Cbfa1基因转移对原代培养的兔皮肤成纤维细胞的影响

目的探讨核心结合因子a1(core binding factor a1,Cbfa1)基因转移对原代培养兔皮肤成纤维细胞的影响作用.方法胰酶消化法培养兔皮肤成纤维细胞,兔采用脂质体转染技术转染原代培养的兔皮肤成纤维细胞,RT-PCR检测成骨标志基因Ⅰ型胶原(Ⅰ collagen)、骨钙素(osteoclcin,OCN)、骨唾液蛋白(bone sialoprotein,Bsp)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Cbfa1的表达.结果兔皮肤成纤维细胞在Cbfa1基因转染后出现OCN、Bsp、ALP的表达,Ⅰ Collagen表达增强.结论 Cbfa1基因转移兔皮肤成纤维细胞可改变原代培养的兔皮肤成纤维细胞的表型,向成骨表型转化.     

FGFR3转染小鼠骨髓间充质干细胞对CbfaⅠ和Collagen Ⅰ表达的影响

目的观察腺病毒载体Ad-FGFR3转染对小鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）相关成骨基因CbfaⅠ与CollagenⅠ表达的影响。方法采用Ad-FGFR3与重组空载体Ad-GFP病毒上清转染小鼠MSCs,RT-PCR和Western blot等方法检测FGFR3、CbfaⅠ与CollagenⅠmRNA及蛋白的表达水平。结果RT-PCR及Western blot检测结果显示Ad-FGFR3转染组MSCs FGFR3、CbfaⅠ与CollagenⅠ的表达显著增强（P〈0.05）。结论Ad-FGFR3转染显著增强MSCs相关成骨基因CbfaⅠ和CollagenⅠ的表达。     

腺病毒介导人血管内皮细胞生长因子基因感染NIH3T3细胞的实验研究

目的:探讨腺病毒介导人血管内皮细胞生长因子(hVEGF)基因感染NIH3T3细胞后目的基因表达情况及其对细胞增殖分化的影响,并观察体内移植后的表达情况及其血管生成效应.方法:构建含hVEGF基因重组腺病毒Ad.hVEGF,体外感染NIH3T3细胞,采用荧光显微镜和流式细胞术检测其转染效果和转染率,采用免疫组化、RT-PCR和ELISA法分别检测转染后的NIH3T3细胞VEGF的表达情况.将转染后的NIH3T3细胞移植于小鼠背部皮肤缺损模型上,1周后取创面覆盖的脱细胞真皮组织标本,免疫组化检测组织VEGF的表达,并行组织新生血管计数.结果:携带hVEGF基因的重组腺病毒对于NIH3T3细胞具有较高的转染效率,转染效率与病毒感染复制数(multiplicities of infection,MOI)具有量效关系.MOI为100倍时,转染效率达95%.RT-PCR和免疫组化检测到,Ad.hVEGF感染NIH3T3细胞24 h后即可在基因和蛋白质水平表达,ELISA法检测到VEGF第3日表达分泌较高,7 d时达到表达高峰(1052 pg/ml),13 d后仍可检测到VEGF的表达.2周内MTT法动态检测D值,转染组细胞与未转染组细胞比较无显著性差异(P＞0.05).转染细胞体内种植后在组织中亦可明显表达VEGF,实验组新生血管数显著高于对照组(P＜0.01).结论:腺病毒介导的VEGF基因可有效转染NIH3T3细胞,体内外均可有效表达目的基因,并可促进移植组织血管新生.     

体外诱导C2C12细胞向成骨细胞的分化

目的成骨细胞特异性转录因子a1(core binding factor a1,Cbfa1)通过调节生长因子和骨特异性细胞外基质蛋白的基因表达而参与成骨细胞的分化和骨发育过程。文中构建成Cbfa1,以腺病毒载体转染成肌细胞C2C12,为种子细胞构建组织工程化骨。方法体外培养小鼠成肌细胞C2C12,用重组腺病毒质粒pAd-IL-31介导Cbfa1/Osf2基因瞬时转染小鼠成肌C2C12细胞,Western blot检测Cbfa1蛋白表达。结果 Cbfa1蛋白表达、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性测定、骨钙素(osteocalcin,OCN)分泌量以及茜素红染色感染组明显高于对照组。结论成肌细胞C2C12可以作为种子细胞构建组织工程化骨。     

节律蛋白mPER1在NIH3T3细胞增殖和迁移中的作用

目的 研究PER1蛋白对NIH3T3细胞增殖和迁移的影响.方法 将重组表达质粒pcDNA3.1/mPER1转染入NIH3T3细胞中,并以未转染的NIH3T3细胞为对照,利用MTT法检测细胞增殖的改变.利用RT-PCR技术和Western blot检测节律蛋白mPER1对细胞迁移关键性蛋白基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达的影响.结果 MITT法显示PER1表达上调可以抑制NIH3T3细胞增殖,RT-PCR技术和Western blot检测显示在NIH3T3细胞中,当节律蛋白mPER1表达上调时,细胞迁移关键性蛋白MMP-2在RNA和蛋白水平的表达较对照组降低.结论 上调NIH3T3细胞内的PER1蛋白表达能抑制细胞增殖以及细胞迁移的关键性MMP-2在RNA和蛋白水平的表达.     

还原型谷胱甘肽上调β-catenin蛋白表达促进MC3T3-E1细胞成骨分化

目的:探讨还原型谷胱甘肽(GST)对小鼠成骨细胞MC3T3-E1成骨分化的影响,并从Wnt/β-catenin信号通路角度初步探讨其可能的机制。方法:通过碱性磷酸酶(ALP)染色以及细胞外钙化结节来检测成骨细胞MC3T3-E1的分化情况;GST干预MC3T3-E1成骨细胞株7 d、14 d和21 d后,利用Real-time PCR检测成骨相关因子RUNX2、OSX、COLⅠ、OCN基因及Wnt/β-catenin信号通路相关基因β-catenin、LRP5和GSK-3β的表达;通过Western blot检测β-catenin蛋白表达。结果:ALP染色观察到MC3T3-E1细胞外基质存在钙质沉积,且MC3T3-E1 ALP活性阳性。GST能明显提高MC3T3-E1细胞成骨相关基因以及Wnt/β-catenin信号通路相关基因的表达。Western blot结果提示GST可以明显促进β-catenin蛋白的表达。结论:MC3T3-E1细胞本身具有一定的成骨细胞特性,有效浓度的GST能促进小鼠MC3T3-E1细胞成骨分化,Wnt/β-catenin信号转导通路在成骨分化过程中起一定的调节作用。     

STK15的表达对NIH3T3细胞的影响

目的构建pcDNA3.1-STK15表达质粒,探讨STK15基因对小鼠成纤维细胞(NIH3T3)的影响。方法构建pcDNA3.1-STK15质粒,将其转染NIH3T3,应用RT-PCR、免疫细胞化学和Western印迹方法检测STK15的表达;MTT法检测细胞增殖能力;Transwell检测细胞侵袭能力。结果转染pcDNA3.1-STK15质粒的NIH3T3细胞在48 h有STK15的表达,而且该细胞的增殖速度和穿透Matrigel胶的细胞数均明显高于对照组(P0.05)。结论STK15基因具有增加细胞增殖和细胞侵袭力的功能,进而形成肿瘤。     

人VEGF在NIH3T3细胞中的基因转移和表达

目的研究人血管内皮细胞生长因子(human VEGF)在体外培养的小鼠成纤维细胞(NIH3T3细胞)中的基因转移及表达,为血管化组织工程、缺血性疾病的治疗奠定实验基础。方法应用脂质体介导的基因转移技术,将含有人VEGF165编码序列的真核表达载体pcDNA/V转染至体外培养的NIH3T3细胞系中。G418筛选出稳定表达重组质粒的细胞克隆,转接于细胞瓶中,培养72 h,同时以G418筛选的pcDNA3.1(+)阳性细胞克隆和未转染的NIH3T3细胞为阴性对照,取细胞培养上清及细胞裂解液样品进行Western blotting检测。用细胞免疫组织化学染色检测人VEGF165基因在NIH3T3细胞中的表达情况,不着色者为阴性,细胞胞质着色呈棕黄(褐)色者为阳性。结果Western blotting结果显示在转染pcDNA/V质粒的NIH3T3细胞培养上清中,可以检测到相对分子质量为22 000的反应条带,与预计的人VEGF165单体蛋白的相对分子质量相符。细胞免疫组织化学染色检测结果显示,转染pcDNA/V质粒的NIH3T3细胞呈阳性。结论人VEGF165能够在NIH3T3细胞中有效表达,并获得了稳定表达人VEGF165基因的NIH3T3细胞株。     

小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒构建及鉴定

目的构建小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体,并观察其对NIH3T3细胞的感染情况.方法采用基因工程技术,经过2次亚克隆将Osf2/Cbfa1基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用PAdEasy系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染293T细胞包装、扩增,将重组腺病毒对成纤维细胞株NIH3T3进行感染.采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测.结果酶切鉴定及PCR结果证明Osf2/Cbfa1基因重组腺病毒载体成功,病毒滴度达(1.6×1012) pfu/ml,并对NIH3T3细胞有很强感染能力.结论应用细菌内同源重组法成功构建了含小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体.     

Cbfal基因转移对原代培养的兔皮肤成纤维细胞的影响

目的 探讨核心结合因子al（core binding factor al，Cbfal）基因转移对原代培养免皮肤成纤维细胞的影响作用。方法 胰酶消化法培养兔皮肤成纤维细胞，兔采用脂质体转染技术转染原代培养的兔皮肤成纤维细胞，RT—PCR检测成骨标志基因Ⅰ型胶原（Ⅰ collagen）、骨钙素（osteoclcin，OCN）、骨唾液蛋白（bone sialoprotein，Bsp）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Cbfal的表达。结果 兔皮肤成纤维细胞在Cbfal基因转染后出现OCN、Bsp、ALP的表达，Ⅰ Collagen表达增强。结论Cbfal基因转移兔皮肤成纤维细胞可改变原代培养的兔皮肤成纤维细胞的表型，向成骨表型转化。     

稳定表达神经营养素-3的NIH3T3细胞建立及鉴定

目的：建立稳定表达NT3的NIH3T3细胞株，通过体外共培养实验观察其对耳蜗螺旋神经节细胞生长的影响．方法：以阳离子脂质体作为载体，将携带有外源性基因NT3的重组真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3转染小鼠成纤维细胞，进行RT-PCR，Western-blot分析及免疫组化鉴定，并与耳蜗螺旋神经节细胞进行共培养实验．结果：得到抗G-418的阳性细胞克隆；RT-PCR的产物约为744 bp；Western-blot可见一清晰的蛋白条带，与NT3的蛋白分子量相符合．NT3免疫组化染色结果显示转染NT3-cDNA的NIH3T3细胞胞质呈棕黄色着色．NT3转染组细胞与耳蜗螺旋神经节细胞共培养2wk后，与对照组相比，耳蜗螺旋神经节细胞无明显减少．结论：成功建立了稳定表达NT3的NIH3T3细胞株；该细胞对耳蜗螺旋神经节细胞有很好的营养支持作用．     

反应温度对生物标记用Na3 ZrF7：Yb3＋，Er3＋纳米探针上转换发光的影响

目的：研究温度对上转换发光性能的影响。方法：通过水热法制备Na3 ZrF7：Yb3＋,Er3＋纳米粒子;采用TEM, XRD和荧光光谱探究合成温度对其上转化发光性能的影响。结果：温度变化会影响纳米粒子的尺寸和晶型,进而影响其上转换发光。结论：Na3 ZrF7：Yb3＋,Er3＋纳米粒子的发光强度随合成温度的升高而逐渐增强。     

血清rT_3和T_3/rT_3对危重病新生儿预后探讨

我院NICU及新生儿病房自1996年3月至1996年12月，应用放射免疫法测定了新生儿窒息、感染和健康新生儿共120例血清T3和rT3，并进行了动态观察。结果表明；①危重病新生儿的rT3升高程度与疾病的严重程度呈正相关，特别是rT3＞4000ng／L者，提示疾病危重，预后不良；②危重病新生儿的T3/rT3值与疾病的严重程度呈负相关，特别是T3/rT3值＜0.5者，提示疾病危重，预后不佳；③血清rT3的水平及T3／rT3的比值，可作为临床疾病严重程度和预后估计的指标之一。     

反义Smad3抑制3T3细胞增殖和TGF-β1基因表达

目的 研究反义Smad3对转化生长因子-β1(TGF-β1)基因表达的调控和对3T3细胞增殖的影响。方法 构建反义Smad3质粒,以脂质体介导转染NIH3T3细胞,进行细胞计数,并用RT-PCR方法观察TGF-β1 mRNA的表达。 结果 反义Smad3能下调TGF-β1 mRNA的表达,并抑制3T3细胞增殖。 结论 可以通过阻断TGF-β1细胞内信号传导调控TGF-β1基因的表达并抑制细胞增殖。     

APA-3T3细胞微囊的深低温保存

目的:通过优选冻存液的成份和浓度,建立低温保存APA微囊化小鼠成纤维细胞(3T3细胞)的方法。方法:用海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微囊(APA)包裹3T3细胞制成APA-3T3细胞微囊。以高糖DMEM培养液为基础冻存液,分别加入不同浓度的二甲基亚砜(DMSO)或牛血清白蛋白(BSA)。分别将不同的冻存液加入APA-3T3中。按程序控制降温梯度,置于液氮中保存。快速复温后,光镜下观察APA-3T3的形态、细胞活率及膜通透性。结果:①10%DMSO组的微囊内细胞活率降低最少,细胞活率达(75.68±1.54)%,P<0.01。微囊完好率达到(94.48±0.90)%,P<0.01。②与其它组相比,4%BSA组的微囊内细胞活率降低程度最小,活率达(73±1.26)%,P<0.01。微囊完好率最高,为(85.1±0.82)%,P<0.01。③加入不同成份和浓度的冻存液对微囊的通透性没有明显影响。结论:在冻存液中加入10%DMSO和4%BSA,可在低温保存的过程中较好地保护细胞的存活及微囊的完整性。     

硫化氢对脂肪细胞前体增殖的影响

目的：探讨硫化氢对小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响。方法：培养3T3-L1前脂肪细胞,分为对照组、低剂量组和高剂量组（硫化氢浓度分别为0、10、25、50和100μmol/L）,采用四甲基偶氮唑盐比色（MTT）法检测硫化氢对3T3-L1前脂肪细胞活性的影响;用BRDU法检测细胞的增殖;结果：与对照组相比,H2S在较高浓度时,对细胞有一定的毒性作用（P〈0.05）。结论：硫化氢抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖。     

硒对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响

目的:研究硒对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响。方法:培养3T3-L1前脂肪细胞,分为对照组、低硒组、中硒组和高硒组(亚硒酸钠浓度分别为0、0.01、0.1和1μmol/L),采用四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法检测硒对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响,利用油红O染色法测定硒对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响。结果:在增殖实验中,与对照组相比,各处理组的OD值降低,并具有剂量依赖性(P<0.05);在分化实验中,各处理组的OD值与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:硒能抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖,而对其分化无影响。     

人白介素-10在NIH3T3细胞中的表达及生物学效应的初步观察

目的观察IL-10的免疫抑制作用.方法将构建好的pLXHIL-10载体,经包装细胞PA317包装后感染小鼠成纤维细胞株NIH3T3,用ELISA和原位杂交的方法检测hIL-10的表达,并对其生物学活性进行初步观察.结果检测到感染细胞中有hIL-10 mRNA的表达,感染细胞培养上清中存在hIL-10,证实感染细胞培养上清对混合淋巴细胞培养反应有明显的抑制作用.结论hIL-10可抑制混合淋巴细胞反应.     

Galectin-3重组真核表达载体的构建及其在NIH/3T3细胞中的表达

目的:构建半乳糖凝集素-3(Gal-3)的真核表达载体,在NIH/3T3细胞中表达,并检测其表达?方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人肿瘤细胞克隆Gal-3基因,插入真核表达载体pEGFP-N1中,通过酶切和测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pEGFP-Gal-3瞬时转染NIH/3T3细胞,经荧光和Western blot方法检测Gal-3表达,MTT法检测Gal-3对NIH/3T3细胞增殖的影响?结果:限制性内切酶鉴定和核酸序列测序证实成功构建含Gal-3的重组真核表达载体pEGFP-Gal-3?以重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞,检测到Gal-3蛋白表达,并证实Gal-3蛋白促进NIH/3T3细胞增殖?结论:成功构建的pEGFP-Gal-3真核表达载体在小鼠NIH/3T3细胞中成功表达,并促进NIH/3T3细胞增殖?     

Foxp3、CD3在非小细胞肺癌组织中的表达及意义

目的探讨Foxp3、CD3在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的表达及其与肺癌临床病理特征和预后的关系。方法选取62例NSCLC患者术后的肺癌组织标本（NSCLC组）及27例正常肺组织（距离肿块边缘5cm以上正常肺组织或另一叶肺组织）作为正常对照组。采用免疫组化方法分别检测两组组织中Foxp3、CD3表达的表达情况,并分析其与肺癌临床病理特征（年龄、性别、组织学类型、肿瘤大小、分化程度、pTNM分期、淋巴结转移与否）的关系。结果NSCLC组Foxp3、CD3阳性细胞数均显著多于正常对照组（P〈0．01）。两者显著相关（P〈001）。Foxp3阳性表达仅在不同分化程度间存在明显差异,低分化者Foxp3阳性细胞浸润量高于高、中分化者（P〈0．05）;CD3阳性表达仅在不同术后pTNM分期间存在明显差异,ⅢB期、Ⅳ期NSCLC组织中CD3阳性细胞数明显减少（P〈0.05）。Foxp3表达与患者术后生存时间无关（P〉0.05）,CD3阳性细胞数与NSCLC患者术后生存时间呈线性正相关（P〈0．01）,Foxp3阳性细胞数与CD3阳性细胞数比值（Foxp3／CD3）与患者生存时间呈线性负相关（P〈0.05）。pTNM分期、CD3阳性细胞绝对数有统计学意义,可作为NSCLC患者的独立预后因素。结论NSCLC组织中CD3阳性细胞数低、Foxp3／CD3大者T细胞肿瘤免疫作用抑制,影响患者术后生存时间。联合检测术后肺癌组织中Foxp3、CD3,并结合患者术后病理分期可以更好地评估NSCLC患者手术预后。