激肽释放酶结合蛋白对大鼠视神经不完全损伤后视网膜神经细胞的保护作用及轴突再生的研究

目的 探讨激肽释放酶结合蛋白(KBP)是否对体内视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)存在保护和促进其轴突再生的作用.方法 在距SD大鼠视神经球侧端0.5～1.0mm的地方夹持视神经,造成大鼠视神经不完全性损伤;在大鼠视神经损伤的模型中,行玻璃体腔分别注入KBP作为实验组和PBS为对照组;分别于损伤后7d,14d和21d取材,HE染色观察视网膜结构、测量视网膜厚度及RGCs的存活数量;提取术眼视神经行蛋白免疫印迹.根据统计学分析结果,明确KBP是否有视网膜神经节细胞保护和促进其轴突再生作用.结果 ①大鼠不完全视神经损伤模型建立成功.②通过HE染色,我们观察了视网膜各层结构变化,通过双肓法计数RGCs,和视网膜厚度测量,经统计学分析,组间差异具有统计学意义.③对神经再生的标记蛋白GAP-43进行Western-blot,统计学分析,组间GAP-43表达差异具有统计学意义.结论 ①KBP对视神经损伤后的RGCs具有保护作用.②KBP在视神经损伤后可能促进了视神经的轴突再生.     

压力对大鼠纯化视网膜神经节细胞中神经微丝的影响

目的 研究压力对体外培养的视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)中神经微丝的影响,探讨高眼压性青光眼中细胞骨架蛋白的表达变化.方法 建立体外加压培养纯化的Sprague-Dawley(SD)乳鼠视网膜神经节细胞模型,采用抗大鼠Thy1.1单克隆抗体免疫荧光细胞化学染色法鉴定RGCs的纯度.将纯化培养的SD乳鼠RGCs分别在0、20、40、60及80 mmHg的压力下培养.免疫组织化学方法检测神经微丝蛋白-H(NF-H)的表达,并用图像分析系统对各组NF-H表达进行分析测定.结果 ①纯化后的视网膜神经节细胞纯度为96%.②压力为20 mmHg时,实验组RGCs中NF-H表达与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05),且NF-H在视网膜神经节细胞中的分布相对均一;压力为40、60及80 mmHg时,实验组RGCs中NF-H表达与对照组相比差异均有统计学意义(均P<0.01),且NF-H在视网膜神经节细胞中分布紊乱.结论 纯化的RGCs可以在体外存活并生长,一定的压力(≥40 mmHg)可影响RGCs中细胞骨架蛋白的表达.     

地塞米松对兔视神经钳夹伤治疗作用的实验研究

目的：观察地塞米松对家兔视神经钳夹伤后视网膜神经节细胞存活的影响及损伤视神经、视网膜Nogo-A表达的变化。方法：建立兔球后视神经钳夹伤模型，将健康成年家兔分为正常对照组、损伤组、治疗组。分别于损伤后3、7、14d天处死动物，观察单位面积视网膜神经节细胞存活数量及损伤后Nogo-A在视神经与视网膜中的表达变化。结果：视神经损伤后，治疗组视网膜神经节细胞的存活数量高于损伤组及对照组（P〈0.01）；对照组及损伤组损伤后3、7、14d视神经与视网膜中Nogo-A表达增强，至损伤后7d达高峰；治疗组视神经与视网膜Nogo-A表达亦增强，各时间点均弱于损伤组、对照组，差异有非常显著性（P〈0.01）。结论：视神经损伤后，地塞米松能够增加视网膜神经节细胞的存活数量，并下调Nogo基因的表达，这可能是地塞米松的药理作用机制之一。     

视神经损伤后RhoA在大鼠视网膜中的分布及表达研究

目的 观察视神经损伤后RhoA在大鼠视网膜中的分布及表达变化.方法 将36只成年Long Evans大鼠随机分为正常组,视神经损伤1、3、7 d组,共4组,每组9只,通过免疫组化染色,观察RhoA在视网膜中的分布变化;用Western blot分析统计RhoA表达变化.结果 正常及视神经损伤后1 d,RhoA主要分布于视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)层;3 d分布于RGCs及内丛状层;7 d分布于RGCs、内丛状层、内核层及外丛状层.Western blot示:视神经损伤后1、3、7 d,RhoA表达均高于正常组(P＜0.01,P＜0.05),但7 d表达量最高.结论 视神经损伤可显著增加RhoA在视网膜中的表达量及分布范围,它在视神经损伤后再生过程中发挥重要的作用.     

大鼠视神经挫伤后视网膜神经节细胞形态改变及GFAP表达的变化

目的 研究大鼠视神经夹挫伤后视网膜神经节细胞（RGCs）形态学及其神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）表达的变化。方法 采用大鼠球后视神经钳夹伤模型，动物分别于损伤后1、3、5、7、9、14、21d处死，苏木精-伊红染色观察视神经组织及RGCs的动态变化，免疫组化方法检测视网膜组织GFAP的表达水平。结果 视神经损伤后，RGCs数目明显下降，14d内降低速度较快，14d后下降速度减慢；与正常大鼠视网膜相比，GFAP表达明显增加，伤后7d达峰值，14d时降至正常水平。结论 视神经损伤后RGCs数量减少是其视功能下降的病理基础之一，视网膜Muller细胞GFAP表达增加是Muller细胞损伤修复的一种表现。     

外源性H2O2对大鼠纯化视网膜神经节细胞存活及轴突生长的影响

目的研究外源性H2O2对视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)存活和轴突生长状况的影响及其与神经微丝蛋白NF-H表达变化的关系,探讨H2O2的氧化应激引起RGCs损伤的机制。方法纯化培养SD乳鼠RGCs,应用不同浓度H2O2(250、500μmol/L)分别作用4、8、24、32h后测定存活、有突起的视网膜神经节细胞数及其最长突起长度。采用免疫组织化学染色加图像分析系统检测H2O2对RGCs表达神经微丝蛋白NF-H的影响。结果纯化培养的SD大鼠RGCs纯度可达96.24%。H2O2以浓度和时间依赖的方式影响纯化培养的RGCs存活数,500μmol/L的H2O2在32h可以导致RGCs存活数下降约50%。同时,500μmol/L H2O2孵育后RGCs细胞轴突长度与对照组比较明显减短,差异有统计学意义(P<0.01),且减短程度随时间延长而增大;NF-H表达差异也有统计学意义(P<0.01),且NF-H在RGCs中分布紊乱。结论 H2O2的氧化应激损伤能够以时间和浓度依赖的方式影响纯化培养的RGCs存活,可影响RGCs轴突生长,这可能与其下调RGCs中神经微丝蛋白的表达有关。     

急性高眼压模型中p75~(NTR)抑制剂对视网膜神经节细胞作用的研究

目的验证通过抑制p75~(NTR)(p75 neurotrophin receptor)可降低急性高眼压(acute ocular hypertension,AOH)对视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的损伤作用。方法应用大鼠急性高眼压模型,玻璃体腔注射p75~(NTR)抑制剂(TAT-Pep5),按建模后1、3、5 d取材,分为正常对照组、假手术组、急性高眼压组、急性高眼压+TAT-Pep5组。采用免疫荧光技术、Western blotting等方法检测急性高眼压模型中相关蛋白的表达变化。TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色检测细胞凋亡情况。结果急性高眼压模型视网膜Müller细胞上proNGF表达增加。注射p75~(NTR)抑制剂TAT-Pep5后急性高眼压视网膜上cleavedcaspase 3蛋白量减少,并且RGCs凋亡数目减少。结论视网膜神经节细胞损伤可引起proNGF表达增加,选择性阻断Müller细胞上的p75~(NTR)或干预其信号传导通路,可以减少急性高眼压模型中RGCs凋亡。     

外伤性视神经损伤手术时机选择的实验研究

[目的]通过视神经外伤后视网膜形态的变化,了解外伤性视神经损伤的手术时机与疗效间的相关关系。[方法]建立外伤性视神经损伤和不同时间减压动物模型,对视网膜神经节细胞(RGCs)、视网膜等进行了定量分析。[结果]正常对照组RGCs相对体积数密度(体密度,V_v)为0.072,小细胞所占比例为49.5％,视网膜厚度为108.9μm,节细胞以内层的厚度为19.5μm;48h减压组RGCs体密度为0.052,小细胞占比例为66.8％,视网膜总厚度为101.9μm,节细胞以内层厚度为16.9μm;14d减压组RGCs体密度为0.042,小细胞占比例为76.4％,视网膜总厚度为96.5μm,节细胞以内层为15.5μm。[结论]48h减压较14d减压可以较好的保存RGCs和视网膜的形态,外伤性视神经损伤后应该尽早解除周围因素对视神经的压迫。     

左归丸对视神经夹伤大鼠视网膜神经节细胞的保护作用

目的：观察左归丸对视神经夹伤大鼠视网膜神经节细胞的保护作用。方法：建立大鼠单侧视神经部分损伤模型。模型大鼠分别给予左归丸液4.0g/（kg·d）（治疗组）和等量生理盐水（损伤对照组）灌胃,采用免疫组织荧光技术于损伤后第1、2、4、8和16周检测受损眼视网膜神经节细胞数目及神经上皮干细胞蛋白（nestin）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）的表达情况。结果：视神经夹伤后,大鼠视网膜节细胞数目减少,细胞排列疏松紊乱,在内、外网层和内核层可见裂隙形成,视网膜厚度较正常组变薄,以伤后第4周最为严重,神经节细胞减少约50%,至第8周后神经节细胞减少缓慢。视神经夹伤第2周时,nestin和GFAP表达明显升高,持续至损伤后第8周。Nestin和GFAP在视网膜全层均有表达,但在神经节细胞层、内网层和内核层表达最强,呈条带状弯曲或蛇样匍行;伤后第4周时表达最强,此后二者表达下降,至伤后第16周时,GFAP先于nestin蛋白降至正常水平。各时间点左归丸组神经节细胞存活数比损伤对照组增加,且细胞排列相对整齐;nestin和GFAP表达强度较损伤对照组增加（P〈0.05）。结论：左归丸可能通过促进大鼠视网膜Mller细胞nestin和GFAP的表达,维持损伤后视网膜结构的完整性,从而间接减少节细胞凋亡,有效保护受损视网膜节细胞。     

丙泊酚干预对大鼠视神经损伤的影响及机制研究

目的探讨大鼠视神经损伤后丙泊酚干预对损伤视神经及视网膜神经节的影响及机制。方法 SD大鼠67只,随机取20只为正常组,不予任何处理。余行视神经钳夹法造模,造模成功42只纳入实验。随机分为:模型对照组和丙泊酚组,各21只/组。造模后4 d,以TUNEL法检测大鼠视网膜和视神经细胞凋亡,造模后7 d,RT-PCR、Western-blot检测视网膜和视神经节细胞组织Caspase-3、BCL-2基因和蛋白表达。造模后14 d,行闪光视觉诱发电位检测,处死大鼠取眼球,观察各组大鼠视网膜和视神经的病理形态,行视网膜神经节细胞计数。结果造模后4 d,丙泊酚组视网膜神经节细胞凋亡数量明显低于模型对照组(P0.05),造模后7 d与模型对照组相比,丙泊酚组Caspase-3的表达显著降低(P0.05);BCL-2的表达显著升高(P0.05)。造模后14 d,荧光金阳性RGC数:模型对照组最少,丙泊酚组较多,正常组最多,且各组之间差异有统计学意义(P0.05)。丙泊酚组大鼠闪光视觉诱发电位伏期较模型对照组大鼠短(P0.05)、波幅明显高于模型对照组(P0.05)。结论丙泊酚干预通过减少大鼠视神经钳夹后RGCs的凋亡,降低视网膜Caspase-3的表达,升高BCL-2的表达,对视神经损伤起到保护作用。     

Nogo-A基因敲除鼠视神经损伤后修复的实验研究

目的评价Nogo—A基因在视神经损伤后修复机制中的作用。方法Nogo-A基因敲除联合视神经损伤鼠为实验组（20只）,C57BL／6小鼠联合视神经损伤作为对照组（20只）。制备视网膜、视神经冰冻切片,采用免疫荧光技术检测视网膜神经节细胞和视神经中生长相关蛋白（GAP）43的表达。进行视网膜神经节细胞体外培养,进行GAP-43染色,采用图像分析系统计算细胞轴突长度。结果视神经中GAP-43表达：夹伤后1、3、7d对照组中表达少量GAP-43,实验组中GAP-43表达明显高于对照组（t=2．12,3．56、2．63,均P〈0．01）。GAP-43抗体染色可见着色在体外培养RGC轴突,实验组3d有较长轴突生长,对照组3d有较短轴突生长。RGC于培养1、3及7d,经自动图像分析系统处理,得出细胞突起长度,实验组突起长度明显高于对照组（F=41．36、31．23,均P〈0．01）。结论Nogo—A基因在抑制视神经损伤后轴突再生机制中起重要作用。     

胆总管结扎所致肝损伤中Nrf2对细胞信号传导和基因表达的影响

目的 研究核因子相关因子 2（Nrf2）在胆汁淤积中的作用。方法 野生鼠（WT）和Nrf2基因敲除小鼠(KO)给予胆总管结扎手术,应用蛋白杂交技术观察丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号传导途径的变化;应用RNA酶保护测定（RPA）技术测定基因变化。结果 在BDL组血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）显著升高;纤维粘连蛋白的表达在KO鼠明显增多;p-JNK、p-stat3、p-AKT、p-p38在WT鼠的BDL组的活化强度较大。Nrf2的靶基因NQO1,谷胱甘肽S 转移酶(GST)的同工酶（GST-Ya,GST-pa）在WT鼠的BDL组明显上调,而在KO鼠中则被抑制。TGF-β1、TIMP-1、胶原蛋白1在KO鼠的BDL组上调幅度较大。结论 在胆总管结扎后胆汁淤积所致肝损伤中,Nrf2对MAPK信号传导和炎症、纤维化过程均有影响,部分通过上调抗氧化基因的表达起到细胞保护作用。     

丝裂原活化蛋白激酶家族在Swedish 突变的淀粉样前体蛋白 转基因鼠脑缺血中的作用

 【目的】 探讨丝裂原活化蛋白激酶家族(MAPK)在Swedish 突变的淀粉样前体蛋白(APP/SWE)转基因鼠脑缺血中的作用&#65377;【方法】 APP/SWE 转基因鼠与非转基因鼠各12 只应用光化学法诱导脑梗塞形成,缺血7 d后其中6只以尼氏染色对缺血半暗带区存活神经元进行定量分析,6只以Western blot方法检测p38MAPK和JNK的活性&#65377; 【结果】 缺血7 d后, 非转基因鼠组缺血半球海马区缺血半暗带存活神经元数目与非缺血半球镜像部位神经元数目的比值(78.3 ± 1.3)%与APP/SWE转基因鼠组(70.5 ± 1.4)%有统计学差异(P < 0.05);APP/SWE转基因鼠组缺血半球p38MAPK和JNK活性与非缺血半球有统计学差异(P < 0.05),而非转基因鼠组缺血半球p38MAPK和JNK活性与非缺血半球差异无统计学意义(P > 0.05)&#65377;【结论】 APP/SWE转基因鼠组缺血后脑损伤显著重于非转基因鼠组,可能的机制与丝裂原活化蛋白激酶过度激活促进脑缺血后细胞凋亡过程有关&#65377;     

c-Jun氨基末端激酶在慢性移植物抗宿主病狼疮样小鼠肾组织的表达及氟伐他汀的干预作用

建立慢性移植物抗宿主病(cGVHD)狼疮样小鼠模型,观察c-Jun氨基末端激酶(JNK)在狼疮样小鼠肾组织中的表达及氟伐他汀的干预作用。(C57BL/6J×DBA/2)F1代小鼠随机分为正常对照组、氟伐他汀高剂量组(10 mg/kg)、低剂量组(5 mg/kg)和模型组,16周后处死,采用双缩脲比色法观察各组小鼠24 h尿蛋白量,免疫组织化学法定位检测JNK、p-JNK在肾组织的表达,RT-PCR法检测各组JNK mRNA表达及Western blotting半定量检测JNK、p-JNK蛋白表达。结果显示,模型组小鼠24 h尿蛋白量、JNK mRNA及JNK、p-JNK蛋白表达较正常对照组均显著增加(P＜0.01);氟伐他汀干预组较模型组上述指标均明显降低(P＜0.01);高剂量组较低剂量组降低更明显(P＜0.05)。JNK可能参与了狼疮肾炎病情进展,氟伐他汀可能通过影响JNK的表达从而延缓狼疮肾炎肾纤维化进程。     

潜伏表达癌调蛋白的HSV-1减毒载体能有效治疗大鼠机械性视神经损伤

目的 评价潜伏表达癌调蛋白OCM的HSV-1减毒型载体（1716-OCM）在大鼠机械性视神经损伤中的治疗作用及安全性。方法 体外细胞感染模型中检测重组病毒增殖特性及OCM表达。大鼠按随机数字表法分为3组（对照组、1716-OCM注射组和野生型病毒角膜感染组）,每时间点3只/组,于感染后7、14、30、60 d免疫荧光法检测OCM基因及病毒蛋白gB在大鼠视网膜和下丘脑中的表达。大鼠视神经损伤模型中,大鼠按随机数表法分为4组（假手术组,PBS治疗对照组,1716-OCM感染组及1716-OCM感染加cAMP增敏组）,5只/组。治疗45 d后,视觉诱发电位（FVEP）检测视觉电生理功能。免疫荧光法检测视网膜RGCs数量及神经髓鞘蛋白表达。结果 重组减毒型1716-OCM在体外细胞感染中病毒增殖远低于野生型病毒,其能够介导OCM有效表达。重组病毒能够介导OCM在大鼠眼部RGC层及脉络膜层表达。相比于野生型病毒,1716-OCM未引发显著的眼部组织结构破坏。在视神经损伤模型中,相比于未治疗组,1716-OCM联合cAMP治疗能够显著促进视网膜RGC存活（P=0.007）并抑制视神经脱髓鞘（P=0.03）。FVEP分析显示1716-OCM联合cAMP显著促进大鼠ΔN1-P1峰振幅恢复（P<0.001）。结论 减毒型重组1716-OCM能够介导OCM在大鼠视网膜表达,玻璃体腔注射1716-OCM重组病毒和cAMP能够有效治疗大鼠机械性视神经损伤。     

大鼠视神经切开减压和鞘膜切开减压疗效的对比实验

目的:用荧光金逆行标记法评价视神经切开减压对SD大鼠视神经不完全损伤的疗效。方法:夹持大鼠左眼视神经30 s建立不完全损伤模型,分视神经切开减压(ONID)和视神经鞘膜切开减压(ONSD)两组,应用荧光金逆行标记法,对比两组在术后1月、2月、3月、6月时存活视神经节细胞(RGC)的数量,评价ONID的疗效。结果:ONID组术后各时间点RGC记数均高于ONSD组,差异有显著性(P<0.05)。结论:ONID对不完全损伤的视神经有保护作用。在延长节细胞存活方面,ONID较传统的ONSD更有效。     

益气活血通络方对糖尿病周围神经病变小鼠JNK信号通路蛋白及炎性因子的影响

目的研究益气活血通络方对糖尿病周围神经病变模型小鼠(db/db小鼠)JNK信号通路蛋白及炎性因子的影响,探讨其对db/db小鼠周围神经的保护作用机制。方法 40只db/db小鼠随机分为5组:模型组、硫辛酸组和益气活血通络方高、中、低剂量(6.4、3.2、1.6 g/kg)组,另设8只db/m小鼠作为正常组。灌胃给药,1次/d,连续8周。末次给药后,测定小鼠足底热敏反应时间和运动神经传导速度(MNCV);酶联免疫吸附法(ELISA法)检测血清中白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;Western blot法检测背根神经节中c-jun氨基末端激酶(JNK)和磷酸化的c-jun氨基末端激酶(p-JNK)的蛋白表达。结果与正常组比较,模型组小鼠MNCV减慢,足底热敏反应时间延长,血清中IL-1β、TNF-α水平升高,背根神经节中JNK、p-JNK蛋白的表达增强,差异具有统计学意义(P0.01或P0.05)。与模型组比较,益气活血通络方能提高小鼠MNCV,缩短足底热敏反应时间,降低血清中IL-1β、TNF-α水平,一定程度下调背根神经节中JNK、p-JNK的蛋白表达(P0.01或P0.05)。结论益气活血通络方能抑制JNK信号转导通路的异常激活,减轻db/db小鼠炎症反应,从而保护周围神经的功能。