号级联控制干细胞的迁移、增生与分化，Wnt信号途径是否参与其中？目的：检测并验证Wntβ-Catenin信号途径在气管干细胞增殖分化中的作用。 设计、时间及地点：单一样本观察实验，于2004—05／2006—07在沈阳医学院完成。 材料：2周龄Wistar大鼠，雌雄不拘，作为离体气管来源。 方法：实验组以含氟尿嘧啶的Hams F12培养液作用离体大鼠气管，作用12h后换成单纯Hams F12液，对照组只用Hams F12液培养。 主要观察指标：去除氟尿嘧啶后于0，6，12，24，48h采用免疫组织化学SP染色及蛋白印迹法检测气管上皮中Wnt—1和β-Catenin的表达。 结果：氟尿嘧啶作用12h后，大鼠气管上皮细胞绝大部分脱落，暴露出基底膜，仅剩余少数较分散的间隔分布的近于裸核的细胞，呈钉状位于基底膜上。氟尿嘧啶去除6h后，气管基底膜上可见少量扁平样细胞。24h后基底膜上细胞数目增加，并逐渐分化呈立方状，连接成片。48h后气管上皮中出现假复层柱状上皮，并可见纤毛细胞。免疫组织化学及蛋白定量结果显示：正常及损伤后0h气管上皮极少量表达Wnt-1及β-Catenin，损伤后6hWnt-1及β-Catenin表达最强，其后随时间延长，表达逐渐减少。 结论：Wnt-1时间依赖性表达与气管上皮损伤修复进程相吻合，胞浆中游离状态的β-Catenin表达可能产生了促进气管干细胞的增殖并抑制其分化的作用。     

小肠干细胞增殖分化调节机制的研究进展

小肠干细胞(stem cell,SC)是位于小肠黏膜隐窝底部、潘氏细胞上面的未分化细胞.它以对称分裂和不对称分裂两种方式来维持隐窝内稳定的干细胞数量 ,并通过短暂扩增细胞(TAC)增殖分化成5种不同表型的终末细胞,即潘氏细胞、杯状细胞、内分泌细胞、肠吸收细胞和M细胞[1].众所周知,小肠黏膜是哺乳动物更新最快的组织,然而其癌变发生率最低.因此,国内外许多学者对调节小肠干细胞增殖分化的相关因子,细胞外基质和其凋亡机制做了大量研究,现就此作一综述.     

Hes-1在人脑胶质瘤干细胞分化过程中的动态表达及意义

目的研究在体外培养的人脑胶质瘤干细胞诱导分化过程中Hes-1蛋白表达的动态变化。方法对体外培养的人脑胶质瘤干细胞进行诱导分化,于未分化、分化第3、7d收集标本,行Hes-1蛋白免疫荧光染色后流式细胞术检测标本中阳性细胞比例;Hes-1分别与CD133、GFAP、MAP2、MBP蛋白双标免疫荧光染色后,激光共聚焦显微镜下观察Hes-1蛋白表达强度及细胞类型的变化。结果随着人脑胶质瘤干细胞的分化,Hes-1蛋白阳性细胞比例由未分化至分化第3d、第7d有明显下降（P〈0.01）;Hes-1蛋白在CD133、MAP2、GFAP和MBP阳性细胞均可表达,但在较幼稚的细胞中表达较强,随着细胞分化成熟,其表达明显减弱,分化第7d时大部分分化成熟的肿瘤细胞（MAP2、GFAP和MBP阳性细胞）中表达极弱或不表达。结论随着人脑胶质瘤干细胞的分化,Hes-1蛋白表达的阳性细胞比例和强度均明显下降,提示Hes-1表达的动态变化可能与调控人脑胶质瘤干细胞的分化过程有关。     

阿魏酸钠调控JAK2/STAT3信号通路对胶质瘤细胞增殖、侵袭、凋亡的影响

目的 探究阿魏酸钠调控JAK2/STAT3信号通路对胶质瘤细胞增殖、侵袭、凋亡的影响.方法 胶质瘤细胞系U251经过培养、干预分为阿魏酸钠低浓度组、中浓度组、高浓度组和空白组、阴性对照组.在培养72 h后观察细胞生物学行为,并检测细胞JAK2/STAT3通路蛋白表达情况.结果 阿魏酸钠LC50=0.3075 mg/mL...     

Wnt信号通路在大鼠气管干细胞增殖分化过程中的时空表达

背景:实验前期项目己协同有关人员创立了体外观察气管干细胞的模型,并解决了气管干细胞的定位、分离及性状分析.但在气管干细胞的增殖分化过程中,究竟有哪些基因参与及其各自作用、气管干细胞可产生功能细胞的分化程序至今仍不清楚.目的:利用氟尿嘧啶诱发离体气管上皮损伤,检测气管干细胞增殖分化损伤重建过程中Wnt信号途径成员的时空表达变化.设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-06/2007-06在沈阳医学院中心实验室完成.材料:清洁级2周龄Wistar大鼠18只,用于制备离体气管环.氟尿嘧啶由天津人民制药厂生产.方法:将镜下观察纤毛摆动情况良好的气管环分为两组:损伤组将气管环置于含12.5mg/L氟尿嘧啶的HamsF-12液中,作用12h后去除氟尿啼啶,换成新鲜的HamsF-12液继续培养,分别于3,6,12,24,48h取部分等量组织块.对照组用等体积HamsF-12液代替氟尿嘧啶,其余培养条件及取材时间同损伤组.主要观察指标:RT-PCR法检测气管上皮中Wnt-1、β-连环蛋白、T细胞因子、c-myc基因表达的变化.结果:氟尿嘧啶作用12h后,光镜下可见少数间隔分布、近于裸核的细胞,呈钉状位于基底膜上,前期实验己证明其为气管干细胞.RT-PCR结果显示,对照组气管上皮无Wnt-1和T细胞因子mRNA的表达,β-连环蛋白与c-myc mRNA轻度表达.损伤组经氟尿嘧啶作用后,可检测到Wnt-1 mRNA的表达,β-连环蛋白mRNA一时性轻度下降:Wnt-1、β-连环蛋白、T细胞因子、c-myc mRNA分别于去除氟尿嘧啶后3,6,12h达到高峰;24h后三者mRNA表达水平均下调:至48h Wnt-1 mRNA无表达,后三者mRNA少量表达.结论:在整个气管上皮重建过程中,Wntl、β-连环蛋白、T细胞因子和c-myc mRNA的表达变化基本遵循相似的规律,提示Wnt信号通路作为一个整体参与气管干细胞增殖分化过程的调控.     

多聚赖氨酸和明胶对神经干细胞增殖和分化的影响

背景:目前大鼠神经干细胞体外诱导分化的研究报道诸多,但其分化过程很难控制,很多实验的操作方法复杂,分化比率也很低.目的:探索大鼠胚胎前脑神经干细胞体外原代及传代培养方法,并观察其分化规律.方法:胎鼠在无菌条件下分离出前脑,制备单细胞悬液,以1×1011L-1接种于含N2的DMEM/F12培养基中培养,传代培养过程中加入BrdU,标记神经干细胞球.诱导分化实验分为多聚赖氨酸铺板组、明胶铺板组和无铺板组.采用体积分数20%胎牛血清刺激其分化.免疫细胞化学检测nestin、BrdU及在血清诱导条件下神经干细胞向神经细胞分化的能力.结果与结论:细胞呈神经干细胞样生长,具有连续增殖能力,可以传代培养.传代神经球中的细胞均呈nestin阳性和BrdU阳性.多聚赖氨酸铺板组和明胶铺板组贴壁后分化为神经细胞能力强于无铺板组(P < 0.01).多聚赖氨酸铺板组略强于明胶铺板组(P > 0.05).神经谱系标记物神经胶质纤维酸性蛋白和微管相关蛋白2的免疫细胞化学结果均阳性.结果表明,大鼠胚胎前脑富含神经干细胞,其分化观察,多聚赖氨酸和明胶在诱导神经干细胞分化中作为细胞贴壁支持物提高分化细胞数量的作用,且多分化为星形胶质细胞.     

细胞毒药物对小鼠肺组织和骨组织间充质干细胞增殖和分化的影响

背景:肿瘤患者接受高剂量化疗时,细胞毒药物不仅对肿瘤细胞产生杀伤作用,对正常组织细胞甚至组织干细胞也产生一定损伤.目的:探讨细胞毒药物体外对小鼠肺组织间充质干细胞和骨组织间充质干细胞增殖及分化能力的影响.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-05/2008-08在解放军军事医学科学院基础医学研究所细胞生物学室和解放军北京军区总医院肿瘤科完成.材料:清洁级3～5周龄C57BL/6小鼠3只,由解放军军事医学科学院实验动物中心提供.方法:从胶原酶消化的小鼠肺组织和骨片中分离培葬肺组织间充质干细胞和骨组织间充质干细胞,并在含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液中培养、传代、扩增.采用MTT法测定马利兰、阿霉素、环磷酰胺、足叶乙甙,甲氨蝶呤、长春新碱、顺铂对两种间充质干细胞生长增殖的影响,参照文献设置药物浓度范围,并设立窄白对照,仅加入含体积分数为10%胎生血清的α-MEM培养液.药物作用后,分别诱导两种间充质干细胞向脂肪和成骨细胞分化.主要观察指标:不同药物作用后,肺组织间充质干细胞和骨组织间充质干细胞的生长抑制、增殖情况及分化能力.结果:①在治疗剂量范围内,肺组织间充质干细胞和骨组织间充质干细胞对环磷酰胺、马利兰和甲氨蝶呤耐受,而对长春新碱、足叶乙甙、顺铂、阿霉索中度敏感.肺组织间充质干细胞和骨组织间充质干细胞对环磷酰胺、马利兰的敏感性相似,但小鼠肺组织间充质干细胞对甲氨蝶岭、长春新碱、足叶乙甙、阿霉素的敏感性均低于骨组织间充质干细胞,对顺铂的敏感性高于骨组织间充质干细胞.②与空白对照比较,环磷酰胺、马利兰和甲氨蝶呤作用后对两种间充质干细胞的增殖能力影响较小.⑨在环磷酰胺、马利兰、甲氨蝶呤、长春新碱和足叶乙甙等约物作用24 h内,两种间充质干细胞仍能被诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞.药物作用72 h后,两种间充质干细胞向脂肪和成骨细胞的分化能力减弱甚至消失.环磷酰胺、马利兰和甲氨蝶呤对肺组织间充质干细胞和骨组织间充质干细胞的分化功能影响相对较小.结论:细胞毒药物对小鼠肺组织间充质干细胞和骨组织间充质干细胞具有毒性作用,但不同组织器官来源的间充质干细胞对细胞毒药物的敏感性存在一定差异;药物作用后可影响两种间充质干细胞的增殖和分化能力.     

骨髓间充质干细胞成骨分化过程中关键信号通路的调控作用

利用组织工程技术在人体内形成稳定的组织工程化骨组织并修复骨缺损,克服了传统方法中的不足,有望真正实现骨组织再生和功能重建［1］。种子细胞是组织工程研究中最基本,也是首要的环节。骨髓间充质干细胞（BMSCs）是一种未充分分化的类中胚层细胞,可在一定条件下定向分化为成骨细胞。作为骨组织工程的种子细胞之一,具有取材方便、对机体损伤小、免疫源性小等优点。已有的分子和遗传学研究表明,BMSCs 成骨分化及成骨细胞分化成熟及矿化过程中,多种信号通路参与调节,并最终汇聚到成骨细胞的骨特异性转录因子 Runx2／Cbfa1,影响Runx2／Cbfa1的转录和成骨分化。本文结合国内外研究成果,对与BMSCs 成骨分化和成骨细胞分化、成熟有着密切关系的信号通路的研究现状进行回顾。     

血小板微粒对神经干细胞增殖和分化的影响

背景:血小板微粒是血小板在活化过程中释放的小的亚细胞碎片,在血管新生和缺血组织新生中发挥作用。目的:观察血小板微粒对神经干细胞增殖、存活和分化的影响。方法:取胎龄13.5d的小鼠获取鼠胚胎神经干细胞,分别应用10μg/L成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子或者0.1,1,10μg的血小板微粒进行处理观察神经球的大小及细胞转归。结果与结论:与单独应用成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子干预的神经干细胞相比,经血小板微粒处理的神经干细胞神经球直径明显增大,存活率明显增高。且血小板微粒可促进神经干细胞向胶质细胞和神经元分化。说明血小板微粒同其他生长因子一样均能促进神经干细胞的增殖、存活和分化,且效果优于生长因子单独应用。     

骨髓间充质干细胞成脂和成骨分化过程中Wnt信号通路的调控效应

背景:骨髓间充质干细胞的成脂肪分化与成骨分化比例的失衡与许多骨疾病密切相关,而近些年发现Wnt信号通路在调控骨髓间充质干细胞的分化方向中起重要作用.目的:通过Wnt信号通路PCR基因芯片观察大鼠骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞和成骨细胞后相关基因表达的变化,寻找Wnt信号通路中调控骨髓间充质干细胞分化的靶基因.方法:采用大鼠第3代骨髓间充质干细胞分别进行成骨诱导和成脂诱导,7 d后用Trizol萃取培养瓶中的细胞总RNA,倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态特征及成骨诱导后和成脂诱导后细胞形态特征.采用Wnt信号通路PCR芯片(大鼠)进行摹因芯片检测,以未诱导组为对照,计算成脂肪诱导,成骨诱导后相关基因上调/下调的比值.结果与结论:①倒置显微镜下观察,传3代后可获得均一性较高的骨髓间充质干细胞,骨髓间充质干细胞经成骨诱导后向成骨细胞方向分化,经成脂诱导后向脂肪细胞方向分化.②与未诱导组相比,骨髓间充质干细胞成脂诱导后Wnt信号通路表达上调的基因(Dkk-1,kremen,FZD1,FZD7)等15个(ratio＞2),下调的基因(sFrp 5,β-catenin,Dvl3,Tcf7)等16个(ratio＜0.5).成骨诱导后,Wnt信号通路表达上调的基因(Dkk1,kmmen,β-catenin,Wnt11)6个,表达下调的基因(sFrp5,sFRP4,Fzd1)等15个.提示WnI信号通路在骨髓间克质干细胞成脂细胞分化和成骨细胞分化中发挥重要作用.     

电磁场激活细胞外信号调节激酶通络在骨髓间充质干细胞增殖与分化成骨中的作用

目的探讨电磁场作用于大鼠骨髓间充质干细胞对细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路的影响，并进一步研究电磁场诱导所致ERK信号通路变化在骨髓间充质干细胞增殖与分化成骨中的作用。 方法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞，取第3代细胞，分为对照组、暴磁组、PD98059组和PD98059+暴磁组。采用Western blotting法检测ERK通路的活性变化，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测各组细胞的增殖活性，按照碱性磷酸酶（ALP）试剂盒说明书步骤检测各组细胞ALP活性。 结果①暴磁后5 min，ERK1/2磷酸化水平即明显高于对照组，1 h后仍处于较高水平（P<0.01）；PD98059作用可明显抑制ERK1/2磷酸化水平的升高，提示PD98059可有效阻断ERK通路的激活。②MTT法检测结果提示，暴磁后细胞的增殖活性明显升高，PD98059可明显抑制这种效应。③暴磁组ALP活性明显高于对照组，PD98059+暴磁组ALP活性较暴磁组高（P<0.01），差异有统计学意义。 结论在15 Hz、1 mT的正弦波电磁场作用下，骨髓间充质干细胞ERK信号通路很快被激活，引起细胞增殖活性和ALP活性的改变，这为进一步研究磁场对骨髓间充质干细胞的促增殖和分化成骨机制提供了指导意义。     

NOB1影响胶质瘤细胞增殖、凋亡的实验研究

目的 利用RNA干扰（RNAi）在人胶质瘤U251和U87-MG细胞中沉默NOB1基因的表达,探讨NOB1对恶性胶质瘤细胞增殖以及凋亡的影响.方法 构建NOB1基因的短发卡（shRNA）慢病毒表达载体,包装成病毒颗粒并感染人胶质瘤U251和U87-MG细胞,采用实时定量聚合酶链反应检测NOB1在恶性胶质瘤细胞系中的表达.采用甲基噻唑基四唑（MTT）比色法和克隆形成实验检测细胞增殖和克隆形成能力情况;同时利用PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡情况,观察NOB1基因对U251和U87-MG细胞增殖、凋亡的影响.结果 NOB1基因在人胶质瘤U251、U87-MG细胞系中均明显高表达.NOB1-shRNA慢病毒能有效感染胶质瘤细胞,实验结果显示感染后U251和U87-MG细胞的增殖能力明显下降;U251克隆形成能力明显受到抑制;细胞周期在G0/G1停滞,而且细胞出现显著性凋亡;上述差异均具有统计学意义（P＜0.05）.结论 NOB1在人胶质瘤U251和U87-MG细胞中高表达;降低NOB1基因的表达,可以显著降低胶质瘤细胞的增殖,并促进胶质瘤细胞凋亡;NOB1基因在体外对胶质瘤细胞的发生发展可能具有癌基因的调节作用.     

汉黄芩素及其抑制物细胞周期蛋白依赖性激酶1对人脑胶质瘤干细胞作用机制的研究

目的研究汉黄芩素及其抑制剂细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）对人脑胶质瘤干细胞（BGSCs）的作用机制。方法使用不同浓度的汉黄芩素（1、10、1000μmol/L）对BGSCs进行浸染,并设空白对照组。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测汉黄芩素对BGSCs增殖的影响;采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测CDK1 mRNA表达;同时检测脂质过氧化产物还原型谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量的变化。结果汉黄芩素对人BGSCs增殖具有明显的抑制作用,各剂量汉黄芩素组BGSCs增殖〔吸光度（A）值〕较空白对照组明显降低,随给药浓度增加,细胞生长抑制率（IR）较空白对照组逐渐增加,以汉黄芩素100μmol/L组作用更显著〔A值：0.18±0.02比0.67±0.03,IR：（64.43±0.04）%比0,均P＜0.05〕;各剂量汉黄芩素组CDK1 mRNA表达（A值）均较空白对照组有不同程度的提高,在10μmol/L、100μmol/L汉黄芩素组出现显著提高（0.378±0.061、0.733±0.081比0.125±0.019,均P＜0.05）;脂质过氧化产物GSH （mg/g）、SOD（U/g）和MDA（nmol/g）在各个剂量汉黄芩素组与空白对照组比较差异均无统计学意义（GSH：474.51±38.63、479.67±15.89、481.17±36.41比487.00±28.53,SOD：26.58±2.26、26.75±1.96、27.08±1.52比27.31±1.89,MDA：4.92±0.45、4.72±0.73、4.61±0.47比4.45±0.26,均P＞0.05）。结论 CDK1可能参与汉黄芩素抑制人BGSCs生长的作用机制,该作用与脂质过氧化产物无关。     

海人酸对神经干细胞增殖及分化的影响

背景：神经干细胞对脑组织的修复作用非常有限,约80％新增殖的内源性神经干细胞在6周内死亡,仅0．2％的细胞继续增殖、分化,参与修复。目的：分析不同剂量海人酸在对神经干细胞增殖及分化的影响。方法：体外分离并培养新生Wistar大鼠神经干细胞,将神经干细胞分为空白对照组和加入不同浓度梯度的海人酸组,通过免疫组化法和免疫荧光法进行鉴定,MTT比色法测定海人酸对神经干细胞分化的影响,计算分化后神经元和星形胶质细胞比例。结果与结论：海人酸组贴壁的神经球分化速度较空白对照组快,在同一时间点进行观察,神经细胞的迁移距离较未处理组远。分化5d后,海人酸组所分化的细胞中,星状细胞较空白对照组多,而神经元样细胞相对较少,培养的细胞具有自我更新和向神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞分化的潜能。兴奋性氨基酸海人酸可使部分神经干细胞死亡,但可促进幸存的神经干细胞增殖及分化,并诱导其向星形胶质细胞分化。     

人参皂苷Rb1、Rg1对胎鼠体外神经干细胞促增殖分化作用的研究

目的:探索人参皂苷Rb1、Rg1不同浓度对体外培养神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖和分化的影响。方法:对胎鼠大脑皮质源性NSCs进行体外培养、鉴定;用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U)掺入法测定不同浓度的人参皂苷Rb1、Rg1及对照组(空白组)对NSCs增殖的影响,通过计算Brd U/DAPI比值,确定其促增殖的适宜浓度;荧光免疫细胞化学技术检测各组Tuj1、GFAP及DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)的表达,计算Tuj1/DAPI、GFAP/DAPI百分比,比较人参皂苷Rb1、Rg1对NSCs分化为神经元和神经胶质细胞的效率。结果:(1)所培养的细胞经鉴定为NSCs后,增殖实验中除人参皂苷0.1μmol/L Rg1(P0.05)外,其余各组Rg1和Rb1的Brd U/DAPI比值均显著性增加(P0.05),Rb1和Rg1均能促进体外培养的NSCs增殖,其适宜浓度Rb1、Rg1分别为1μmol/L、10μmol/L。(2)人参皂苷Rb1(10μmol/L)组GFAP/DAPI百分比与对照组相比显著增高(P0.05),而人参皂苷Rg1组GFAP/DAPI百分比及两种人参皂苷Tuj1/DAPI比值与对照组相比无显著性差异(P0.05)。结论:人参皂苷Rg1、Rb1在一定浓度范围内可促进体外NSCs增殖。Rb1能促进NSCs分化为星形胶质细胞。