CHO细胞中表达蛋白激酶C~ι亚型

目的研究中国仓鼠卵巢上皮细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO cell)是否表达蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)ι亚型。方法参照GeneBank数据库PKCι亚型的cDNA序列;通过EMBL-EBI数据库的CLUSTALW,选取种属间同源性最高的序列;利用GENERUNNER软件设计PKCι亚型的特异引物;RT-PCR扩增CHO细胞PKCι亚型的cDNA序列;利用AT克隆技术将PKCι连接到pGEM-T载体上,经蓝白斑筛选,酶切鉴定后测序;Western blotting方法检测CHO细胞中PKCι亚型。结果RT-PCR和Western blotting技术证实CHO细胞表达PKCι亚型,并经测序证实。结论CHO细胞中发现PKCι亚型的存在,为深入研究PKCι亚型的结构、功能及与细胞内信号转导通路的关系奠定基础。     

CHO细胞中表达蛋白激酶C~ι亚型

目的研究中国仓鼠卵巢上皮细胞（Chinese hamster ovary cell，CHO cell）是否表达蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）L亚型。方法参照GeneBank数据库PKCl亚型的cDNA序列；通过EMBL—EBI数据库的CLUS TALW，选取种属间同源性最高的序列；利用GENERUNNER软件设计PKCl亚型的特异引物；RT-PCR扩增CHO细胞PKCl亚型的cDNA序列；利用AT克隆技术将PKCl连接到pGEM-T载体上，经蓝白斑筛选，酶切鉴定后测序；Western blotting方法检测CHO细胞中PKcL亚型。结果RT—PCR和Western blotting技术证实CHO细胞表达PKCl亚型，并经测序证实。结论CHO细胞中发现PKCl亚型的存在，为深入研究PKCl亚型的结构、功能及与细胞内信号转导通路的关系奠定基础。     

蛋白激酶C亚型与胃癌关系的实验研究

目的研究蛋白激酶C(PKC)各亚型与胃癌的关系。方法选取60例胃癌组织标本和120例慢性胃炎标本,采用兔抗人多克隆抗体及SABC免疫组织化学染色法对PKC亚型进行比较。结果 PKCα在胃癌组织中的表达阳性率为76.7%,在慢性胃炎组织中的表达阳性率为47.5%(P<0.05)。PKCγ在胃癌组织中的表达阳性率为81.7%,在慢性胃炎组织中的表达阳性率为50.0%(P<0.05)。PKCβⅠPKCβⅡ在胃癌及慢性胃炎组织中均无表达。不同病理类型及不同临床分期的胃癌组织间的PKCα、PKCγ的表达阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。PKCα、PKCγ在各型慢性胃炎中的表达阳性率差异也无统计学意义(P>0.05)。结论 PKCα及PKCγ在胃癌组织中有较高表达,其阳性率明显高于慢性胃炎组织,但与胃癌病理类型及临床分期无关。PKC可能在胃癌的发生发展中起重要作用。     

蛋白激酶C亚型介导运动预适应心肌保护效应研究进展

结合近年来国内外运动预适应心肌保护效应相关研究结果,对蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)相关亚型在心肌保护效应中的表达变化及生物学作用进行综述。结果显示:目前PKC介导运动预适应心肌保护效应的研究多集中于单亚型的生物学作用及多亚型的表达变化,对亚型间相互作用及潜在信号转导通路的研究相对缺乏。PKC广泛参与介导运动预适应诱导的内源性心肌保护效应,且主要涉及α、δ、ε三个亚型。δPKC的激活是发挥心肌保护效应的前提,但过度表达δPKC可致心肌损伤;αPKC、εPKC主要通过增加效应物质的表达,发挥心肌保护效应。     

我国SARS病毒BJ01株基因组亚cDNA克隆的构建与鉴定

目的：构建我国SAILS病毒BJ01株基因组全序列的cDNA克隆，为进一步构建该毒株的全长感染性cDNA克隆奠定基础。方法：根据BJ01株病毒基因组序列中含有的特异酶切位点，利用DNAstar软件设计7对引物。然后通过RT-PCR扩增出覆盖病毒基因组全长的7个cDNA片段，并分别将其克隆至pGEM-T Easy或Topo载体。结果与结论：已构建出SARS-CoV BJ01株基因组的7个亚cDNA克隆，经酶切鉴定和序列测定表明，所获得的cDNA克隆为BJ01株病毒的特异序列。     

血小板蛋白激酶C与脑梗塞的关系

为研究血小板（PLT）中蛋白激酶C（PKC）与脑梗塞发病的关系。以对倒脑梗塞患者及31例健康者为对象，检测其PLT及PLT中PKC活性，对检测结果进行统计学分析。结果脑梗塞组PLT数目，PLT膜PKC活性明显高于对照组。结果提了脑梗塞患者PKC活性增高，PKC可能是脑梗塞形成过程中的重要机制之一。     

小鼠神经生长因子cDNA的克隆及核苷酸序列分析

用Ｔ４－ＤＮＡ连接酶在限制性内切酶ＳｍａＩ存在下，将神经生长因子ｃＤＮＡ片断克隆到具有双向转录启动子的载体质粒ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）中。Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测定其核苷酸顺序表明，所克隆的ＮＧＦｃＤＮＡ片断，长３６３ｂｐ，包含了成熟神经生长因子的全部编码。该重组质粒可分别用于制备ＮＧＦｃＤＮＡ探针和ＲＮＡ探针，是研究ＮＧＦ基因结构及表达调控等方面的重要工具。     

一株西尼罗病毒基因组cDNA亚克隆的构建与鉴定

目的：构建我室保存的一株西尼罗病毒引进毒株（CH-01）基因组全长cDNA的亚克隆，为进一步构建该毒株的感染性全长cDNA克隆奠定基础。方法：根据CH-01病毒株基因组序列中含有的特异性酶切位点，利用DNAstar及Olig06软件设计5对引物。以感染细胞中的病毒RNA为模板，通过RT-PCR扩增出覆盖病毒基因组全长的5个cDNA片段，并分别将其克隆至pGEM-Teasy载体，通过片段间共有的酶切位点进行连接，最终获得基因组5′和3′半分子，并分别通过序列测定加以鉴定。结果与结论：已构建出西尼罗病毒CH-01株基因组的5′和3′半分子，经酶切鉴定和序列测定表明所获得的cDNA克隆为该株病毒的特异性序列。     

瘦素对大鼠肝细胞蛋白激酶C蛋白表达的影响

目的观察瘦素对大鼠肝细胞蛋白激酶C(PKC)蛋白表达的影响.方法分离、培养新生Sprague-Dawley大鼠肝细胞,与瘦素(5 nmol/L)孵育12,24,36 h,提取蛋白后用Western印迹法检测各时间点蛋白激酶C的蛋白表达水平.结果大鼠肝细胞cPKCα的蛋白水平在瘦素孵育12 h及2 4 h后同对照组相比均未发生显著变化(P＞0.05);但在孵育36 h后同对照组相比显著升高(P＜0.05).经瘦素孵育24及36 h后,大鼠肝细胞cPKCα的蛋白水平同孵育12 h 时相比亦显著升高(P＜0.05).结论瘦素可上调大鼠肝细胞蛋白激酶C的蛋白表达,这种促进作用呈时间依赖性.     

血小板中蛋白激酶C与缺血性心脑血管病关系

为研究血小板（ Ｐ Ｌ Ｔ） 中蛋白激酶（ Ｃ Ｐ Ｋ Ｃ） 与缺血性心脑血管病发病的关系。以急性心肌梗塞（ Ａ Ｍ Ｉ） 和脑梗塞病人为对象,检测分析 Ｐ Ｌ Ｔ 中 Ｐ Ｋ Ｃ 底物４０ｋ Ｄ 蛋白磷酸化程度来反映 Ｐ Ｋ Ｃ 活性,并同时设健康对照组。结果疾病组４０ｋ Ｄ 蛋白磷酸化程度明显高于健康对照组,且随凝血酶刺激时间的延长而增强。结果提示 Ｐ Ｋ Ｃ 活性增高为缺血性心脑血管病形成过程中的重要机制之一。     

人肝再生增强因子的cDNA克隆与序列分析

利用大鼠肝再生增强因子核苷酸序列，从人胎肝ｃＤＮＡ文库中筛选到人肝再生增强因子ｃＤＮＡ克隆，该克隆含有１．５ｋｂ的外源插入片段，核苷酸序列测定表明含３７５ｂｐ的读码框架，能编码１２５个氨基酸的蛋白质；与大鼠肝再生增强因子相比，核苷酸序列测定表明含３７５ｂｐ的读码框架，能编码１２５个氨基酸的蛋白质；与大鼠肝再生增强因子相比，核到序列同源性达８７％，氨基酸序列同源性达８４．８％。     

蛋白激酶Cγ基因在脊髓背角跨器官敏化调控中的作用及其机制

目的 探索在内脏高敏感状态下,跨器官敏化模型鼠脊髓背角蛋白激酶(PKC)γ基因表达的改变并探索其与内脏痛敏程度之间的相关性,寻求调控跨器官敏化的新靶点.方法 采用鸡卵清蛋白(OVA)基础致敏联合结直肠芥子油(MO)灌注的方法建立跨器官敏化大鼠模型.30只SD大鼠随机分为:正常对照组(A组,n=7);跨器官敏化模型组(B组,n=8),给予OVA基础致敏联合MO结肠灌注;OVA+MO+生理盐水对照组(C组,n=7),给予OVA基础致敏联合MO结肠灌注,鞘内注射生理盐水10μl;OVA+MO+PKCγ特异性抑制剂(GF109203X)组(D组,n=8),OVA基础致敏联合MO结肠灌注,鞘内注射GF109203X 10μl.采用免疫荧光染色技术及Western blotting检测各组大鼠脊髓PKCγ的表达情况,并探讨PKCγ表达与内脏痛敏程度之间的关系.结果 免疫荧光染色结果显示,跨器官敏化模型组大鼠L4-6脊髓背角组织PKCγ蛋白表达量(98.99±7.73)明显多于正常对照组(56.14±6.22,P<0.05);而鞘内注射GF109203X的D组大鼠PKCγ表达量显著降低,明显低于鞘内注射生理盐水的C组(56.83±7.07 vs 89.59±9.90, P<0.05).Western blotting检测结果也显示,B组大鼠L4-6脊髓背角组织中PKCγ的表达量(1.538±0.228)与A组(1.065±0.064)相比显著增加(P<0.001);D组大鼠PKCγ表达量(1.124±0.169)与C组大鼠(1.605±0.224)比较则显著降低(P<0.001).结论 采用OVA基础致敏联合MO结肠灌注可成功建立跨器官敏化大鼠模型,脊髓背角组织中PKCγ参与了跨器官内脏痛敏信号的传递,在跨器官敏化的产生和维持中发挥了重要作用.     

蛋白激酶C对人胰腺癌细胞放射敏感性的影响及其机制

目的 研究蛋白激酶C对人胰腺癌细胞Panc-1体外放射敏感性的影响并探讨其机制。方法 应用蛋白激酶C激活剂PMA和抑制剂CH分别观察其对Panc-1细胞存活分数的影响。采用多靶单击数学模型拟合细胞剂量存活曲线,明确CH对人胰腺癌细胞Panc-1的放射增敏效应。采用Annexin Ⅴ/PI法流式细胞仪检测CH对细胞凋亡的影响。采用免疫细胞化学方法检测Bcl-2、Bax蛋白表达的变化。结果 单纯照射组、PMA处理组和CH处理组细胞SF₂值分别为0.78±0.02、0.92±0.11和0.19±0.20。浓度为0.5、2和8μmol/L 的CH作用4h后,放射增敏比分别为1.05、1.24和1.77,呈药物浓度依赖性。流式细胞仪检测显示PMA可使照射后肿瘤细胞凋亡指数降低,而CH则使凋亡指数增加。CH作用后,肿瘤细胞Bax蛋白表达水平增加,Bcl-2蛋白表达水平无明显变化,但Bax/Bcl-2值增大。结论 蛋白激酶C通过改变肿瘤细胞的凋亡水平实现对人胰腺癌细胞Panc-1放射敏感性的调控。     

RT-PCR法扩增人锰超氧化物歧化酶cDNA的克隆及其核苷酸序列测定

从人肝细胞提取总RNA,以此为模板进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),制备出人锰超氧化物歧化酶(hMnSOD)的cDNA片段.将此cDNA克隆入专为装载PCR产物而构建的质粒载体pGEM-T中.对重组质粒进行限制酶切分析和序列测定.结果表明,该克隆片段与国外报道的hMnSOD cDNA序列一致.表达蛋白的工作正在进行之中.     

高血压血小板中蛋白激酶C底物磷酸化程度的实验研究

目的　研究血小板蛋白激酶C(PKC)在高血压中的活性 ,以揭示PKC的致病作用。方法　利用32 P NaH2 PO4 标记血小板 ,以PKC底物 40kD蛋白磷酸化作为酶活性的标志 ,对高血压组及正常对照组PKC的基础活性及反应活性进行分析比较。结果　高血压组PKC的基础活性及经凝血酶刺激后的反应活性均较正常对照组显著增高 (P <0 .0 1)。结论　提示PKC活性增高为高血压病形成过程中的重要机制之一。     

蛋白激酶C在哺乳动物卵子受精过程中的作用

蛋白激酶C(PKC)被认为是在哺乳动物受精期间卵母细胞激活的主要调节者。在哺乳动物卵子的受精过程中,PKC可能作为卵子活化过程中Ca^2 的重要下游靶分子,启动皮质颗粒的排放,并使卵子突破MⅡ期阻滞,促使细胞周期恢复和原核形成。早期采用药物激活和抑制PKC获得了大量支持上述观点的证据,然而,有些研究结果与PKC调节卵子激活的作用相矛盾,故目前无法得到确切的结论。由于哺乳动物的卵子表达许多不同的。PKC亚型,并且它们的空间结构、辅助因子和作用底物存在区别。因此,需要更为全面地重新认识卵子中PKCS的作用。本文就PKC的生物化学特性、最近有关哺乳动物受精过程中PKC作用的实验证据以及某些PKC亚型在受精一诱导卵子激活中具有的特殊作用的研究近况作一综述。     

醛糖还原酶抑制剂对糖尿病大鼠肾小球蛋白激酶C活性的影响

目的 探讨醛糖还原酶抑制剂Sorbinil对糖尿病大鼠肾小球蛋白激酶C活性的影响。方法 采用腹腔内注射链脲菌素法制作糖尿病大鼠模型，将大鼠分为模型组、Sorbinil组、格列喹酮 苯那普利组和正常对照组。8周后处死大鼠，分离肾小球，分别测定各组肾小球细胞浆和细胞膜蛋白激酶C活性。结果 糠尿病模型组细胞浆蛋白激酶C活性显著降低，细胞膜蛋白激酶C活性显著升高。用两组西药治疗后，苯那普利 格列奎酮组无明显改善，而Sorbinil组可显著提高细胞浆蛋白激酶C活性、降低细胞膜蛋白激酶C活性。结论 Sorbinil可通过改善多元醇代谢而降低蛋白激酶C活性，同时，亦或存在其他途径如直接对蛋白激酶C的抑制作用等等。Sorbinil通过调节多元醇代谢等途径间接或直接降低蛋白激酶C活性，是其治疗糖尿病肾病的作用机理之一。     

蛋白激酶C在肢体缺血预处置中的作用

目的：探讨缺血预处置（ＰＣ）减轻骨骼肌组织缺血再灌注（Ｉ／Ｒ）损伤的作用机制．方法：采用大鼠后肢原位灌流方法观察ＰＣ和ＰＣ加用蛋白激酶Ｃ抑制剂ｐｏｌｙｍｙｘｉｎＢ或Ｈ７对Ｉ／Ｒ的影响．实验动物分为５组：Ｉ／Ｒ组，ＰＣ组，ＰＣ＋ＰＢ组，ＰＣ＋Ｈ７组，对照组．比较各组灌流液中和肌组织中的损伤性指标变化．结果：ＰＣ可以明显减轻肢体的Ｉ／Ｒ损伤，使用ｐｏｌｙｍｙｘｉｎＢ或Ｈ７则阻断ＰＣ对Ｉ／Ｒ骨骼肌细胞内酶漏出、丙二醛产生及钙超载等损伤性指标的改善作用．结论：ＰＣ对Ｉ／Ｒ肢体具有保护作用，其保护机制与蛋白激酶Ｃ的激活有关     

蛋白激酶C受体与转录因子Twist在宫颈癌组织中表达及其临床意义

目的探讨蛋白激酶C受体(RACK-1)与转录因子Twist在宫颈癌组织中的表达及其临床意义。方法收集潍坊市第二人民医院自2016年1月至2018年3月收治的85例首次行宫颈癌根治手术治疗的宫颈癌患者的癌组织及距离癌周5 cm以上正常组织的标本,采用免疫组化法检测宫颈癌组织和癌旁正常组织中RACK-1、Twist的表达情况,分析其与宫颈癌患者临床病理特征参数的相关性。结果宫颈癌组织中RACK-1阳性表达率为58.8%(50/85),高于正常组织的14.2%(12/85),差异有统计学意义(P<0.05)。宫颈癌组织中Twist阳性表达率为62.4%(53/85),高于正常组织的11.8%(10/85),差异有统计学意义(P<0.05)。RACK-1阳性表达与宫颈癌患者的淋巴结转移、分化程度、国际妇产科联盟分期、脉管瘤栓形成、深肌层浸润均有关(P<0.05)。Twist阳性表达与宫颈癌患者的淋巴结转移、脉管瘤栓形成相关(P<0.05)。在宫颈癌组织中,RACK-1与Twist蛋白的表达呈显著正相关(r=0.469,P<0.05)。结论 RACK-1、Twist高表达与宫颈癌的发生、发展及转移密切相关,RACK-1、Twist可能成为治疗宫颈癌的潜在靶点。