白内障晶状体核蛋白质组学的初步研究

目的研究年龄相关性白内障晶状体核不同组分晶状体蛋白的组成。方法取12例年龄相关性白内障晶状体软核,提取晶状体核中的水溶性蛋白及尿溶性蛋白进行二维电泳及UPD-蛋白质染料染色试剂盒对凝胶染色后,用Image Master2D Platinum6.0软件对获得的蛋白图谱进行分析,再利用MALDI-TOF MS分析及数据库搜索对差异表达的蛋白质点进行鉴定。结果二维电泳结果显示,年龄相关性白内障晶状体核中水溶性蛋白和尿溶性蛋白大部分为相对分子质量14400~97400,pI5~9。高丰度蛋白质斑点相对分子质量分布在20000~31000,pI6~8区域内。年龄相关性白内障晶状体核水溶性蛋白二维电泳图识别出31个蛋白质斑点,尿溶性蛋白二维电泳图识别出26个蛋白质斑点,相差2倍以上表达的差异点有14个。对选取的蛋白质斑点进行MALDI-TOF MS分析,经数据库检索后鉴定出6种蛋白质,其中3种蛋白质表达下调（γS-晶状体蛋白、βA3-晶状体蛋白、βA4-晶状体蛋白）,1种蛋白质表达上调（βB1-晶状体蛋白）,2种蛋白质表达缺失（截取的人βB1-晶状体蛋白A链、截取的人γD-晶状体蛋白X链）。结论年龄相关性白内障晶状体核不同组分晶状体蛋白中主要由β-晶状体蛋白组成,与尿溶性晶状体蛋白相比,水溶性蛋白鉴定出γD-晶状体蛋白,而βA4-晶状体蛋白阙如。     

二维电泳联合质谱技术鉴定水溶性晶状体蛋白

目的 应用二维电泳结合质谱分析分离鉴定水溶性晶状体蛋白及观察乙酰化修饰后的γ晶状体蛋白的变化。方法 分别从小鼠及小牛晶状体获得水溶性晶状体蛋白质，并经凝胶过滤层析分离出牛γ晶状体蛋白，进行体外乙酰化；将各晶状体蛋白样品进行二维电泳（2DE），经染色，照相和图像分析，进一步用胰蛋白酶消化，基质辅助激光解吸电离质谱分析鉴定各晶状体蛋白。结果 在2DE电泳图谱上，小鼠水溶性晶状体蛋白有20余个斑点，各晶状体蛋白的相对分子质量多位于18000-30000D范围，主要已鉴定的α，β和γ晶状体蛋白，分别占19%，43%和36%，来自小牛的γ晶状体蛋白主要有5个斑点，其中3个大的点（γB，γD和γs)占总量的90%，体外乙酰化后，带负电荷的斑点数明显增多。结论 2DE结合生物质谱技术是分离鉴定晶状体蛋白的有效手段。并能对其修饰进行分析研究。     

运用双向荧光差异凝胶电泳分析人类年龄相关性核性白内障和正常晶状体核的蛋白质组学差异

目的 鉴定年龄相关性核性白内障(age-related nuclear cataract,ARNC)和正常晶状体核蛋白质组学差异.方法 用强解聚试剂分别溶解7只不同程度ARNC晶状体核和7只正常晶状体核,提取总蛋白,Bradford法测定蛋白浓度.通过双向荧光差异凝胶电泳(two-dimensional fluorescence difference in-gel electrophoresis,2-D DIGE)、Decyder 6.5软件分析电泳图谱,寻找差异蛋白质点.差异蛋白质点随后用激光辅助解吸/电离飞行时间(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight,MALDI-TOF)质谱仪鉴定.结果 2-D DIGE结果显示,和正常晶状体核样品相比,39个点的蛋白含量在ARNC样品中显著减少(P＜0.05).MALDI-TOF质谱成功鉴定其中36个蛋白质点,它们分属于9个不同的蛋白质,其中6个蛋白(αA-、βA3-、βA4-、βB1-、γD-晶状体蛋白和一个来自CRYGS家族的未知蛋白DKFZp434A0627)的含量随着ARNC程度的增加而逐渐减少；其他3种蛋白(αB-晶状体蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶和视黄醛脱氢酶1)未呈现这种递减趋势.结论 3-磷酸甘油醛脱氢酶、视黄醛脱氢酶1以及某些晶状体蛋白的减少可能参与ARNC的形成.     

兔α-晶状体蛋白的分子伴娘功能的研究

目的 了解兔α-品状体蛋白是否具有分子伴娘功能。方法凝胶过滤法分离水溶性晶状体蛋白。在550C高温条件下,观察α-晶状体蛋白是否能抑制β-low晶状体蛋白的凝集和变性;观察α-晶状体蛋白是否能抑制糖基化诱导的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)的失活,均以牛血清白蛋白(BSA)作为对照。结果 α-晶状体蛋白能抑制热诱导的p—low晶状体蛋白的凝集和变性;α-晶状体蛋白亦能抑制糖基化诱导的G6PD的失活;而牛血清白蛋白却无此作用。结论 α-晶状体蛋白具有分子伴娘功能。     

囊袋阻滞综合征患者囊袋内积聚液体及后发性白内障囊膜的蛋白质组成分析

目的　鉴定白内障术后囊袋阻滞综合征（capsular block syndrome,CBS）患者囊袋内积聚液体以及后发性白内障囊膜的蛋白质组成。方法　选取我院就诊的5例白内障超声乳化吸出联合人工晶状体植入术后CBS患者,继发青光眼且合并后发性白内障,吸出人工晶状体和后囊之间积聚的液体,撕除混浊的后发性白内障囊膜,用强裂解液提取蛋白质,进行液相色谱串联质谱鉴定分析,确定蛋白质组成,并根据Mascot搜索数据结果估算各成分的相对含量。所得蛋白质组成数据与同龄白内障患者晶状体皮质和晶状体上皮细胞的蛋白质主要组成进行比较及分析。结果　本研究中CBS患者人工晶状体和后囊之间积聚的液体和后发性白内障囊膜蛋白质组成中,含量较高（前10种）有细胞骨架类蛋白:晶纤蛋白、肌动蛋白、波形蛋白、锚蛋白2;晶状体蛋白:αA-晶状体蛋白、βB1-晶状体蛋白、αB-晶状体蛋白;葡萄糖代谢相关蛋白:三磷酸甘油醛脱氢酶、促进性葡萄糖转运蛋白;热休克蛋白A5。晶状体上皮细胞含量丰富的蛋白质（前15位）包含上述成分中的αA-晶状体蛋白、αB-晶状体蛋白、波形蛋白、肌动蛋白以及三磷酸甘油醛脱氢酶;而晶状体皮质检测到的含量较高的蛋白主要是各种晶状体蛋白,包含CBS患者囊袋内积液和后发性白内障囊膜组成中的βB1-晶状体蛋白、αA-晶状体蛋白、αB-晶状体蛋白。结论　CBS积聚的液体和后发性白内障囊膜主要蛋白质组成与晶状体上皮细胞更加相似,它们可能参与CBS囊袋内液体的积聚以及此种后发性白内障的形成。     

先天性白内障患者和正常人晶状体蛋白质组的差异分析

目的 鉴定并分析先天性白内障患者和正常人晶状体之间蛋白质表达的差异.方法 取10例(20眼)先天性白内障晶状体及8例(8眼)正常透明晶状体,提取晶状体核中的水溶性蛋白行二维电泳及考马斯亮蓝凝胶染色后,用Image Master 2D Platinum 5.0软件对获得的蛋白图谱进行分析,再利用MALDI-TOF-MS分析及数据库搜索对差异表达的蛋白质点进行鉴定.ELISA法检测差异蛋白的含量.结果 二维电泳结果显示,先天性白内障和正常晶状体蛋白均分布在相对分子质量为14 400 ～97 400、pI5～9区域内;高丰度蛋白质斑点分布在相对分子质量20000 ～ 31000、pI 6 ～8区域内.正常透明晶状体核水溶性蛋白二维电泳图识别出34个蛋白质斑点,先天性白内障蛋白二维电泳图识别出31个点有4个.对选取的蛋白质差异斑点进行MALDI-TOF-MS分析,经数据库检索后鉴定出4种蛋白质,分别为βA3晶状体蛋白、βB1晶状体蛋白、截断的βB1晶状体蛋白和αB晶状体蛋白.ELISA结果显示,正常晶状体βA3、αB和βB1晶状体蛋白质量浓度分别为(2.20±0.15)g·L-1、(0.85±0.08)g·L-1、(0.72±0.05)g·L-1,而先天性白内障βA3、αB和βB1晶状体蛋白质量浓度为(1.60±0.09)g·L-1、(1.02±0.09)g·L-1、(0.59±0.07)g·L-1.先天性白内障αB晶状体蛋白较正常对照含量上调,βA3和βB1晶状体蛋白含量下调.结论 αB晶状体蛋白上调、βA3和βB1晶状体蛋白含量下调可能与先天性白内障的发病相关.     

年龄和离体翻译后修饰对兔α-晶状体蛋白分子伴娘活性的影响

目的：探讨年龄和离体翻译后翻译对兔α－晶状体蛋白分子伴娘活性的影响。方法：（1）用凝胶过滤法分离幼年、成年和老年3个组兔水溶性晶状体蛋白,观察不同年龄兔α－晶状体蛋白蛋白抑制β-low晶状体蛋白凝集和变性作用的程度差异。（2）孵育α－晶状体蛋白使之氧化和糖基化,观察修饰和未修饰的α－晶状体蛋白抑制β-low晶状体蛋白凝集和变性作用的程度差异。结果：（1）3个年龄组α－晶状体蛋白抑制热诱导β-low晶状体蛋白抑制凝集和变性作用的程度差异有显著意义（F＝29．100,P＜0．01）,成年组兔α－晶状体蛋白的抑制作用强于老年组,弱于幼年组,差异有显著意义（q＝4．1924,4．339,P＜0．05）。（2）离体氧化和糖基化修饰的α－晶状体蛋白抑制β-low晶状体蛋白凝集和变性的作用均弱于未修饰的α－晶状体蛋白,差异有显著意义（q＝26．9171,11．6404;P＜0．01）。结论：（1）随着年龄的增加,兔α－晶状体蛋白的分子伴娘活性呈下降趋势。（2）离体翻译后修饰可使兔α－晶状体蛋白的分子伴娘活性下降。     

晶状体蛋白的翻译后修饰

晶状体蛋白（α-、β-、γ-晶状体蛋白）可发生翻译后修饰,且在不同的位点发生不同类型的翻译后修饰,从而影响晶状体蛋白的功能.部分翻译后修饰不仅增加晶状体蛋白的不溶性,也改变晶状体蛋白的构象,最终促进白内障的形成;有些翻译后修饰则与白内障的形成无关,可能与晶状体蛋白的发育或保护作用有关.研究晶状体蛋白的翻译后修饰及调控,对深入了解晶状体发育、衰老、白内障形成等过程有重要意义.就其在蛋白质水平上阐明有关晶状体的生理及病理过程进行综述.     

糖基化对α-晶状体蛋白的修饰和分子伴侣活性的降低

目的　研究糖基化对 α-晶状体蛋白分子伴侣活性的作用。方法　分离牛晶状体α-晶状体蛋白 ,分别与 0 .5 mol· L- 1 果糖和 0 .5 m ol· L- 1 葡萄糖在 37℃温育 ,在第 0、2 4、32天测定 380 nm的光吸收值和 40 0 nm非色氨酸荧光值 ,高压液相色谱 ( high performanceliquid chrom atography,HPL C)和 SDS- PAGE评价蛋白质交联程度 ,采用过氧化氢酶( catalase,CAT)和βL-晶状体蛋白的热凝聚光散射值 ,作为α-晶状体蛋白的分子伴侣活性指标。结果　果糖和葡萄糖可导致时间依赖性 α-晶状体蛋白在 380 nm吸收值的增加 ,非色氨酸荧光值升高 ;HPL C和 SDS- PAGE提示糖与α-晶状体蛋白形成交联复合物。果糖较葡萄糖作用明显。糖基化导致 α-晶状体蛋白抑制 CAT和 βL-晶状体蛋白热凝聚作用降低 ,孵育第 2 4天 ,葡萄糖组α-晶状体蛋白分子伴侣活性分别降低约 12 %和 19% ,果糖组约7%和 9% .结论　糖基化导致 α-晶状体蛋白形成高分子聚合物、凝聚、交联 ,分子伴侣活性丧失 ,这在老化和糖尿病性白内障形成过程中起重要作用。     

离体氨甲酰化诱导α-晶体蛋白分子伴侣活性的丧失

目的:研究氨甲酰化作为晶状体蛋白质重要的翻译后修饰,对α-晶体蛋白分子伴侣活性的作用。方法:分离牛晶状体αL和βL-晶状体蛋白。αL-晶状体蛋白分别与不同浓度的[14C]氰酸钾温育1至7 d,采用三氯醋酸沉淀法测定αL-晶状体蛋白与[14C]氰酸基团的结合率。αL-晶状体蛋白分别与50和100 mmol.L-1氰酸钾37℃温育3至7 d,测定αL-晶体蛋白抑制βL-晶状体蛋白热凝聚的分子伴侣活性,高效液相色谱法(HPLC)分析αL-晶状体蛋白的氨甲酰化作用。结果:αL-晶状体蛋白与[14C]氰酸基团的结合率和离体氨甲酰化诱导的α-晶状体蛋白伴侣活性的降低呈剂量和时间依赖性。伴侣活性的降低与较高氰酸基团的结合相一致。与对照相比,100mmol.L-1氰酸钾温育7 d导致αL-晶体蛋白伴侣活性几乎殆尽。.HPLC结果提示与氰酸钾温育3 d后可发生剂量依赖性αL-晶体蛋白的凝聚。结论:离体氨甲酰化通过高分子量凝聚物的形成修饰α-晶体蛋白,氨甲酰化诱导α-晶体蛋白的凝聚可能导致其伴侣活性的丧失。     

Strabisme Alternant - Etude clinique - traitement

The author defines motor and sensory alternation: the term alternation should not be used in isolation, it should always be accompanied by the name of the parameter concerned. Sensory alternation is always found together with motor alternation but the reverse is not true.The examining criteria for a diagnosis of sensory alternation are given, sensory alternation must not be confused with alternating inhibition. Working from clinical observations of cases of motor alternating strabismus, the author selects 2 types of binocular sensory relations which allow one to differentiate between:- cases of primary alternating strabismus- cases of secondary alternating strabismusThese forms will develop in different ways; in both cases a cure is possible providing that the right treatment is prescribed and once prescribed carefully followed, etc. It is always a case of serious forms of strabismus whose developmental period is spread over several years.According to the authors, the frequency of cases of true primary strabismus is from 1–3%, the frequency of cases of secondary alternating strabismus varies according to the type of therapy practised on cases of monocular strabismus with amblyopia. These latter will become cases of alternating strabismus under the influence of certain types of therapy carried out over several years (penalization, rocking, alternated occlusion, etc...).Experimental data on kittens confirm clinical data; kittens placed in abnormal environments during the sensitive period will show modification in the distribution of cortical cells and the absence of binocular cells (either because the excitation of the two eyes was not simultaneous, or not identical: artificial strabismus, occlusion, opaque glasses). This disturbances become irreversible after a certain period of exposure (a function of age, length of exposure, etc...).It is thus necessary to bear in mind: 1) the iatrogenic risks of certain orthoptic treatments, 2) the necessity for a binocular form of treatment as soon as possible, as once a certain stage is passed, cortical plasticity diminishes and the elaboration of normal binocular relations becomes impossible.

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Effects of Adenosine Agonists on Intraocular Pressure and Aqueous Humor Dynamics in Cynomolgus Monkeys

The effects of single or multiple topical doses of the relatively selective A₁adenosine receptor agonists (R)-phenylisopropyladenosine (R-PIA) and N⁶-cyclohexyladenosine (CHA) on intraocular pressure (IOP), aqueous humor flow (AHF) and outflow facility were investigated in ocular normotensive cynomolgus monkeys. IOP and AHF were determined, under ketamine anesthesia, by Goldmann applanation tonometry and fluorophotometry, respectively. Total outflow facility was determined by anterior chamber perfusion under pentobarbital anesthesia. A single unilateral topical application of R-PIA (20–250 μg) or CHA (20–500 μg) produced ocular hypertension (maximum rise=4.9 or 3.5 mmHg) within 30 min, followed by ocular hypotension (maximum fall=2.1 or 3.6 mmHg) from 2–6 hr. The relatively selective adenosine A₂antagonist 3,7-dimethyl-1-propargylxanthine (DMPX, 320 μg) inhibited the early hypertension, without influencing the hypotension. Neither 100 μg R-PIA nor 500 μg CHA clearly altered AHF. Total outflow facility was increased by 71% 3 hr after 100 μg R-PIA. In conclusion, the early ocular hypertension produced by topical adenosine agonists in cynomolgus monkeys is associated with the activation of adenosine A₂receptors, while the subsequent hypotension appears to be mediated by adenosine A₁receptors and results primarily from increased outflow facility.