NF-κB结合位点突变对人NOD2基因启动子调控的影响

探讨NF-κB结合位点突变对人NOD2基因启动子调控的影响。采用PCR技术从人基因组DNA中扩增含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子序列,并定向克隆入已切除启动子的表达载体pEGFP-N3中,构建含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白(green fluorescent proteins,GFP)载体pEGFP-N3-NOD2wt,并构建NF-κB结合位点2个碱基缺失突变的载体,将构建的重组质粒瞬时转染HEK293细胞,在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果显示重组质粒转染HEK293细胞后,在倒置荧光显微镜下均能看到绿色荧光,其中pEGFP-N3-NOD2wt重组质粒在HEK293细胞中荧光表达较强,而突变质粒mpEGFP-N3-NOD2荧光强度明显减弱。说明NF-κB结合位点是驱动NOD2基因转录的重要元件,且在NOD2基因启动子的调控中发挥了正调节作用,为进一步研究NOD2基因表达及调控机制提供了新的思路。     

人NOD2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体的构建

人NOD2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体的构建。以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有人NOD2基因启动子不同长度的4段序列,利用特定的限制性内切酶位点,以切除启动子的pEGFP-N3作为框架结构,将这4个序列片段进行酶切并插入表达载体pEGFP-N3中,用Vsp I和Pst I双酶切和PCR鉴定重组质粒,再将重组质粒进行DNA序列分析。构建的重组质粒经脂质体LipofectamineTM2000介导转染HTK293T细胞,转染24 h后加入TNF-α持续刺激细胞24 h或不加TNF-α刺激,在倒置荧光显微镜下观察其能否在NOD2基因启动子的调控下表达报告基因绿色荧光蛋白(green fluores-cent proteins,GFP)。结果:pEGFP-N3-NOD2(617 bp)、pEGFP-N3-NOD2(747 bp)、pEGFP-N3-NOD2(1 136 bp)、pEG-FP-N3-NOD2(1 387 bp)分别经酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,构建的4段重组质粒pEGFP-N3-NOD2(617 bp)、pEGFP-N3-NOD2(747 bp)、pEGFP-N3-NOD2(1 136 bp)、pEGFP-N3-NOD2(1 387 bp)转染的HTK293T均能表达绿色荧光,其中构建pEGFP-N3-NOD2(1 387 bp)重组质粒经TNF-α持续刺后激绿色荧光表达最强。4段不同长度的人NOD2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体成功构建,这为进一步研究NOD2基因表达及调控机制奠定了良好的基础。     

P53结合位点对人 NOD8 基因的调控

目的: 探讨P53结合位点在 NOD8 基因调控中的作用。方法: 利用生物信息学方法,我们发现人与黑猩猩的 NOD8 基因核心启动子区域相似位置含有P53结合位点;以人基因组DNA为模板, PCR扩增含有人 NOD8 基因序列,构建含有/缺失人P53结合位点的 NOD8 基因启动子驱动的、表达绿色荧光蛋白-NOD8融合蛋白的质粒p NOD8 (760 bp)-EGFP- NOD8 和mp NOD8 (750 bp)-EGFP- NOD8 ;将构建的重组质粒经阳离子聚合物JetPei^TM介导瞬时转染HEK293细胞中,并加入不同浓度的P53抑制剂pifithrin alpha(PFT-α)处理HEK293细胞,用RT-PCR和Westren blotting 方法检测NOD8 mRNA和蛋白的表达;此外,用p NOD8 (760 bp)-EGFP质粒转染HEK293细胞,利用染色质免疫共沉淀法(ChIP)观察P53是否与 NOD8 启动子结合。结果: 经酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功。ChIP实验证实P53能与 NOD8 启动子结合。 p NOD8 (760 bp)-EGFP- NOD8 转染组中NOD8 mRNA的表达显著高于pEGFP-C2转染组(P＜0.05),并且NOD8 mRNA 在缺失人P53结合位点的mp NOD8 (750 bp)-EGFP- NOD8 转染组中的表达明显降低(P＜0.01);同时发现加入 PFT-α的p NOD8 (760 bp)-EGFP- NOD8 转染组NOD8 mRNA的表达显著下降,并呈剂量依赖关系,其中90 μmol/L PFT-α 对NOD8 mRNA表达的抑制作用最为显著(P＜0.01)。与mRNA检测结果一致的是p NOD8 (760 bp)-EGFP- NOD8 转染组NOD8蛋白的表达量显著高于对照组pEGFP-C2; 而mp NOD8 (750 bp)-EGFP- NOD8 转染组NOD8蛋白的表达量明显低于p NOD8 (760 bp)-EGFP- NOD8 转染组和加入 PFT-α的p NOD8 (760 bp)-EGFP- NOD8 转染组(P＜0.01)。结论: P53结合位点在 NOD8 基因调控中起着重要的作用,并且P53结合位点与 NOD8 基因之间可能存在正反馈调节。     

P3启动子调控融合基因质粒构建及在肝癌细胞中表达(英文)

目的：构建人胰岛素样生长因子Ⅱ基因（IGF-Ⅱ）P3启动子驱动单纯疱疹病毒胸苷激酶（tk）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合基因穿梭质粒，观察其在肝癌细胞系HepG2及宫颈癌细胞系HeLa细胞中的表达及其作用。方法：应用基因重组技术，构建IGF-Ⅱ P3启动子驱动EGFP与tk融合表达穿梭质粒载体，脂质体转染技术将其转入HepG2及HeLa中，48 h后荧光显微镜下观察荧光表达,RT-PCR法检测tk和EGFP mRNA表达，四甲基偶氮唑蓝（MTT）实验检测转染融合蛋白载体后给予不同浓度的GCV对HepG2及HeLa细胞毒作用。结果:酶切鉴定和测序分析证实重组质粒构建成功；转染此穿梭质粒的细胞中仅有HepG2细胞检测到绿色荧光；RT-PCR检测到tk和EGFP的mRNA仅在HepG2细胞中表达；GCV对转染了携此质粒载体的HepG2细胞有选择性细胞毒作用。结论:成功构建IGF-Ⅱ P3启动子驱动携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体，转染后对人肝癌细胞系HepG2有选择性杀伤作用，为进一步靶向性肝癌腺病毒基因治疗奠定了基础。     

BRCA2基因启动子的克隆和分析

目的构建BRCA2基因启动子的荧光素酶报告质粒,为BRCA2基因调控研究提供基础。方法采用高保真Taq聚合酶,从正常人外周血中扩增出BRCA2启动子并将其插入质粒中。通过基于PCR的定点突变方法在多态性位点rs3092989(-254A/G)获得含-254G等位基因的序列。亚克隆BRCA2启动子片段至pGL3-basic报告基因载体中,构建含BRCA2启动子的重组报告质粒。转染HeLa细胞,评价启动子活性以及-254A/G多态性位点对活性的影响。结果酶切和直接测序法证实所构建质粒含有pGL3-basic及BRCA2基因启动子序列,扩增的含-254A和-254G的BRCA2启动子序列正确。构建的报告基因具有启动子活性,与pGL3-basic质粒相比较,BRCA2启动子的相对荧光单位增加了413倍。rs3092989(-254A/G)多态位点未明显影响启动子活性。结论 BRCA2转录起始位点上游序列具有较强的启动子活性。成功克隆BRCA2启动子并引入相关突变,可为后续的基因转录调控研究奠定基础。     

人RUVBL2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建带有绿色荧光蛋白的RUVBL2真核表达载体pEGFP-N1-RUVBL2,并鉴定其在HeLa细胞中的表达。方法:以pGADT7-RUVBL2质粒为模板,PCR扩增RUVBL2基因,首先克隆至T载体中,进一步亚克隆至p-EGFP-N1,并对重组表达载体进行酶切及测序鉴定。采用脂质体转染法将重组质粒瞬时转染HeLa细胞系,应用荧光显微镜观察绿色荧光融合蛋白的表达,并用Western blot法检测RUVBL2-GFP融合蛋白的表达。结果:经限制性酶切鉴定及测序分析证实pEGFP-N1-RUVBL2载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的HeLa细胞中有绿色荧光蛋白的表达,Western blot法证实转染细胞中能表达RUVBL2-GFP融合蛋白。结论:pEGFP-N1-RU-VBL2表达载体构建成功,并在HeLa细胞内成功表达。     

顺式调控元件NF-κB在尼古丁诱导ICAM-1表达中的作用

目的: 研究5' 上游序列在尼古丁诱导细胞间粘附分子-1(ICAM-1)基因转录调控中的作用。 方法: 首先采用分子克隆技术构建实验所需的DNA片段,然后采用真核细胞转染技术将重组DNA片段与内参照质粒一起转染体外培养的内皮细胞并检测尼古丁刺激的转染细胞荧光素酶的相对活性。 结果: 成功构建了6种含有不同长度ICAM-1基因启动子序列以及启动子中NF-κB 和 Sp-1 位点突变序列的荧光素酶报告基因质粒。与对照组相比尼古丁可促进含有启动子序列-579 bp(pGL3E-579/+36)(P＜0.05), -230 bp (pGL3E-230/+36) (P＜0.05) 以及启动子 Sp-1 位点突变体(pGL3E-Sp-1-MU) (P＜0.05)的荧光素酶基因表达,而下游NF-κB位点的删切重组体(pGL3E-134/+36)和含有NF-κB位点突变体(pGL3E- NF-κB -MU)的重组荧光素酶报告基因质粒在尼古丁诱导下与对照组相比荧光素酶表达量无明显差异。结论: ICAM-1基因启动子顺式作用元件下游NF-κB位点在尼古丁诱导ICAM-1基因表达机制中可能起重要作用。     

人端粒酶反转录酶启动子调控的肿瘤特异性载体的构建及表达

 目的: 构建由人端粒酶反转录酶(hTERT)启动子调控的具有肿瘤细胞特异性表达能力的荧光蛋白质粒。方法: 利用PCR技术克隆hTERT 基因启动子,利用分子生物学方法以该启动子替换pEGFP-C3质粒的CMV启动子,构建重组质粒（hTERTp-EGFP）。用脂质体转染法将hTERTp-EGFP质粒分别转染至肿瘤细胞和正常细胞, 观察此两种细胞内绿色荧光蛋白的表达差异。结果: 成功构建重组质粒hTERTp-EGFP,转染结果显示该质粒在肿瘤细胞中表达,而在正常细胞中无明显表达。结论: 重组质粒hTERTp-EGFP具有肿瘤特异性表达能力。     

利用RNAi技术抑制结肠癌NRF2基因表达

目的构建RNA干扰真核表达载体pSUPER-NRF2,并在结肠癌细胞中进行表达,验证NRF2基因表达是否受到抑制。方法设计特异性针对NRF2基因的寡核苷酸序列及相应的对照序列,分别构建重组载体并转染人结肠癌Caco-2细胞。同时转染pEGFP-N1质粒,通过荧光显微镜观察及流式细胞仪检测绿色荧光来监测转染效率,共转染pEGFP-N1 48 h后G418筛选稳定表达的细胞。利用RT-PCR和W estern b lot检测瞬时及稳定转染细胞NRF2基因的表达。结果成功构建RNA i真核表达载体。转染pEGFP-N1后48 h达转染效率高峰。瞬时及稳定转染pSUPER-NRF2-A2、B2重组质粒NRF2 mRNA的表达无差异;转染48 h后,pSUPER-NRF2-A1、B1可显著抑制NRF2 mRNA的表达;pSUPER-NRF2-B1稳定转染后,NRF2 mRNA的表达也显著降低。瞬时和稳定筛选后NRF2蛋白表达亦显著降低。结论成功构建了NRF2的RNA i表达载体,可有效抑制靶基因表达,共转染带有筛选标记的pEGFP-N1质粒,筛选可获得低表达NRF2的稳定克隆,为进一步研究NRF2在结肠癌发生、发展中的作用提供了重要的实验材料。     

NF-κB超抑制物IκBαM重组腺病毒的构建

目的 在克隆IκBα基因并构建IκBαM的基础上，构建重组腺病毒AdIκBαM。方法 将IκBαM克隆至穿梭质粒，线性化后与骨架质粒共同转染BJ5183菌，构建重组腺病毒质粒。酶切及PCR法鉴定；将其线性化后转染293细胞，观察绿色荧光以确定转染结果，以Western blot法检测目的基因表达。结果 凝胶电泳及行酶切鉴定表明同源重组成功；一PCR产物测序证明确为lxBaM；以重组腺病毒质粒转染293细胞，见绿色荧光；感染293细胞得到大量病毒。结论 成功构建了IκBαM重组腺病毒，为进一步研究奠定了基础。     

NF-κB结合元件缺失对NOX1启动子转录活性的影响

目的:构建含NADPH氧化酶1(NOX1)近端启动子区的pGL3萤光素酶报告基因载体及缺失NF-κB结合元件的相应载体,分别测定其相应活性,探讨NF-κB结合元件缺失对NOX1启动子区转录活性的影响。方法:采用PCR法克隆NOX1启动子区序列(1 415 bp),将目的片段与pGL3萤光素酶载体分别双酶切、纯化后进行连接(pGL3-NOX1-1415),测序鉴定;应用Alibaba 2.1软件分析NOX1近端启动子区,获取NF-κB结合元件;重叠PCR法将含该元件的启动子区域(88 bp)缺失,并构建相应载体(pGL3-NOX1-1327)。将两载体分别与pRL-TK内参质粒瞬时转染进入A549细胞,采用TNF-α(10μg/L)刺激细胞24 h,萤光酶标仪检测A549细胞的萤光素酶活性。结果:测序鉴定结果提示pGL3-NOX1-1415及NF-κB结合元件缺失的pGL3-NOX1-1327载体构建成功;细胞实验显示,TNF-α刺激后,转染pGL3-NOX1-1415的A549细胞萤光素酶活性明显强于对照组(P0.05),而转染NF-κB结合元件缺失的pGL3-NOX1-1327的细胞萤光素酶活性明显低于转染pGL3-NOX1-1415组(P0.05)。结论:TNF-α诱导A549细胞NOX1基因活化与NF-κB密切相关,NF-κB参与了TNF-α诱导的NOX1基因启动子的转录调控。     

显性负突变存活素质粒的构建

目的 构建显性负突变存活素质粒。方法 从大鼠心脏微血管内皮细胞中提取总RNA,反转录成cDNA后,利用巢式PCR扩增存活素基因全序列,并引入酶切位点,利用重叠PCR对存活素基因进行定点突变,然后与带绿色荧光的真核表达载体pEGFP-N3进行重组,经测序鉴定后转染细胞,观察对细胞凋亡的影响。结果 用巢式PCR扩增出含存活素基因的496 bp产物,和引入酶切位点后的452 bp产物。通过重叠PCR 3次PCR反应,得到452 bp大小的定点突变产物。重组载体经测序鉴定表明插入片段无误,转染细胞后能发出明亮的绿色荧光, Hochest染色显示细胞凋亡比空质粒对照组显著。结论 成功构建了显性负突变存活素质粒。     

大鼠siTLR4重组腺病毒载体的构建及功能鉴定

目的构建特异性针对大鼠TLR4基因的siRNA重组腺病毒载体,为进一步研究TLR4在不同疾病中的免疫调节机制奠定重要基础。方法设计并合成3对大鼠TLR4基因的siRNA序列,退火处理后定向克隆到pSES-HUS穿梭质粒中,获得pSES-HUS-siTLR4,经Pme I线性化后与pAdEasy-1骨架质粒在BJ5183细菌中进行同源重组,从而构建pAd-siTLR4质粒,通过脂质体转染,在HEK293细胞中包装形成Ad-siTLR4腺病毒颗粒,用该病毒感染PC12细胞,从基因和蛋白质水平分别检测3对siTLR4的抑制效果,同时从蛋白质水平检测TLR4下游关键分子NF-κB的表达。结果 PCR、酶切和测序均证实目的基因正确克隆到所构建的pAd-siTLR4重组腺病毒载体中;经包装获得的Ad-siTLR4病毒颗粒在PC12细胞中能够有效地抑制TLR4 mRNA和蛋白水平的表达,并显著地降低了NF-κB的表达。结论成功构建了pAd-siTLR4重组腺病毒质粒,同时包装获得了Ad-siTLR4重组腺病毒,转染PC12细胞后不仅能明显降低TLR4的表达,而且有效地抑制了TLR4通路下游关键分子NF-κB的表达。     

重组双功能域补体受体Ⅰ型分子在Vero细胞中的稳定表达及其抑制补体活化的初步研究

构建包含人重组双功能域人补体受体Ⅰ与绿色荧光蛋白(GFP)的重组质粒,观察融合蛋白在非洲绿猴肾细胞(Vero)内表达并检测其抑制补体活化的能力。PCR方法扩增出重组双功能域CR1分子,限制性内切酶XhoⅠ和SalⅠ将重组分子连入真核表达载体pEGFP-N2中,构建出重组质粒pEGFP-N2/CR1-2D,脂质体转染Vero细胞中。新霉素G418筛选出稳定表达细胞克隆,荧光显微镜下观察绿色荧光融合蛋白在细胞内的表达。用Vero细胞和免疫小鼠获得的抗Vero细胞多克隆抗体激活补体后,通过检测乳酸脱氢酶的释放来分析重组蛋白抑制补体活化的功能。结果显示pEGFP-N2/CR1-2D质粒经酶切及测序分析证实载体构建正确。转染细胞后,荧光显微镜下观察到重组质粒pEGFP-N2/CR1-2D在Vero细胞中能够大量表达,G418筛选出了稳定表达细胞克隆,乳酸脱氢酶活性检测显示,与对照组相比CR1-2D能够显著的抑制补体的活化(P0.05),初步证实了其能够抑制补体的活化。     

USP22基因克隆及其融合蛋白真核表达载体的构建

目的 克隆人类泛素水解酶22(ubiquitin-specific processing enzyme 22,USP22)基因,构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核载体.方法 利用RT-PCR技术以HeLa细胞总RNA为模板分别扩增USP22基因cDNA序列两片段,依次插入真核表达载体pEGFP-N1;重组质粒转染HEK293T细胞,观察融合蛋白表达及绿色荧光的分布.结果 测序结果显示USP22序列与GenBank收录数据一致,酶切显示重组质粒pEGFP-USP22构建无误,质粒转染后有80 %左右HEK293T细胞表达绿色荧光,且在胞质与胞核中广泛分布.结论 成功克隆USP22基因并构建与GFP融合表达的真核载体,为进一步深入研究USP22基因的生物学功能奠定了基础.     

HBx蛋白对IGF-II基因P4启动子活性的影响

目的:构建乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)表达载体pEYFP-C1-X及人IGF-II基因P4启动子调控的荧光素酶报告载体pGL3-P4,并初步探讨HBx对IGF-II基因P4启动子活性的影响。方法:应用基因重组技术,将HBx基因及P4启动子分别克隆入pEYFP-C1及pGL3-Basic载体,构建重组质粒pEYFP-C1-X及pGL3-P4;将pEYFP-C1-X稳定转染HepG2细胞,进行G418筛选;将体外甲基化pGL3-P4瞬时转染HepG2-EYFP-X细胞,采用双荧光素酶实验检测P4启动子的转录调控活性。结果:(1)经酶切及测序鉴定,重组质粒中的目的片段HBx和P4启动子的大小分别为465bp及1246bp,序列与GenBank数据库一致。(2)获得了表达HBx的细胞系HepG2-EYFP-X,在荧光显微镜下呈现黄绿色荧光。(3)转染HepG2-EYFP-X细胞的甲基化P4启动子的荧光素酶活性明显高于其对照细胞HepG2-EYFP(P0.01)。结论:HBx可增加P4启动子的转录活性。     

SEDL基因及其突变体真核表达载体的构建与鉴定

目的构建SEDL基因及其突变体与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体的融合表达质粒pEGFP-C3-SEDL并获得表达。方法分别提取X连锁迟发性脊柱骨骺发育不良(SEDT)患者和正常对照外周血淋巴细胞RNA,RT-PCR方法扩增SEDL基因cDNA,双酶切后克隆至pEGFP-C3空载体,构建表达质粒pEGFP-C3-SEDL。双酶切和DNA测序鉴定后,转染COS-7细胞,通过流式细胞仪和荧光显微镜观察重组蛋白表达情况。结果 DNA测序显示重组真核表达载体pEGFP-C3-SEDL构建成功,SEDL基因c.370-371ins A突变位点被成功克隆到突变体重组质粒中。荧光倒置显微镜观察证实重组质粒均能在细胞内进行蛋白表达。结论 SEDL基因及其突变体真核表达载体的成功构建为其进一步研究SEDL基因突变致SEDT的分子机制奠定了基础。     

NF-κB抑制剂和IFN-γ对BAFF-R基因启动子活性的影响

目的:探讨IFN-γ和NF-κB抑制剂对人BAFF-R基因启动子活性的影响。方法:以人全血基因组DNA为模板,PCR方法扩增得到BAFF-R基因转录起始点上游5’端-1562~+261 bp的片段,与荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic连接构建8个序列缺失质粒。将重组质粒瞬时转染人多发性骨髓瘤细胞株KM3,通过检测荧光素酶的相对活性,确定启动子活性最强的区域;分别用NF-κB抑制剂(BAY11-7082)和IFN-γ对活性最强的启动子进行干预,测定并比较荧光素酶的相对活性;同时RT-PCR检测干预前后BAFF-R基因mRNA的表达水平。结果:IFN-γ对BAFF-R基因启动子活性有促进作用并且可以上调BAFF-R mRNA的表达,NF-κB抑制剂(BAY11-7082)对BAFF-R基因启动子活性有抑制作用并且可以下调BAFF-R mRNA的表达。结论:IFN-γ和NF-κB信号通路参与了BAFF-R基因的转录调控,为进一步研究BAFF-R的调节机制提供了基本的依据。     

早期B细胞因子3对HepG2细胞周期的影响

目的:克隆人早期B细胞因子3 (EBF3)基因,构建真核表达载体pEGFP/EBF3,研究人EBF3对肝癌细胞株HepG2细胞周期的影响.方法:提取人胎盘组织总RNA,采用RT-PCR技术克隆人EBF3基因,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-N1,重组质粒双酶切鉴定,并进行序列测定.将重组质粒转染HepG2细胞,Western blot确证EBF3-EGFP融合蛋白的表达及亚细胞定位,流式细胞术分析转染细胞周期.结果:成功获得全长人EBF3基因,经双酶切和序列测定鉴定,真核表达质粒pEGFP/EBF3构建正确,将pEGFP /EBF3导入HepG2细胞24小时后,在倒置荧光显微镜下可观察到EBF3-EGFP融合蛋白主要表达于核内.Western blot证实转染pEGFP/EBF3后24小时和48小时细胞质和细胞核中均检出相对分子质量(Mr)为87 000的EBF3-EGFP融合蛋白.转染pEGFP/EBF3后48小时和72小时,S期细胞比例均明显高于pEGFP-N1转染细胞组,表明EBF3基因的导入可诱导细胞从G1期向G2期发展,从而促进细胞增殖.结论:成功构建了真核表达质粒pEGFP/EBF3,pEGFP /EBF3转染组S期细胞比例高于pEGFP-N1转染组,提示EBF3对人肝癌细胞株HepG2细胞有促进增殖作用.     

小鼠pEGFP-Hoxa11真核表达载体的构建及表达

目的 构建和鉴定Hoxa11和EGFP双基因共表达真核载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因Hoxa11克隆至含有报告基因EGFP的pEGFP-N1真核表达载体中,构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11经PCR,双酶切及基因测序鉴定;转染至CHO细胞,荧光显微镜下观察重组质粒的表达,提取细胞蛋白Western...