荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌的实验研究

目的　利用LightCycler建立一种简便、特异的荧光定量PCR检测方法 ,用于鼠疫耶尔森氏菌的快速检测。 方法　采用SYBRGreenI随机掺入法 ,以Roche试剂盒为标准 ,比较两公司的DNA聚合酶 ,用鼠疫菌 310 0 4建立荧光PCR反应体系 ;针对鼠疫耶尔森氏菌特异的染色体标识序列和质粒上F1抗原基因设计引物 ,检测其灵敏度和特异性 ,以盲测试验进行验证 ;在此基础上鉴定 2 75株鼠疫耶尔森氏菌 ,并测试该法检测脏器污染模拟标本的灵敏度。结果　建立以一个公司试剂为主较低成本的PCR反应体系 ;EV76的检测灵敏度可达每反应体系 1.6个菌 ;检测我国 18个生态型共计 2 75株鼠疫耶尔森氏菌及 2 8株非鼠疫菌株的PCR扩增结果表明 ,鼠疫菌株均出现特异的扩增结果 ,2 8株对照菌株均为阴性 ;肝、脾、肺模拟标本检测灵敏度可达每反应体系 4 0 0 0个菌。结论　该方法对于检测鼠疫耶尔森氏菌具有简便、快捷、高敏感性和特异性的特点 ,适用于鼠疫紧急疫情时的快速诊断和疫源地监测     

鼠疫耶尔森菌pla抗原基因芯片检测法的验证

目的检验鼠疫耶尔森菌pla抗原基因芯片检测法的准确性。方法针对鼠疫耶尔森菌pPCP1质粒上pla抗原基因中保守性片段,设计合成探针,制备尼龙膜基因芯片,用于检测在镇赉国家级鼠疫监测点采集到的达乌尔黄鼠肺、肝、肾样本154份,然后用鼠疫caf1基因PCR扩增法复检基因芯片阳性样品。结果基因芯片共检测出18份样本呈阳性反应,而caf1基因PCR法却发现这些样品均为阴性。结论在鼠疫耶尔森菌pPCP1质粒上的pla抗原基因不易用于鼠疫耶尔森菌的特异性检测,该抗原可同其它特异性抗原联合应用,提高检测的准确性。     

用4对引物聚合酶链式反应检测鼠疫耶尔森氏菌的实验研究

目的用4对引物聚合酶链式反应(以下简称4-Prim er-PCR)来检验鼠疫耶尔森氏菌,对于探索鼠疫的快速诊断方法将起到推动作用。方法选择不同疫源地的40株鼠疫耶尔森氏菌;目的基因选择于与鼠疫耶尔森氏菌毒力因子有关的FI抗原质粒基因cafI鼠疫杆菌素Ⅰ基因、与色素沉着有关的质粒基因hm s以及染色体基因inv。结果该法所有的鼠疫耶尔森氏菌全部出现4对引物的预期扩增带;该试验在4 h内完成;结论四对引物鼠疫PCR法具有快速、特异、敏感等优点,可以用于鼠疫的快速诊断和流行病学调查。     

不同PCR联合用于鼠疫耶尔森菌的检测

目的 建立一种用4对不同引物快速鉴定鼠疫耶尔森菌的PCR方法。方法 分别采用4对针对V抗原，cafl，pla和inv4种基因的引物，在4只管中进行相同循环参数的扩增。结果 用这4对引物能特异性地扩增出鼠疫耶尔森菌217，478，524，295bp的目的DNA片段。结论 该法可用于鼠疫耶尔森菌简便、快速和准确的检测。     

分子生物学方法鉴定四川省德格县鼠疫菌株

目的对四川省德格县更庆乡上压巴地区从自毙喜马拉雅旱獭体内分离到2株疑似鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌)进行实验室诊断及鉴定。方法采用PCR技术,检测鼠疫菌特异基因,并进行基因分型。结果鉴定的2株菌具有鼠疫菌的特异标识序列3a和鼠疫菌的质粒基因Pla、calf、LcrG;DFR谱中均缺失DFR1、DFR2、DFR13、DFR23。结论本次鉴定的2株菌均为喜马拉雅旱獭型鼠疫杆菌。     

鼠疫耶尔森氏菌inv基因中IS1541的研究及应用

目的　了解鼠疫耶尔森氏菌 inv基因中 IS15 41的插入情况 ,为鼠疫耶尔森氏菌的鉴别诊断提供依据。方法　 PCR反应及 Southern杂交分析。结果　对来自不同疫源地的 5 0株鼠疫耶尔森氏菌的 inv基因中部分序列进行扩增 ,均可扩出一条长为 10 0 0 bp的片段 ,用 IS15 41作探针 ,对其进行 Southern杂交分析 ,杂交结果无差别 ,而对照菌株除假结核耶尔森氏菌扩出一条长约 30 0 bp左右的片段外 ,其它均为阴性。结论　鼠疫耶尔森氏菌 inv基因高度同源 ,其间均有 IS15 41插入 ;该方法有助于鼠疫耶尔森氏菌与其它菌株的鉴别诊断     

不同方式重组表达鼠疫caf1M蛋白的研究

目的对比不同方式克隆表达鼠疫耶尔森氏菌caf1M蛋白的存在状态及免疫学活性。方法分别选择3种不同载体pET32a(+)、pGEX4t-1、pGBTNH,克隆表达鼠疫caf1M蛋白;并以鼠疫菌免疫血清分别检测其免疫学活性。结果成功构建了4个重组质粒,分别是含去除信号肽编码序列caf1M基因的3个质粒载体,及1个含有完整caf1M基因的pGEX4t-1表达质粒;4个质粒经诱导均在大肠杆菌中得到高效表达;存在状态分析表明,含有去除信号肽编码序列caf1M基因的pGEX4t-1表达的重组蛋白以可溶方式存在,其余3种以包涵体形式存在;重组蛋白与鼠疫菌免疫血清的Western blot分析表明,除pGBTNH表达的蛋白存在非特异反应外,其余3种重组蛋白都发生特异性反应。结论成功克隆表达了4种鼠疫菌caf1M蛋白,其中3种具有良好的特异性免疫反应性;信号肽序列及载体都对重组caf1M蛋白的表达有影响。     

广西鼠疫耶尔森菌质粒图谱及分子流行病学意义

目的分析广西鼠疫耶尔森菌株质粒DNA种类,从分子水平探讨其流行病学意义。方法采用Kado改良法提取质粒,经琼脂糖凝胶电泳。结果从广西鼠疫自然疫源地分离到31株鼠疫耶尔森菌含有pYC、pPst/pPCP1、pYV/pCD1、pFra/pMT1和尚未明确其类型的111.36×106(相对分子质量,Mr)5种质粒。其中有29株由pYC、pPst/pPCP1、pYV/pCD1、pFra/pMT14种质粒组成,1株由pYC、pPst/pPCP1、pYV/pCD1、111.36×106(Mr)4种质粒组成,另一株由pYC、pPst/pPCP1、pYV/pCD13种质粒组成。结论广西鼠疫耶尔森菌株含有pYC、pPst/pPCP1、pYV/pCD1、pFra/pMT1和尚未定型的111.36×106(Mr)5种质粒,与云南省南部、东南部和贵州省鼠疫耶尔森菌株的质粒图谱相同。     

双重PCR和RAPD技术在宁夏鼠疫菌鉴定中的应用研究

目的应用多重PCR和RAPD结合鼠疫常规检测方法对可疑鼠疫菌和自毙鼠脏器进行鉴定,应用多种实验室检测方法联合检测和鉴定鼠疫菌,为科学、快速、有效地判定鼠疫疫情提供实验室支持。方法采用双重PCR对2009年宁夏2个鼠间鼠疫监测点分离获得的可疑菌株和部分自毙鼠脏器进行目标基因fra和pla片段扩增,并利用RAPD技术对2个监测点分离获得的鼠疫菌进行随机引物扩增基因表征分析。结果共分离获得16株菌,所有菌株扩增出2条目标条带,分别为249 bp和456 bp。自毙鼠脾脏扩增出目标基因,肝脏扩增的目标基因条带较弱。RAPD显示所有菌株的扩增条带一致,表明此次分离得到的鼠疫菌株未发生变异。结论双重PCR可作为实验室快速诊断和迅速判定鼠疫疫情的有效方法,用RAPD法筛选的鼠疫菌扩增的随机引物可为确定宁夏分离鼠疫菌株的标识图谱提供参考。     

基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌

目的 实现荧光定量PCR技术在鼠疫现场和基层的应用。方法 本试验将已建立的基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR方法应用于我国各鼠疫疫源地野生菌株的检测,进行特异性评价。选取分布于我国境内不同鼠疫疫源地野生鼠疫耶尔森氏菌株、鼠疫减毒菌株、耶尔森菌属近缘菌株假结核菌及小肠结肠炎菌进行荧光定量PCR检测。结果 55株鼠疫耶尔森氏菌及鼠疫减毒菌株扩增阳性,假结核耶尔森氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌无阳性扩增,冻干试剂在室温25 ℃和37 ℃条件下可保存6个月,敏感性与冷冻保存无差异,核酸扩增诊断可在1 h内完成。结论 应用基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR方法对我国各鼠疫疫源地55株鼠疫耶尔森氏菌检测呈现高度特异性,本试验冻干试剂具有可室温保存、便于运输、检测结果精准、快速等特点,具有较好的鼠疫现场应用前景。     

鼠疫耶尔森菌caf1基因缺失株体外生物学特性和对小鼠致病性分析

目的 探索caf1基因缺失对鼠疫耶尔森菌体外生物学特性与对小鼠致病性的影响。方法 利用CRISPR/Cas12a介导的基因编辑技术构建鼠疫耶尔森菌caf1基因缺失株,并通过PCR技术对caf1基因缺失验证。比较鼠疫耶尔森菌caf1基因缺失株和野生株201在生长速率、液体培养状态、聚集情况等体外生物学特性和对小鼠致病性等方面的差异。结果 PCR扩增结果证实,caf1基因缺失株构建成功。体外生物学特征分析表明,与野生株相比,caf1基因缺失株的形态学和生长速率并未发生明显变化,自凝聚率升高。肺递送途径LD₅₀分析表明,caf1的缺失导致鼠疫耶尔森菌气溶胶感染小鼠半数致死剂量显著降低。结论 不同途径感染结果表明,caf1基因缺失株相较于野生株,在肺递送、滴鼻、皮下、尾静脉注射4种途径下对BALB/c小鼠的毒力均降低。caf1基因的缺失导致鼠疫耶尔森菌自凝聚率升高,对BALB/c小鼠致病性下降。     

鼠疫菌pYC质粒标识基因在动物及蚤检测中的应用

目的评价云南鼠疫菌pYC质粒标识基因的特异性及在鼠疫监测中的应用。方法应用pYC质粒标识基因引物yd1，yd2并以鼠疫菌特异性基因pla，fra作为对照进行PCR实验，观察实验室感染标本和现场样品的检出情况。结果共检测实验感染动物脏器8份，均为阳性。检测现场收集的黄胸鼠脏器22份，阳性6份，阳性率27.27%。检测感染的蚤类67份，阳性13份，阳性率19.40%，试验引物yd1，yd2与对照引物pla，fraPCR检测结果其特异性和敏感性均一致。结论将yd1，yd2引物，联合pla，fra引物，建立鼠疫PCR快速诊断方法，应用于云南、广西、贵州判断鼠疫菌、监测鼠疫信息，具有重要的实际意义。     

聚合酶链反应在鼠疫菌检测中的应用 研究

本文采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，通过扩增鼠疫菌９．５ｋｂ质粒ｐｌａ基础上一个４７８ｂｌ片段，用于鼠疫菌检测，被试的４５株鼠疫菌扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析均呈现单一ＤＮＡ带，其分子量大小与预期结果符合。而假结核菌和一株缺６ＭＤ质粒鼠疫菌未见扩增带，洽部实验可在４ｈ内完成。本法具有快速、特异、敏感等优点，可用于不同生态型鼠疫菌的快速诊断和流行病学研究．     

Phenotypical Characterization of Mongolian Yersinia pestis Strains

Although Mongolia is regarded as one of the possible places of plague radiation, only few data are available from Mongolian Yersinia pestis strains. In this study a total of 100 Mongolian Y. pestis strains isolated from wild mammals and their parasites between the years 1960 and 2007 were analyzed for their phenotype. All strains grew well on selective Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin agar and were positive for the F1-antigen, the F1-gene (caf1), and the plasminogen activator gene (pla). Biochemical analyses using the API20E? system identified 93% of the strains correctly as Y. pestis. The BWY in-house system consisting of 38 biochemical reactions was used to differentiate among Y. pestis subspecies pestis biovars Antiqua and Medievalis and also between the subspecies microtus biovars Ulegeica and Caucasica. Antibiotic susceptibility testing according to Clinical and Laboratory Standards Institute-guidelines identified one strain as being multiresistant. This strain was isolated from a wildlife rodent with no anthropogenic influence and thus suggests naturally acquired resistance.     

大肠杆菌肠毒素基因多重PCR检测方法的建立

目的 建立一种快速检测大肠杆菌耐热肠毒素(heat-stable enterotoxin, STa, STb)和不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin, LT-Ⅰ, LT-Ⅱ)基因的多重PCR方法。方法 参照文献合成四对可扩增产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)耐热肠毒素基因(estA、estB)和不耐热肠毒素基因(elt-Ⅰ、elt-Ⅱ)的特异性引物,通过反应条件的优化,敏感性、特异性试验和临床样品检测,建立检测大肠杆菌肠毒素的多重PCR方法。结果 用所建立的多重PCR方法可特异性扩增出estA(229 bp)、estB(480 bp)、elt-Ⅰ(605 bp)和elt-Ⅱ(300 bp)基因片段,最低检出量分别为2.55×10¹ CFU/μL、2×10¹ CFU/μL、2×10¹ CFU/μL和2.47×10³ CFU/μL。从22株大肠杆菌分离株中检测到estA基因(2/22),elt-Ⅱ基因(3/22),未检测到estB和elt-Ⅰ基因,检测结果与常规PCR检测结果一致。结论 建立了检测大肠杆菌肠毒素基因(estA、estB、elt-Ⅰ和elt-Ⅱ)的多重PCR方法,该方法具有良好的特异性和敏感性,能够满足对细菌培养物的检测要求。