Anxa5真核表达质粒构建及其对小鼠肝癌Hca—P细胞增殖影响观察

目的：构建pcDNA3。1-V5／HisB—Anxa5真核表达质粒,获得膜联蛋白A5（AnnexinA5,Anxa5）表达稳定上调的小鼠肝癌Hca—P细胞株,探究Anxa5上调对Hca—P增殖的影响。方法：利用RT—PCR扩增小鼠全长Anxa5编码序列,将其克隆到pcDNA3．1-V5／HisB载体中,并将构建的pcDNA3．1-V5／HisB-Anxa5表达质粒转入Hca—P细胞。采用（;418筛选及有限稀释法获得单克隆细胞株,观察细胞形态变化。蛋白质印迹法分析Anxa5表达情况,CCK-8法检测相应Hca—P细胞的增殖能力。结果：酶切及测序结果显示,pMD R 18-T—Anxa5克隆质粒和pcDNA3．1-V5／HisB-Anxa5表达质粒构建成功;获得了Anxa5表达稳定上调的单克隆细胞株;与正常Hca-P比较,Anxa5蛋白在pcDNA3．1一V5／HisB-Anxa5-Hca-P单克隆细胞中上调了59．5％,P一0．016;pcDNA3．1-V5／HisB～Anxa5-Hca—P增殖显著加快,P=0．002。结论：成功构建了Anxa5真核表达质粒并获得Anxa5表达稳定上调的小鼠肝癌Hca—P细胞株,Anxa5上调对Hca—P细胞的增殖具有促进作用,为后续研究提供实验基础。     

外源人gp96基因在肿瘤细胞中的高效表达

背景与目的：从肿瘤细胞中分离出的热休克蛋白gp96制备物免疫小鼠可产生抗相应肿瘤的特异性保护性细胞毒性T细胞免疫应答,为肿瘤免疫治疗开辟了一条新的可行性途径,但gp96害细胞中的表达水平较低,从有限的细胞或组织中获得的gp96制备物难以满足研究的需要。因此,本研究拟为制备高质量和充足的gp96而建立高表达gp96的单克隆细胞株。方法：构建人gp96cDNA的重组表达质粒pcDNA-hgp96并将其转染HeLa细胞,G418筛选稳定转染的阳性细胞克隆,然后用Western印迹分析单克隆细胞株的gp96表达时。结果：成功构建了人gp96的重组表达质粒,建立了稳定转染的单克隆细胞株,并筛选出一株高表达gp96的单克隆细胞。结论：成功建立了高表达gp96的单克隆细胞株,为gp96抗肿瘤免疫的研究奠定了基础。     

MDR1启动子/荧光素酶质粒的构建及其在朊蛋白高表达胃癌细胞中的活性检测

目的:构建含MDR1基因启动子的荧光素酶报告基因质粒,并检测其在朊蛋白高表达胃癌细胞系中的活性表达。方法:PCR克隆人MDRl基因启动子片段,通过亚克隆将启动子分别插入到pMD18-T载体和荧光素酶报告基因pGL3-Enhancer载体中,建立含MDR1启动子的荧光素酶报告基因质粒pGL-MDR1,并经测序及酶切确定扩增序列;脂质体基因转染法将pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系SGC7901-PrP,并测定其荧光素酶活性。结果:PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确,pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系的荧光素酶活性,较转染入pcDNA3.1空载体细胞系相比升高3~5倍。结论:成功构建含MDRl启动子的荧光素酶报告基因质粒;上调朊蛋白表达可激活MDR1的转录活性。     

MDR1启动子/荧光素酶质粒的构建及其在朊蛋白高表达胃癌细胞中的活性检测

目的：构建含MDR1基因启动子的荧光素酶报告基因质粒,并检测其在朊蛋白高表达胃癌细胞系中的活性表达。方法：PCR克隆人MDR1基因启动子片段,通过亚克隆将启动子分别插入到pMD18-T载体和荧光素酶报告基因pGL3-Enhancer载体中,建立含MDR1启动子的荧光素酶报告基因质粒pGL-MDR1,并经测序及酶切确定扩增序列;脂质体基因转染法将pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系SGC7901-PrP,并测定其荧光素酶活性。结果：PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确,pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系的荧光素酶活性,较转染入pcDNA3.1空载体细胞系相比升高3-5倍。结论：成功构建含MDR1启动子的荧光素酶报告基因质粒;上调朊蛋白表达可激活MDR1的转录活性。     

miR-140 靶向抑制PD-L1 表达增强宫颈癌HeLa 和Caski 细胞对奥沙利铂的敏感性

[摘要] 目的：探究miR-140 能否通过靶向抑制程序性细胞死亡蛋白-1（programmed death-1, PD-L1）表达增强宫颈癌（cervical cancer, CC）细胞对奥沙利铂的敏感性。方法：采用qPCR检测miR-140 在人正常宫颈细胞、CC细胞株及其奥沙利铂耐药细胞株中的表达情况;采用miR-140 模拟物转染细胞,CCK-8 法检测CC正常细胞株及其奥沙利铂耐药细胞株的增殖情况、克隆形成实验检测细胞的克隆形成率。通过Starbase 及TargetScan 在线分析软件预测miR-140 与PD-L1 的靶向结合位点,并通过双荧光素酶报告基因验证miR-140 与PD-L1 的靶向结合关系。采用Annexin V FITC/PI 双染色法和Wb法分别检测过表达miR-140 或同时过表达PD-L1,且在使用奥沙利铂处理后CC细胞的凋亡、迁移及凋亡相关蛋白的表达情况。建立裸鼠CC移植瘤模型,检测miR-140 加强肿瘤对奥沙利铂处理敏感性的效果。结果：miR-140 在奥沙利铂耐药性CC细胞中表达显著下调（P<0.01）,过表达miR-140 能够明显上调奥沙利铂耐药CC细胞对奥沙利铂的敏感性（P<0.05）,抑制CC细胞的增殖及克隆形成（均P<0.01）。miR-140与PD-L1 3''-UTR靶向结合并抑制其表达。过表达miR-140 显著促进CC细胞的迁移及凋亡（P<0.01）,过表达miR-140 的同时过表达PD-L1 明显减弱了miR-140 对CC细胞迁移的抑制及细胞凋亡的促进作用（均P<0.05）。小鼠异体移植瘤模型验证了miR-140 促进肿瘤对奥沙利铂的敏感性。结论：miR-140 通过靶向抑制PD-L1 表达增加CC细胞对奥沙利铂的敏感性,上调miR-140或抑制PD-L1的表达再与奥沙利铂联合处理有可能作为奥沙利铂耐药CC治疗的新策略。     

PRKACB基因真核表达载体的构建及稳转细胞株的筛选

目的:克隆人cAMP依赖性蛋白激酶催化亚单位β基因(PRKACB),构建重组真核表达载体pEGFP-C1-PRKACB,并筛选其稳定转染肺癌细胞株.方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从真核细胞中扩增得到人PRKACB的全长序列,克隆至表达增强型绿色荧光蛋白载体中,经酶切、PCR鉴定后测序证实克隆成功.将重组载体转至真核细胞,采用RT-PCR、Western blot技术检测外源基因PRKACB的表达.应用新霉素(G418)筛选出稳定转染pEGFP-C1-PRKACB的非小细胞肺癌细胞株.结果:测序结果证实成功将PRKACB基因克隆至真核表达载体中,酶切片段与预期大小一致(1 200bp).RT-PCR及Western blot结果显示:转染后的细胞中PRKACB在转录和翻译水平的表达均有明显提高.稳定转染pEGFP-C1-PRKACB的细胞株经Western blot证实其PRKACB蛋白上调最显著.结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-C1-PRKACB,并筛选其稳定转染后上调最显著的细胞株,为进一步研究PRKACB的生物学功能奠定了基础.     

以双质粒逆病毒载体系统快速建立梯度过表达hMTA1稳转单克隆细胞系的方法

目的利用逆病毒表达载体快速构建梯度过表达人MTA1稳转单克隆细胞系。方法利用噬菌斑原位杂交筛选人肺噬菌体文库,以阳性克隆为模板,RT-PCR获得人MTA1完整CDS序列。以逆病毒表达载体pMX为基础,经过多次酶切连接,构建逆病毒表达载体pMX-MTA1-flag-IRES-EGFP。将构建好的逆病毒载体系统,转染293-gag/pol细胞,包装出含该表达载体的逆病毒颗粒。以含病毒上清多次感染HCT116细胞,获得稳定转染MTA1的HCT116多克隆细胞系。将该多克隆细胞系按合适比例稀释后接种至10cm大皿,获得大量单克隆细胞系,以GFP为筛选标志,筛选不同荧光强度的单细胞克隆进行扩增并分析MTA1与GFP表达水平的线性关系。结果测序结果显示成功克隆出人MTA1表达序列。免疫荧光、Western Blot结果证实成功构建出梯度过表达MTA1的稳转细胞系。相关性验证结果显示构建的非融合载体MTA1与GFP的表达呈明显的线性相关,相关系数r=0.932,P<0.01。结论利用逆病毒表达系统,快速成功构建并筛选出MTA1与GFP非融合梯度过表达稳转单克隆细胞系,为MTA1基因功能研究提供了良好模型。该逆转录病毒平台可用于快速建立其他基因的稳转单克隆细胞系。     

人微管不稳定蛋白基因真核表达载体的构建与表达及对食管癌细胞的作用

目的 构建人微管不稳定蛋白基因(stathmin)真核表达载体,研究其对食管癌细胞EC9706的作用.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增stathmin cDNA,克隆至pMDl8-T载体并酶切鉴定后,亚克隆至pEGFP-C2真核表达载体.将测序鉴定正确的重组载体和空载体经脂质体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察转染细胞荧光蛋白的表达,采用Western blot检测转染细胞中增强型荧光蛋白(EGFP)和stathmin融合蛋白的表达.选取稳定转染的细胞株,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,采用流式细胞仪分析细胞的增殖状态,平板克隆形成实验、裸鼠移植瘤实验分析转染细胞成瘤性.结果 RT-PCR扩增获得450 bp的cDNA编码序列;克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定后获反向插入质粒;亚克隆至pEGFP-C2载体后,经酶切与测序鉴定,重组载体pEGFP-stathmin构建成功.重组载体和空载体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察到,转染细胞中呈现绿色荧光;经Western blot证实,重组载体表达46 000的融合蛋白.与空载体转染细胞相比,转染重组载体的EC9706细胞形态变大,增殖速度减慢,细胞分裂阻滞于G2/M期,细胞克隆形成数减少,裸鼠体内成瘤性降低(P＜0.05).结论 构建的真核表达载体pEGFP-stathmin在食管癌EC9706细胞中能够稳定表达,并抑制肿瘤细胞的增殖和成瘤性.     

γ-synuclein对结肠癌细胞系体外生物学行为影响的观察

目的:构建针对人γ-synuclein基因的shRNA真核表达载体,观察γ-synuclein基因对人结肠癌细胞系体外生物学行为的影响。方法:根据人γ-synuclein序列设计并构建γ-synuclein基因的shRNA真核表达载体,以脂质体转染的方法将γ-synuclein干扰质粒转染至人结肠癌细胞株HCT116,经G418筛选出稳定转染的细胞株。应用CCK8法检测γ-synuclein干扰对HCT116细胞增殖的影响,软琼脂克隆形成实验检测细胞体外克隆形成能力,细胞划痕实验检测细胞体外迁移能力,Transwell小室法检测细胞体外侵袭能力。结果:经测序证明γ-synuclein的shRNA序列已成功插入pGCsi-U6/neo/GFP质粒中,构建的干扰质粒能够显著抑制γ-synuclein mRNA及蛋白的表达。γ-synuclein受抑制后,HCT116细胞增殖数目从48h后开始减少,持续72h,与空质粒组及未转染组相比,差异均有统计学意义,P<0.05。siRNA组细胞克隆形成率为(9.6±2.9)%,显著低于未转染组的(29.4±4.5)%和空质粒组的(32.1±5.8)%,差异均具有统计学意义,P<0.05。在细胞划痕实验中,γ-synuclein被抑制后细胞划痕损伤愈合的速度明显减慢。在侵袭实验中,穿过Matrigel胶及Transwell小室膜的siRNA组侵袭细胞数为20.1±5.26,显著低于未转染组的100和空质粒组的105.4±12.5,差异均有统计学意义,P<0.05。结论:干扰γ-synuclein的表达可显著抑制结肠癌细胞体外增殖、克隆形成和迁移侵袭能力。     

FBXW7基因点突变对结直肠癌HCT-116细胞的增殖、迁移、侵袭和抗 凋亡能力的影响

目的： 探讨FBXW7基因点突变对结直肠癌细胞株HCT-116增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。 方法： 通过构建FBXW7 基因野生型及突变型过表达的重组载体,并将其转染HCT-116细胞,应用Western blotting检测转染后FBXW7蛋白表达情况。 CCK-8检测细胞增殖能力,平板细胞克隆形成实验(HTCA)检测肿瘤细胞克隆形成能力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,划痕及 Transwell细胞迁移实验检测细胞迁移和侵袭能力。 结果： 转染野生型FBXW7基因的HCT-116细胞中FBXW7蛋白表达水平高 于对照组（转染突变型FBXW7基因的HCT-116细胞）、阴性对照组（转染空质粒载体pEZ-M90的HCT-116细胞）及空白对照组（未 进行任何特殊处理的HCT-116细胞） （均P<0.05）。转染野生型FBXW7的HCT-116细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力相较 于其余各组均显著下降（均P<0.05）,且细胞凋亡率显著升高（P<0.05）。 结论： FBXW7基因点突变可使其蛋白表达水平降低,从 而促进结直肠癌HCT-116细胞的增殖、迁移和侵袭,并抑制其凋亡。     

lncRNA AK126393对结肠癌细胞的抑制作用及机制研究

目的:探索长链非编码 RNA（long non-coding RNA,lncRNA）AK126393调控人结肠癌细胞凋亡的作用及其机制。方法:采用荧光实时定量聚合酶链反应检测人正常结肠上皮细胞和不同结肠癌细胞系中lncRNA AK126393的表达水平,采用pcDNA3.1-AK126393转染HCT116细胞增加AK126393的表达,采用MTT法检测细胞的增殖活力,采用流式细胞术检测细胞凋亡水平,采用Western blotting检测细胞中目标蛋白的表达水平。结果:与人正常结肠上皮细胞系永生化结肠上皮细胞系NCM460相比,人结肠癌细胞系中AK126393的表达均出现显著下降,其中HCT116细胞中AK126393表达最低;pcDNA3.1-AK126393转染HT116细胞后AK126393的相对表达水平出现显著升高;AK126393 的过表达抑制HCT116细胞的增殖能力,促进其细胞凋亡水平,并且引起细胞自噬的发生;同时AK126393 的过表达显著抑制HCT116细胞内AKT/ERK1/2信号通路的磷酸化水平。结论:LncRNA AK126393具有抑制结肠癌细胞增殖、促进凋亡以及引起细胞自噬的作用,其作用可能是通过抑制AKT/ERK1/2信号通路的激活来实现。     

PRL-3对结直肠癌细胞迁移、侵袭能力的影响

目的:构建肝再生磷酸酶-3（phosphatase of regenerating liver-3,PRL-3）基因过表达的重组慢病毒载体,研究其对结直肠癌细胞系HCT116迁移、侵袭能力的影响。方法:PCR扩增PRL-3基因并克隆至pcDH载体,构建成pcDH-PRL-3过表达载体,再将其与慢病毒包装载体共转染293T细胞,包装成Lenti-PRL-3重组慢病毒载体,并感染结直肠癌细胞系HCT116。利用qPCR、Western分别从mRNA、蛋白水平检测PRL-3表达情况;通过划痕实验、Transwell实验研究过表达PRL-3对结直肠癌细胞系HCT116侵袭能力的影响。结果:成功构建Lenti-PRL-3重组慢病毒载体,并在结直肠癌细胞系HCT116过表达。划痕实验、Transwell实验结果表明过表达PRL-3能够促进HCT116细胞的迁移、侵袭。结论:构建Lenti-PRL-3重组慢病毒载体,在结直肠癌细胞系HCT116过表达PRL-3后能增加细胞的迁移、侵袭能力。     

miR-340通过下调 CCND1 表达增加结直肠癌细胞对5-Fu的耐药

目的:探讨细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的编码基因CCND1 miR-340介导的逆转结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶(5-Fu)耐药的机制.方法:采用瞬时转染技术将结直肠癌细胞HCT116、SW480株分别转染si-CCND1和miR340-mimic.应用MTT法检测转染后的结直肠癌细胞对5-Fu敏感性的变化,应用双荧光素酶试验验证CCND1对miR340参与的影响结直肠癌细胞对5-Fu敏感性的影响.结果:瞬时转染siCCND1和过表达miR-340后,结直肠癌HCT116和SW480细胞的IC50值均显著低于对照组(10,10 vs 20 μmol/L和20,20 vs 40 μmol/L,均P＜0.05).共转染CCND1 3'UTR野生质粒和miR-340 inhibitor的结直肠癌HCT116和SW48细胞荧光素酶的活性显著高于共转染空载体和mimic细胞(P＜0.01).结论:CCND1作为不良因子通过抑制miR340的表达进而发挥增加结直肠癌细胞对5-Fu耐药的作用.     

AEBP1通过激活Wnt/β-catenin信号通路调控EMT促进结肠癌细胞增殖迁移

目的:探讨脂肪细胞增强结合蛋白1（AEBP1）对结肠癌细胞增殖迁移的影响及其机制。方法:Oncomine数据库对结肠癌中AEBP1表达情况进行分析;GEPIA、ualcan数据库对AEBP1表达与结肠癌患者预后进行分析。分析AEBP1在正常结肠上皮细胞和结肠癌细胞中的表达情况。在HCT116细胞过表达AEBP1建立过表达细胞系,在过表达细胞系中对AEBP1进行敲降。利用CCK-8实验、克隆形成实验检测AEBP1对细胞增殖的影响;Transwell实验检测AEBP1对细胞迁移能力的影响。实时荧光定量PCR与免疫组化实验检测结肠癌组织及配对正常组织AEBP1表达水平,Western blot法检测过表达AEBP1的结肠癌细胞AEBP1、β-catenin、cyclinD1、c-myc、E-cadherin、Vimentin蛋白的水平。结果:结肠癌组织中AEBP1表达增加。高表达AEBP1与结肠癌患者总生存期、无病生存期负相关,高表达AEBP1与结肠癌患者肿瘤分期、淋巴转移相关。过表达AEBP1后,HCT116结肠癌细胞增殖加快,克隆形成数增加、Transwell迁移细胞数增加,在过表达细胞中敲降AEBP1后得到相反结果。过表达AEBP1后β-catenin,cyclinD1,c-myc,Vimentin蛋白表达增加,E-cadherin蛋白表达下降。结论:AEBP1在结肠癌中高表达并通过激活Wnt/β-catenin信号通路诱导EMT进程促进结肠癌细胞增殖迁移。     

ＨＭＧＢ１表达载体转染结肠癌细胞对ＶＥＧＦ-Ｄ表达的影响

目的：构建ＨＭＧＢ１表达载体,转染结肠癌细胞,研究其对结肠癌细胞中血管内皮生长因子Ｄ（ＶＥＧＦ-Ｄ）表达的影响。方法：将分离得到的淋巴细胞总ＲＮＡ反转录合成ｃＤＮＡ,以此为模板进行ＰＣＲ扩增得到ＨＭＧＢ１基因;随后酶切转入载体ｐＭＤ１８Ｔ,通过亚克隆转入载体ｐＬｘｓｎ,得到重组质粒。重组体质粒经酶切鉴定后,并对插入的ＨＭＧＢ１基因片段进行测序,将已鉴定的阳性重组质粒用脂质体介导转染ＨＣＴ１１６细胞。通过ＲＴ-ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ检测ＨＭＧＢ１和ＶＥＧＦ-Ｄ的表达情况。结果：成功构建含ＨＭＧＢ１的表达载体。ＲＴ-ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ检测发现转染表达ＨＭＧＢ１载体的ＨＣＴ１１６细胞中ＨＭＧＢ１和ＶＥＧＦ-Ｄ的表达均增高。结论：ＨＭＧＢ１可以通过促进结肠癌细胞中ＶＥＧＦ-Ｄ的表达,诱导淋巴管生成,从而促进其淋巴结转移。     

表皮生长因子调节水通道蛋白3表达对结肠癌细胞迁移能力的影响

目的:探讨EGF调节AQP3表达对结肠癌细胞迁移能力的影响。方法:Western blot检测EGF不同条件作用下结肠癌细胞株HCT116 AQP3的表达情况;划痕实验检测不同AQP3表达程度下结肠癌细胞迁移能力的变化。结果:Western blot检测显示EGF上调AQP3表达并且呈时间和剂量依赖,在不同剂量EGF刺激下和不同作用时间下,AQP3的表达强度具有统计学差异(P<0.05);划痕实验示不同AQP3表达各组结肠癌细胞株HCT116迁移能力具有统计学差异(P<0.05),AQP3高表达可以促进结肠癌细胞迁移能力增强并且这一作用可以被AQP3抑制剂CuSO4阻断。结论:AQP3在EGF结合EGFR后上调表达并增强结肠癌细胞的迁移能力。     

miR-637抑制结肠癌HCT116细胞生长和迁移的机制研究

目的:分析miR-637对结肠癌HCT116细胞生长和迁移的影响。方法:分别构建miR-637过表达或者低表达的结肠癌HCT116细胞系。通过MTT方法检测miR-637对细胞增殖的作用,PI（propidium iodide）染色检测miR-637对细胞周期的影响,Annexin V-FITC/PI染色检测miR-637对细胞凋亡的作用。Western blot检测miR-637对细胞中CDK4和Bcl-2的影响。Transwell实验检测miR-637对细胞迁移的作用,进一步通过Western blot检测miR-637对细胞中MMP2的影响。结果:miR-637抑制HCT116细胞的增殖,抑制G1/S期进程,促进细胞凋亡,Western blot结果显示,miR-637抑制CDK4和Bcl-2在HCT116细胞中的表达。Transwell实验指出,miR-637抑制细胞的迁移,Western blot结果指出miR-637抑制MMP2在HCT116细胞中的表达。结论:miR-637可以通过抑制CDK4、Bcl-2和MMP2的表达抑制HCT116细胞的生长和迁移。     

NDUFA4过表达对人结直肠癌细胞体外生长的影响

 目的 探讨过表达NDUFA4对人结直肠癌细胞体外生长的影响及其机制。方法 将p-NDUFA4重组质粒（p-NDUFA4组）和p-Cont对照质粒（p-Cont组）体外分别转染人结直肠癌HCT116细胞；采用Real-time PCR和Western blot检测细胞中NDUFA的表达；CCK-8法和克隆形成实验分别检测HCT116细胞增殖活性和克隆形成能力；实时荧光定量PCR法检测HCT116细胞中CDK2、CDK3、CDK4、CDK6的mRNA水平；Western blot法检测细胞中蛋白总AKT、ERK1/2以及磷酸化AKT（p-AKT）、ERK1/2（p-ERK1/2）的表达水平。结果 与p-Cont对照组相比，p-NDUFA4组中NDUFA4的表达水平显著升高（均P<0.01）；细胞增殖和克隆形成能力明显增强（均P<0.05）；CDK2、CDK3等的mRNA水平显著上调（均P<0.05）；p-NDUFA4组中p-AKT和p-ERK1/2蛋白的表达水平明显上调（均P<0.05）。结论 过表达NDUFA4能明显促进人结直肠癌细胞的体外生长，其机制可能与AKT和ERK信号通路的变化相关。     

肠癌组织中miR-141的表达及其对HCT116细胞增殖和迁移的影响

目的:探讨miR-141在肠癌组织中的表达情况以及其对HCT116细胞生物学功能的影响及其作用机制。方法:选取2016年05月至2018年05月在中国医科大学附属第一人民医院手术切除的30对肠癌组织以及癌旁组织进行miRNA芯片筛查。逆转录定量聚合酶链反应分析其中异常表达miRNA情况,评估miR-141的表达与肿瘤相关信息的相关性。通过TargetScan软件分析miR-141可能靶向的蛋白,在HCT116细胞中通过荧光素酶报告基因实验检测miR-141对DEK蛋白的靶向作用。HCT116细胞中分别过度表达和沉默表达miR-141后,通过MTT实验检测细胞增殖情况,Transwell实验检测细胞的迁移情况。结果:芯片分析和逆转录定量聚合酶链反应指出miR-141在肠癌组织中表达低于癌旁组织,miR-141与肿瘤的进程具有相关性,TargetScan软件指出miR-141可以靶向作用于DEK,荧光素酶报告基因实验印证了miR-141对DEK的靶向作用。MTT实验指出miR-141过度表达显著抑制细胞增殖,miR-141沉默表达显著促进细胞增殖,与对照组相比,差异有统计学意义（P＜0.05）。Transwell实验显示,miR-141过度表达可以抑制HCT116细胞的迁移,miR-141沉默表达后HCT116细胞的迁移得到促进。结论:miR-141通过靶向DEK蛋白能够抑制HCT116细胞的增殖和迁移。     

Musashi1基因调控结肠癌HCT116细胞恶性生物学行为的机制研究

背景与目的：Musashi1（Msi1）属于RNA结合蛋白家族中的一员,是RNA转录后表达的关键调控者,其是否参与肿瘤的发生、发展,以及具体分子机制仍不十分清楚。探讨沉默Msi1基因对结肠癌HCT116细胞恶性生物学行为的影响及可能的机制。方法：采用慢病毒载体构建稳定低表达Msi1的细胞株,细胞计数试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）实验检测细胞增殖能力,克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测细胞周期的变化,裸鼠移植瘤模型观察沉默Msi1对裸鼠成瘤的影响。实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR）和蛋白质印记法（Western blot）检测沉默Msi1基因后p27基因的mRNA表达和蛋白水平,双荧光素酶实验验证Msi1基因与目的基因p27 3’-非编码区（3’-untranslated region,3’-UTR）的相互作用。结果：沉默Msi1基因后,HCT116细胞的增殖能力显著下降,克隆集落数明显减少,G ₀ /G ₁ 期细胞增多,S期细胞明显减少,裸鼠移植瘤生长明显受到抑制。沉默Msi1基因后p27 mRNA表达未见明显变化,而p27蛋白水平明显上调,双荧光素酶实验证实Msi1基因能与p27 3’-UTR区域直接结合,抑制其翻译。结论：沉默Msi1基因通过靶向上调p27,导致结肠癌HCT116细胞G ₀ /G ₁ 期阻滞,从而抑制肿瘤细胞体内及体外增殖能力。