内皮生长抑制素对血管内皮细胞和成纤维细胞的生物学作用

目的 研究重组人内皮生长抑制素对人脐静脉内皮细胞（ECV304细胞）和成纤维细胞（WI－38细胞）的增殖抑制作用和诱导细胞凋亡作用,探讨内皮生长抑制素抑制细胞增殖的有效性、特异性和可能的作用机制。方法 将细胞在含有内皮生长抑制素的培养液中孵育一定时间,观察其形态,并用MTT法测定细胞的增殖抑制率和ELISA法定量检测细胞凋亡程度。结果 重组人内皮生长抑制素可显著抑制ECV304细胞的增殖,其作用呈剂量依赖性,ED50约15－20μg/ml,并能诱导ECV304细胞凋亡（富集因子2．44）;对WI－38细胞无增殖抑制作用和诱导细胞凋亡作用。结论 重组人内皮生长抑制素具有特异性抑制血管内皮细胞增殖作用,诱导细胞凋亡可能是其作用机制之一。     

姜黄素抑制HeLa细胞诱导的血管内皮细胞增殖作用及其机制研究

目的:研究姜黄素对HeLa细胞诱导的血管内皮细胞增殖的抑制作用及其机制.方法:采用台盼蓝排染法计数人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞,MTT法测定不同浓度姜黄素对ECV304细胞和HeLa细胞诱导的ECV304细胞增殖的抑制,采用RT-PCR和Western blot检测40 μmol/L姜黄素作用于HeLa细胞诱导的血管内皮细胞4、8、16和24 h后,血管内皮生长因子(VEGF)及其受体VEGFR2(KDR)基因及蛋白的表达.结果:姜黄素直接作用于ECV304细胞,其细胞计数较对照组显著减少(P<0.05),并呈浓度依赖性.MTT法测得不同浓度姜黄素作用后,可产生显著的细胞增殖抑制作用,48 h体外半数抑制浓度(IC50)值为(38.4±0.031) μmol/L.随着姜黄素浓度的增加,其时ECV304细胞和HeLa细胞诱导的ECV304细胞的增殖有明显的抑制作用,P值分别为0.000 0和0.000 1.姜黄素作用于HeLa细胞诱导的血管内皮细胞4、8、16和24 h后,能明显下调VEGF与KDR的mRNA和蛋白表达.结论:姜黄素能直接抑制血管内皮细胞的增殖,对HeLa细胞诱导的血管内皮细胞的增殖也有抑制作用.此作用可能是通过押制VEGF及其受体KDR的mRNA和蛋白表达来实现的.     

血管抑素抑制人脑胶质瘤生长及病理学研究

目的：观察人血管抑素（Angiostatin, AS）对小鼠脑胶质瘤皮下移植瘤生长的抑制作用。方法：用MTT法观察AS对血管内皮细胞系ECV304和人脑胶质瘤细胞系TJ905增殖的影响；建立荷G422脑胶质瘤小鼠皮下移植模型，皮下注射AS，计算瘤体比和抑瘤率。结果： (1)AS对ECV304的抑制作用随着剂量的增加而增强，AS对TJ905无影响；(2)动物实验显示，AS剂量为10 mg·kg-1·d-1和50 mg·kg-1·d-1时抑瘤率分别为21.8%和84.3%；(3)免疫组化Ⅷ因子染色表明实验组与对照组之间在血管发育及数量方面均有差别。结论： AS在体外对胶质瘤细胞无抑制作用，在体内能通过抑制血管内皮细胞增殖而抑制胶质瘤的生长。     

地塞米松对小鼠H_(22)肿瘤生长及血管内皮生长因子表达的影响

 目的　探讨地塞米松对小鼠H2 2 肿瘤生长及血管内皮生长因子 (VEGF)表达的影响。方法　BALB c小鼠皮下接种H2 2 肿瘤细胞 ,腹腔注射地塞米松 ,每天测肿瘤直径。用抗CD31单抗对肿瘤组织做免疫组化微血管计数。噻唑蓝法检测地塞米松对体外培养的H2 2 细胞和人脐静脉内皮细胞ECV 30 4增殖的影响。RT PCR法测定肿瘤组织和体外培养细胞的VEGFmRNA表达。结果　地塞米松可以显著抑制体内H2 2 肿瘤的生长 ,给药组肿瘤体积与对照组比较P <0 .0 5。给药组微血管计数和VEGFmRNA表达比对照组显著减少。体外实验中 ,随着地塞米松浓度的增加 ,ECV 30 4细胞的增殖率降低 ;H2 2 细胞中VEGFmR NA表达下降。结论　地塞米松可以显著抑制小鼠H2 2 肿瘤的生长。地塞米松对体内H2 2 肿瘤组织和体外H2 2 细胞的VEGFmRNA表达均有显著的抑制作用。地塞米松对肿瘤细胞VEGF表达的抑制作用可能是其抗H2 2 肿瘤及抗血管生成的一个重要原因。     

舒林酸和吲哚美辛对人血管内皮细胞ECV304的生长抑制作用

目的：体外研究非甾体类消炎药对人血管内皮细胞的生长抑制作用。方法：采用舒林酸和吲哚美辛作用于人脐静脉内皮细胞株ECV304，并设置不同的作用浓度和作用时间，以体外药物敏感实验(MTT)检测舒林酸和吲哚美辛在不同浓度及作用时间下对ECV304细胞的增殖抑制效应；以流式细胞仪技术和Hoechst33258。荧光染色检测药物作用后细胞有无凋亡改变及其形态学变化。结果：舒林酸和吲哚美辛在体外对ECV304细胞均有显著的生长抑制作用，并且具有时间和剂量依赖性，舒林酸能显著诱导ECV304细胞产生凋亡。结论：舒林酸和吲哚美辛在体外具有良好的抑制人脐静脉内皮细胞株ECV304生长的作用，非甾体类消炎药能够诱导血管内皮细胞产生凋亡而抑制其生长，同时也可能存在其他的作用机制。     

肿瘤基质血管内皮细胞模型的建立及生物学特性研究

 目的 建立肿瘤基质血管内皮细胞模型并探讨其生物学特性。方法 用人卵巢癌细胞SKOV3培养上清液诱导人内皮细胞ECV304，获得能稳定生长的ECV304-SKOV3细胞。观察其形态改变，检测其生长情况，免疫细胞化学测定其增殖细胞核抗原(PCNA)、bcl-2、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、粘合素(TN)表达变化，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定其端粒酶活性，并分析其核型、蛋白合成能力、对常用抗癌药物的反应性。结果 ECV304-SKOV3细胞出现畸形核、有微绒毛的腔隙，染色体众数略有增加。细胞群体倍增时间较亲代细胞BCV304缩短；分裂指数增高；表达PCNA、bcL-2、MMP-9增强(t≥2．4671，P<0．05)，而TN减弱(t=2．2473，P<0．05)；S期细胞数增加，G0／G1期细胞数减少(x²=923．313，P<0．01)，增殖指数(PI)明显增高(x²=570．197，P<0．01)。对作用于S期或S期和M期的抗癌药物较ECV304敏感，且与SKOV3癌细胞一致(F≥24．14，P<0．01)。蛋白质合成能力增强(t=-12．2465，P<0．001)。端粒酶活性强于亲代细胞ECV304(t=-25．2990，P<0．001)。结论 DCV304-SKOV3细胞较亲代细胞DCV304增殖快，核型发生变化，存活能力强，功能活跃，某些血管形成因子表达增强，具有肿瘤基质血管内皮细胞的某些特性，可作为肿瘤基质血管内皮细胞模型用于进一步研究。     

蜂毒素对人脐静脉内皮细胞ECV304生长的影响及其机制探讨

目的：研究蜂毒素对人脐静脉内皮细胞ECV304生长的抑制作用及其机制。方法：将人脐静脉内皮细胞ECV304进行体外培养。四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测蜂毒素对ECV304细胞的增殖抑制作用;流式细胞术测定细胞周期;膜联蛋白Ⅴ（AnnexinV）-异硫氰酸荧光素（FITC）＋碘化丙啶（PI）双参数检测细胞凋亡;免疫细胞化学法检测经不同浓度蜂毒素作用后ECV304细胞VEGF和bFGF的表达。结果：蜂毒素可显著抑制人脐静脉内皮细胞的增殖生长,并且呈浓度依赖性,其24h、48h和72h的IC50分别为5.11μg/ml、4.68μg/ml和4.40μg/ml。经蜂毒素作用后,S期细胞比例明显增加,G0/G1期细胞比例减小,细胞周期阻滞于S期,并可诱导细胞凋亡。蜂毒素可明显下调人脐静脉内皮细胞VEGF和bFGF的表达（P〈0.05和P〈0.01）。结论：蜂毒素在体外能够抑制人脐静脉内皮细胞增殖和合成VEGF及bFGF的功能,其机制可能与阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡有关。     

新城疫病毒对血管生长的抑制作用

 目的 研究鸡新城疫病毒对血管的生长抑制作用。方法 采用小鼠肺癌转移模型观测鸡新城疫病毒（NDV）对癌细胞转移的影响及组织内微血管的生长情况；用体外药物敏感实验（MTT）检测NDV在不同剂量和作用时间下对人血管内皮细胞ECV304细胞的增殖抑制效应；用PI和Hoechst33342进行荧光染色检钡4NDV作用后细胞有无凋亡改变及其形态学变化。结果 NDV在体内可以有效抑制小鼠发生癌转移时组织内微血管的生成，在体外可以抑制ECV304细胞的增殖并导致较为轻微的凋亡现象。结论 体内外实验均表明NDV可以抑制肿瘤发生时微血管的生长，这一作用通过抑制血管内皮细胞的增殖而非直接的细胞毒作用实现，该作用机制可能与某种特定病毒蛋白有关，尚待进一步研究。     

淫羊藿苷与黄芩苷联合多柔比星对肝癌细胞APRIL表达和血管内皮细胞生长抑制的研究

目的:探讨中药单体淫羊藿苷(ICA)、黄芩苷(BAI)联合化疗药多柔比星(ADM)抑制肝癌HepG2细胞APRIL、VEGF的表达,进而抑制血管内皮细胞生长的作用机制.方法:MTT法检测血管内皮细胞ECV304的增殖活性;RT-PCR法检测HepG2细胞APRIL表达水平和ECV304细胞中APRIL受体HSPG的表达情况;免疫细胞化学检测HepG2细胞VEGF表达水平.结果:HepG2细胞中VEGF蛋白、APRIL和ECV304细胞中APRIL受体HSPG的mRNA均呈高表达状态,且APRIL与VEGF两者高表达呈显著正相关(P＜0.001);HepG2细胞经25 μg/mL ICA、200 μg/mL BAI、2 μg/mL ADM以及12.5 μg/mL ICA+1 μg/mL ADM、100 μg/mL BAI+1 μg/mL ADM 5组药物处理后,与未用药对照组相比,APRIL mRNA表达水平明显下降;HepG2细胞经5组药物处理后的上清液与未用药对照组相比,对ECV304细胞具有明显的增殖抑制作用,抑制率分别为(2.79±5.57)%、(15.20±3.79)%、(12.10±4.50)%、(19.34±8.17)%和(20.27±4.77)%(P均＜0.05);HepG2细胞经5组药物处理后,与未用药对照组相比,VEGF的表达水平明显下降.结论:APRIL具有促进静脉内皮细胞ECV304增殖的作用.ICA、BAI联合ADM能降低HepG2细胞中APRIL与VEGF的表达水平,从而发挥其抑制血管内皮细胞ECV304生长的作用.     

雷公藤红素抑制血管生成的实验研究

目的：探讨雷公藤红素对血管生成的抑制作用。方法：采用MTT法测定雷公藤红素对血管内皮细胞株(ECV)增殖的影响,观察雷公藤红素对ECV迁移实验和小管形成实验的作用,以及对鸡胚尿囊膜血管生成的影响。体内实验采用Matrigel plug方法。结果：雷公藤红素可明显抑制ECV的体外增殖,IC50为1．33μg／ml;可抑制ECV的迁移和小管形成,并且呈明显的剂量依赖性;同时具有抑制鸡胚尿囊膜血管生成和Matrigel plug中的血管新生的作用。结论：雷公藤红素具有明显抑制血管生成的作用,有可能成为有效的血管生成抑制剂。     

内皮抑制素基因治疗小鼠肝癌及其机制研究

 目的探讨内皮抑制素质粒重复注射治疗小鼠肝癌的效果及其作用机制。方法内皮抑制素质粒转染BHK21,ELISA检测培养上清中内皮抑制素的含量,并用此上清作用于ECV304内皮细胞,MTT法检测内皮细胞的增殖。小鼠股部肌内接种H22细胞,反复注射内皮抑制素质粒/PVP,观察肿瘤的形成。ELISA检测血清中内皮抑制素的含量,免疫组化观察肿瘤血管密度,TUNEL检测肿瘤细胞的凋亡。结果转染上清中可以检测到分泌出的内皮抑制素,并可抑制内皮细胞的增殖,抑制率约29.2%。治疗组血清内皮抑制素水平升高,瘤内血管减少,肿瘤细胞凋亡增加,肝癌生长受抑,抑制率为56.4%。结论PVP介导的内皮抑制素基因治疗可以抑制小鼠肝癌血管形成,从而较好地抑制了肝癌的生长     

慢病毒介导的Canstatin基因转移对脐静脉血管内皮细胞增殖与凋亡的影响

目的：构建携带Canstatin基因的慢病毒载体,体外转染脐静脉血管内皮细胞ECV304,观察其体外培养的脐静脉血管内皮细胞增殖及凋亡的影响。方法：应用基因重组技术构建慢病毒载体表达质粒pGC-FU-Canstatin,通过酶切、测序验证Canstatin基因后,将pGC-FU-Canstatin质粒和包装质粒pHelper 1.0,pHelper 2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带Canstatin基因重组慢病毒GC-FU-Cansta-tin,并测定病毒滴度。将重组慢病毒转染靶细胞人脐静脉血管内皮细胞ECV304,通过Western blotting检测靶细胞中Canstatin的表达。采用MTT法观察Canstatin基因对人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增殖的影响。TUNEL染色、流式细胞仪AnnexinV/碘化丙啶双染法,检测慢病毒介导的Canstatin基因诱导脐静脉血管内皮细胞的凋亡。结果：pGC-FU-Canstatin中携有正确的Canstatin基因序列;pGC-FU-Cansta-tin和包装质粒pHelper 1.0,pHelper 2.0共转染包装细胞293T产生重组病毒GC-FU-Canstatin;检测病毒滴度为1×109TU/ml;Western blotting检测到Canstatin蛋白在靶细胞中持续表达。Canstatin（感染复数分别为25和50）作用72h后,ECV304细胞增殖数目显著少于PBS组和空载体组（P〈0.01）;TUNEL染色,以MOI为25的重组慢病毒GC-FU-Canstatin作用于人脐静脉血管内皮细胞ECV304细胞72h后,出现典型的凋亡形态学改变。以感染复数为25的GC-FU-Canstatin处理ECV304细胞72h后,细胞凋亡率为（21.63±1.32）%,PBS组为（2.87±0.76）%,空载体组为（2.66±0.69）%,转基因组与空载体组、PBS组相比差异均有显著统计学意义（P〈0.01）。结论：慢病毒介导的Canstatin基因可显著抑制人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外增殖,同时对人脐静脉血管内皮细胞的凋亡具有促诱导作用。     

Glioma-conditioned medium blocks endothelial cells’ apoptosis Induced by hypoxia and promotes its angiogenesis via up-regulation of u-PA/u-PAR

Objective: To investigate the role of urokinase-type plasminogen activator/urokinase-type plasminogen receptor(u-PA/u-PAR) system in glioma angiogenesis under hypoxic conditions, we studied the effect of glioma-conditioned medium on the hypoxia induced changes in human endothelial-like ECV304 cells proliferation, apoptosis, cord formation in vitro and u-PA/u-PAR expression.Methods: MTT assay was used to examine the changes in cell proliferation. Cell apoptosis was analyzed by Hoechst 33258 staining. Matrigel cord-like formation assay was used to evaluate the angiogenesis ability of ECV304 cells in vitro. Expressions of u-PA/u-PAR mRNA were detected by quantitative real-time RT-PCR.Results: Hypoxia inhibited ECV304 cells proliferation and induced cell apoptosis. Hypoxic conditioned medium(H-CM) while not normoxic conditioned medium(N-CM) of U251 glioma cells partially blocked the effect of hypoxia on ECV304 cells proliferation and apoptosis. H-CM of U251 glioma cells also promoted the cord formation of ECV304 cells seeded on matrigel. When u-PA or u-PAR monoclonal antibodies were added into ECV304 cells culturing medium, cord formation ability was partially inhibited. H-CM of U251 glioma cells induced uPA and uPAR expression in ECV304 cells.Conclusion: These suggest that u-PA/u-PAR system is involved in glioma angiogenesis trigged by hypoxic microenviroment.     

Growth plate chondrocytes inhibit neo-angiogenesis -- a possible mechanism for tumor control

Clinically, tumors seldom grow across the articular cartilage and physeal plate. It is believed that avascular cartilage may inhibit the neo-vascularization of tumor spread. The conditioned medium of growth plate chondrocytes resisted the migration of ECV304 by approximately 41% in invasion assay. Growth plate chondrocytes were shown by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay to have an insignificant effect on the viability of human endothelial cells and fibroblasts. However, the proliferation of human endothelial cells was significantly inhibited by growth plate chondrocytes. The inhibitory activity was up to 35% and specific to endothelial cells. Inhibition of blood vessel formation was also demonstrated in the chick chorioallantoic membrane (CAM) assay. These findings demonstrated that growth plate chondrocytes secrete anti-angiogenesis factor(s) which specifically inhibit both the migration and proliferation of endothelial cells.     

Inhibition of tumor metastasis by sodium caffeate and its effect on angiogenesis

OBJECTIVE: Sodium caffeate (SC), the sodium salt of caffeic acid, was synthesized in our laboratory. We studied the antimetastatic effect induced by SC and its inhibition of tumor angiogenesis using various in vitro and in vivo metastasis assays. METHODS: The in vivo inhibitory effect of SC on metastasis and angiogenesis was examined in the Lewis lung carcinoma pulmonary metastasis model and chicken chorioallantoic membrane (CAM) model, respectively. MTT assay and flow cytometry were used to measure the inhibition by SC of the proliferation of transformed human umbilical vein endothelial cells (ECV304) and the apoptosis induced by SC in ECV304 cells, respectively. A cell attachment assay was used to evaluate inhibition by SC of the adhesion activity of human high metastatic giant cell carcinoma of the lung (PG) cells. A cell invasion assay was used to evaluate the effect of SC on the ability of PG cells to cross tissue barriers. Inhibition by SC of gelatinase secretion in PG cells was determined by zymography. RESULTS: In vivo results showed that SC (1 g/kg i.p. for 14 days) inhibited pulmonary metastasis at a rate of 55%. There were no differences in animal weights among the groups. The angiogenesis of CAM was inhibited by SC (200 microg/egg) at a rate of 70%. In vitro studies showed that SC inhibited the proliferation of ECV304 cells by inducing apoptosis. SC also reduced the adhesion and invasion ability of PG cells and inhibited the secretion of MMP-2 and MMP-9 in PG cells. CONCLUSION: SC might be a potential antimetastatic agent with an antiangiogenic effect.