FVB小鼠骨髓源树突状细胞的培养

目的 建立FVB小鼠骨髓源树突状细胞体外培养和扩增方法,观察其形态和特征.方法 在无菌条件下提取FVB鼠骨髓细胞,分离单个核细胞,用IL-4和GM-CSF联合协同诱导下培养,加用磷酸脂多糖刺激.应用光镜下观察树突状细胞的形态,流色细胞仪检测鉴定其生物学特征.结果 联合培养小鼠骨髓细胞3d后,可见细胞形态发生改变,细胞形...     

小鼠骨髓源树突状细胞的扩增及鉴定

目的建立小鼠骨髓源树突状细胞的体外扩增方法并研究树突状细胞的相关特征。方法根据不同时期树突状细胞的粘附性质不同,设计简便的树突状细胞的体外扩增和纯化方法,并利用瑞氏染色和流式细胞仪(FACS)鉴定其生物学特征。结果体外培养24 h后,可见增殖性细胞集落,3 d后集落增多明显,体外培养7 d,收集悬浮细胞即为DC。光镜显示细胞表面不规则,呈树突状突起,瑞氏染色嗜碱性。流式细胞鉴定为髓系DC,高表达MHCⅡ类分子及共刺激分子(CD40、CD80、CD83、CD86)。结论此简便方法制备的树突状细胞具有髓系树突状细胞的生物学特性,及较高的纯度,可广泛的应用于临床及实验研究。     

恒河猴骨髓来源未成熟树突状细胞的培养及鉴定

目的建立一种体外诱导恒河猴骨髓CD34+细胞分化为树突状细胞(DC)的方法,并对其细胞形态及表面标志进行鉴定。方法用免疫磁珠分选系统(MACS)分选恒河猴骨髓细胞,收集高纯度的CD34+造血干细胞;加入重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α),诱导其分化为骨髓来源的树突状细胞,并采用电镜观察细胞形态。用树突状细胞表面标志CD1a及成熟树突状细胞(mDC)表面标志CD83流式抗体染色后分析。结果细胞因子诱导6d后成功培养出表面呈绒毛状和树枝状突起的典型DC样细胞,流式细胞术分析结果显示92.35%的细胞为DC,27.61%的细胞为m DC。结论用此方法可在体外培养出高纯度且典型的恒河猴骨髓源性未成熟树突状细胞(im DC),为进一步研究其生物学特性及功能奠定了基础。     

小鼠胸腺树突状细胞的形态学观察

目的 观察小鼠胸腺树突状细胞（ＴＤＣ）的形态。方法 密度梯度离心结合小鼠ＣＤ５单抗淘洗法（ｐａｎｎｉｎｇ），分离出小鼠ＴＤＣ并行光镜及电镜观察。结果 台盼蓝排斥试验示９０％以上细胞存活，光镜下发现初分离的ＴＤＣ常和周围的胸腺细胞形成紧密的细胞簇。Ｓ－１００蛋白染色见ＴＤＣ胞体和突起内有棕黄色反应产物，ＡＮＡＥ反应呈阴性或核附近有数个小颗粒反应。ＡＴＰ酶反应阴性。电镜见细胞表面有许多树状突起，核形不     

雌二醇对人树突状细胞成熟和功能的影响

目的：研究雌二醇(17β-estradiol, E2)对人外周血来源树突状细胞(DCs)成熟和免疫学功能的影响。 方法： 在人外周血来源DC体外培养时加入两种浓度的E2 (10-7 mol/L和10-6 mol/L)处理，光镜和电镜下观察DCs的生成情况及形态变化，以流式细胞仪分析各组细胞的免疫表型，用ELISA方法测定其分泌的IL-12水平，［3H］-TdR掺入法检测体外混合淋巴细胞反应中DCs刺激同种反应性T细胞的增殖能力。 结果： 加入E2培养后, DCs树突状和膜面状伪足减少，表达低水平MHC-II分子和共刺激分子CD40、CD80和CD86，其分泌的IL-12水平明显下降，DCs刺激同种反应性T细胞的功能显著下降。 结论： E2抑制人外周血来源DC的成熟，对其免疫学功能具有负性调节作用。     

草分支杆菌对人脐血树突状细胞体外扩增的影响

背景：树突状细胞因其强大的抗原提呈能力而在机体抗肿瘤作用的中心地位逐渐受到重视,但如何能有效获得足够数量有功能的树突状细胞成为目前研究的重点,尤其是有关低毒免疫调节剂的报道较少。 目的：观察草分支杆菌F.U.36(乌体林斯,Utilins)对人脐血来源树突状细胞体外扩增的影响。 方法：应用Ficoll-Hypaque法分离人脐血单个核细胞,分别用乌体林斯,细胞因子(重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子+重组人肿瘤坏死因子α+重组人白细胞介素4),细胞因子联合乌体林斯进行干预,并以RPMI-1640培养液诱导培养人脐血单个核细胞作为对照组,诱导培养树突状细胞,并于倒置显微镜下观察其生长情况及形态。培养第9天,采用流式细胞仪检测各组人树突状细胞特异性表型CD1a及MHC-Ⅱ分子HLA-DR的变化,并将细胞涂片行瑞氏-姬姆萨染液染色,油镜下观察摄片。 结果与结论：除对照组外,实验各组均得到高表达CD1a及HLA-DR的典型树突状细胞。乌体林斯组CD1a及HLA-DR阳性细胞比例亦明显高于对照组而低于细胞因子组 (P < 0.05),联合组HLA-DR阳性细胞比例高于细胞因子组(P < 0.05)。结果提示,草分支杆菌F.U.36(乌体林斯)不仅能促进脐血树突状细胞体外扩增,还能协同细胞因子促进树突状细胞成熟。     

脐血来源的树突状细胞增强CIK细胞的杀伤作用

为确认体外诱导出的成熟脐血来源树突状细胞 (CBDC )可以引发强大抗肿瘤免疫反应 ,CBDC培养 12d后用电镜分析形态 ,用流式细胞仪检测其表型。在不同培养时间 ,用3 H TdR掺入法检测CBDC和细胞因子诱导杀伤细胞 (CIK )的扩增功能 ;用MTT法检测被CBDC激活的CIK抗肿瘤活性。结果表明 ,体外诱导出形态典型的DC ,高表达主要组织相容性抗原I、II类分子、CD5 4 ,也表达CD80、CD83、CD1a,不表达CD6 8。体外培养 12d成熟的CBDC ,能使CIK以最高的比率扩增 ,2种细胞最佳混合比为 1∶10时被激活的CIK杀伤BEL 74 0 2肝癌细胞的功能最强 ,最佳效靶比为 80∶1     

体外培养滑膜细胞形态学和吞噬作用的观察

用关节腔穿刺酶消化法和滑膜组织块种植法,分别对狗膝关节和大白鼠颞下颌关节的滑膜进行培养。作了活细胞观察;H-E、Giemsa染色及HRP摄取试验,进行光镜和电镜观察。体外培养滑膜细胞在形态上不能分型。HRP摄取试验显示滑膜细胞具有吞噬活性,似可作为体外培养滑膜细胞的分类依据.     

酵母多糖致伤MODS模型小鼠的胸腺树突状细胞病理观察

目的 研究树突状细胞在MODS免疫器官损伤中的病变特点。方法 运用光镜、电镜与免疫组化(CD1a、CD205及MIDC-8标记)方法,观察小鼠MODS模型中胸腺树突状细胞的变化特点。结果 致伤早期胸腺树突状细胞大量增生、机能活跃伴淋巴细胞大量凋亡;在缓解期(3～7天)胸腺及树突状细胞恢复正常;MODS期(8～12天)树突状细胞数量再次增加,但功能减弱。同时伴有较多树突状细胞和淋巴细胞变性凋亡。结论 树突状细胞病变是MODS免疫系统损伤的首发病变,树突状细胞的数量与机能变化与MODS模型病程具有高度平行,提示树突状细胞病变与MODS启动机制和病程转归有重要关系。     

尖锐湿疣皮损中朗格汉斯细胞的变化

目的了解尖锐湿疣(CA)皮损中朗格汉斯细胞(LC)的变化。方法采用免疫组化法对34例CA皮损进行LC染色,光镜下观察其形态和数量变化,并对其中6例标本行电镜观察。结果与正常皮肤相比,CA皮损表皮内LC分布不规则,少见典型的树突状细胞,细胞突明显减少、缩短或消失,半定量计数显示CA皮损中LC为(13.15±9.42)个,较正常明显降低(P<0.01)。超微结构表明LC中的特征性结构———朗格汉颗粒(LG)不仅数目减少,而且形态也不典型。结论CA皮损中LC形态及数量均发生变化,可能在CA的发病中起着一定作用。     

IL-3对小鼠骨髓来源树突状细胞分化发育的影响

比较 GM- CSF IL- 4与 IL- 3 IL- 4两种方法培养制备的树突状细胞 (Dendritic cell,DC)在形态、产量、免疫表型和抗原摄取能力方面的差异。用 GM- CSF IL- 4和 IL- 3 IL- 4分别诱导小鼠骨髓来源的前体细胞分化为成熟树突状细胞 ,通过相差显微镜、扫描电镜、激光共聚焦扫描显微镜进行形态观察 ,流式细胞术分析细胞免疫表型和摄取抗原能力。结果表明 ,IL- 3 IL- 4诱导的 DC产量高 ,细胞纯度好 ,形态上与 GM- CSF IL- 4诱导的DC类似 ;细胞免疫表型显示高表达 MHC 类分子 ,但低表达或不表达 CD80、CD86 ;IL- 3 IL- 4诱导的 DC具有强大的摄取抗原能力。 IL- 3替代 GM- CSF可诱导低表达共刺激分子的耐受型 DC     

体外诱导扩增大鼠树突状细胞及其特性鉴定

目的: 体外诱导和扩增大鼠骨髓树突状细胞 (DC)的方法, 并进行生物学特性鉴定。方法: 将大鼠骨髓细胞培养 48h后, 去除悬浮细胞, 加入IL- 4和GM- CSF培养 2wk。在光镜和透射电镜下观察培养的DC的形态学特征。应用流式细胞仪检测DC表面分子MHC-Ⅱ类分子、B7 -1、B7- 2的表达水平。将DC与同种异体T细胞混合培养, 采用MTT比色法测定不同细胞密度的DC刺激同种T细胞增殖的能力。结果: 培养的DC胞浆突起大而长, 呈树突状, 具有DC的典型形态。培养 2wk的DC表面MHC -Ⅱ类分子表达的阳性率为 74. 2%, B7- 1、B7 -2分别为 81%、76%。培养的DC具有明显刺激同种异体T细胞增殖的能力。结论: 将大鼠骨髓细胞经贴壁去除悬浮的细胞, 加入IL -4和GM -CSF培养, 可获得足量、较高纯度的DC, 为研究DC的功能奠定了基础。     

HCV C-Fc基因转染的小鼠树突状细胞促进混合淋巴细胞反应的作用

目的：观察HCVC-FC基因电穿孔法转染的小鼠树突状细胞(DC)功能的改变。方法：分离小鼠骨髓单个核细胞与rmGM-CSF和rmIL-4培养1wk，对培养的细胞进行形态学观察．并用FACS检测细胞表面DEC205的表达。以通过质粒pcD一NA3HCV C—Fc电穿孔法转染培养的DC，用间接免疫荧光染色测定转染细胞中HCV C—FC的水平；用混合淋巴细胞反应检测电穿孔法转染细胞的功能。结果：培养1wk后，得到具有典型DC形态的细胞，以质粒pcDNA3HCV c-FC为载体电穿孔法转染DC后，转染细胞中可检测到较高水平的HCVC—Fc2与对照组相比较以电穿孔法转染的细胞能明显刺激混合淋巴细胞反应：结论：小鼠骨髓单个核细胞加GM-CSF和IL-4培养1wk，可生成大量的DC。质粒pcDNA3HCV c-Fc转染培养的DC对T细胞刺激作用显著增强。     

Developing dendritic cells become 'lacy' cells packed with fat and glycogen

On maturation, dendritic cells (DCs) become highly active cells equipped for antigen uptake, migration and clustering and activation of T cells. We therefore asked whether DCs acquire fat and glycogen stores as they mature. DCs were generated from mouse bone marrow stem cells by culturing with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) for 7-8 days. Stimulation of the DCs with lipopolysaccharide (LPS) for the last 24 hr of culture, or exposure to 1-15 ng/ml of interleukin (IL)-4 during development, resulted in production of DCs not only with an increased ability to stimulate T cells but also with an increasingly lacy appearance on transmission electron microscopy, with multiple unstained areas in the cytoplasm. This changed morphology was associated with the presence of increasing amounts of fat and glycogen, identified by Sudan Black and periodic acid leukofushin/Schiff (PAS) staining, respectively. Lacy DCs up-regulated type 1 and type 2 scavenger receptors, providing possible mechanisms contributing to these changes. Lacy DCs were found occasionally amongst freshly isolated splenic and lymph node DCs. DCs can be isolated from human adipose tissue, and we tested whether lacy DCs acquiring fat and glycogen were present in mouse omentum. CD45+ cells migrating from the omentum expressed specific DC markers CD11c and 33D1, costimulatory molecules and major histocompatibility complex (MHC) class II, and most showed darkly staining fat inclusions. Thus, during development, DCs can acquire large amounts of fat and glycogen, accumulation of which is promoted by antigen exposure and modulated by the cytokine milieu and location, and which may act as a link between energy stores and immune function.     

狼疮鼠骨髓树突状细胞的分离培养和免疫学特性

目的对狼疮鼠骨髓树突状细胞进行分离、培养并分析其免疫学特性,为进一步研究和应用狼疮鼠骨髓来源树突状细胞（DC）奠定基础。方法分离、纯化6周龄雄性BXSB狼疮鼠骨髓单核细胞,以含10%胎牛血清、2ng/ml重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和20ng/ml重组小鼠白细胞介素-4的RPMI-1640培养基培养,以脂多糖（LPS,1μg/ml）刺激24h体外诱导BXSB狼疮鼠骨髓细胞分化为DC,倒置显微镜动态观察细胞形态学变化,流式细胞仪分析细胞表面分子,混合淋巴细胞反应检测其刺激T细胞增殖能力。结果经体外诱导培养第2～8天可见大量细胞集落形成,培养的DC具有典型树突状形态,同时DC可显著刺激同种异体混合淋巴细胞增殖。结论体外诱导培养可稳定获得BXSB狼疮鼠骨髓来源DC。     

人树突状细胞体外提呈与EB病毒感染相关肿瘤抗原的研究

目的建立从人骨髓造血前体细胞体外培养扩增树突状细胞的方法 ,制备 EBV感染介导的相关肿瘤 (如何杰金氏病、鼻咽癌和 Burkitt's淋巴瘤等 )的疫苗。方法采用 Mini- MACS分离技术从正常人骨髓分离 CD34+ 造血干 /祖细胞 ,体外以重组细胞因子组合诱导培养 2周 ,同种混合淋巴细胞反应检测扩增 DCs的 T淋巴细胞刺激活性。结果从正常人骨髓分离得到高纯度 (>90 % )的 CD34+造血干 /祖细胞 ,经重组 h GM- CSF、h TNF- α、h IL- 3、h IL- 4的共同诱导培养 ,扩增得到大量DCs。扩增的 DCs表面具有不规则突起 ,高表达共刺激分子 CD1α,对同种异体 T淋巴细胞具有很强的刺激活性 ,负载抗原后刺激活性进一步增强。结论人 CD34+ 造血干 /祖细胞体外经 h GM- CSF、h TNF-α、h IL - 4、h IL - 3共同诱导培养 ,可生成大量功能成熟的 DCs,并可有效提呈与 EBV感染相关肿瘤的抗原 ,可望用于 EBV感染介导相关肿瘤的疫苗治疗。     

Generation and function of bone marrow-derived dendritic cells from CD4/CD8(-/-) double-knockout mice.

We present a novel, simple and straightforward method to obtain mouse bone marrow-derived dendritic cells (DC) from C57Bl/6 CD4/CD8(-/-) double knock-out mice. This new method, involving culture of bone marrow cells in medium supplemented with Interleukin 4 and Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor, does not involve negative immunodepletion of CD4+ and CD8+ populations, or extensive prior manipulations of the starting population. The resulting, loosely adherent cell population, exhibited the morphological characteristics and typical surface markers of DCs, and were endowed with the functional activities characteristic of bone marrow-derived DCs of wild-type mice. Interestingly, LCMV GP33-41 peptide-loaded CD4/CD8(-/-) DCs were efficiently lysed by peptide-specific activated CTLs in vitro. Furthermore, these peptide-loaded CD4/CD8(-/-) DCs induced a peptide-specific CTL response upon immunization of wild-type C57Bl/6 mice.     

主动入侵的疟原虫子孢子通过CSP蛋白诱导DC成熟

目的观察约氏疟原虫子孢子能否诱导DC成熟,并探讨其机制。方法GM-CSF常规诱导小鼠骨髓前体细胞,获得足量的DC,然后,解剖按蚊唾液腺子孢子与DC共培养,分别于2、4和24 h后,荧光显微镜下观察子孢子与DC的相互关系,同时采用流式细胞分析技术检测DC表面的MHC-Ⅱ类分子、CD80和CD86共刺激分子的表达情况,最后转染重组pFLAG-CMV8-CSP质粒后24 h,检测DC表面的共刺激分子的表达情况。结果在共培养后2h,子孢子便逐渐向DC迁移甚至黏附于DC表面;4 h后部分子孢子便进入DC且仍然保持子孢子的弯月形形态;24 h后DC内的部分子孢子逐渐变圆,类似肝期裂殖体的形态。流式检测发现共培养2 h后对DC共刺激分子表达无明显影响,而共培养4 h和24 h后DC共刺激分子的表达均上调。转染pFLAG-CMV8-CSP重组质粒至DC中后同样能诱导DC的共刺激分子的表达上调。结论在体外共培养的情况下,大部分子孢子可以主动侵入DC而少部分可以被DC吞噬,主动入侵DC的子孢子可能是通过其表面的CSP由纳虫空泡进入胞浆内后诱导DC成熟。     

骨髓来源的原代树突状细胞对细菌颗粒抗原交叉呈递的动力学研究

目的研究小鼠骨髓细胞来源的树突状细胞对细菌颗粒抗原交叉递呈的动力学特点。方法取小鼠骨髓细胞,采用GM-CSF诱导培养。用倒置显微镜观察培养过程中细胞形态,用流式细胞仪进行细胞纯度和表型测定。采用第7天未成熟的DC细胞进行细菌抗原的交叉递呈能力检测和动力学分析。结果小鼠骨髓细胞经GM-CSF诱导培养,第7天获得大量具有典型形态和免疫表型的树突状细胞,并且在细菌脂多糖刺激后,其表型也发生特征性变化表现在共刺激分子CD80由刺激前的27.7%上调到71.6%,CD86从刺激前的36.0%上调到80.3%,DEC205从刺激前的6.5%上调到26.2%。同时该细胞吞噬低剂量的细菌抗原即可有效活化T细胞,其动力学曲线为:1～3h,该细胞抗原递呈能力呈对数增加,3～8hDC抗原递呈能力进入一个平台期,10～12h,抗原递呈能力又迅速增强。结论采用GM-CSF可以从小鼠骨髓中获得大量纯度高并且具有典型免疫表型的DC,该DC细胞能有效的递呈外源性细菌抗原,并具有特殊的抗原递呈动力学曲线。     

猪苓多糖刺激/诱导小鼠树突状细胞成熟

研究猪苓多糖对小鼠骨髓树突状细胞(DC)表型及功能成熟的影响。从小鼠骨髓中分离单个核细胞(MNC),用rmGM-CSF、IL-4培养5 d后,实验组加入猪苓多糖(50μg/ml),空白对照组加等量RPMI 1640,阳性对照组加LPS(1μg/ml),3组分别同时作用48 h。扫描电镜观察其体外培养过程中的形态特征,流式细胞仪(FACS)分析其表型特征,混合淋巴细胞反应(MLR)检测其功能。用猪苓多糖刺激的小鼠骨髓MNC具典型的DC形态;细胞表达I-A/I-E、CD11c和分泌IL-12能力比空白对照组增加,具有极强的激发MLR的能力,显示成熟DC的特征。猪苓多糖可以促进体外培养的小鼠骨髓DC的成熟,促进DC诱导的免疫应答启动。