大鼠急性高眼压后视网膜神经节细胞自噬和副凋亡的发生

目的：观察急性高眼压后不同时间点大鼠视网膜神经节细胞中自噬及副凋亡的发生,并探讨其机制。

方法：将50只健康成年SD雄性大鼠随机分为正常对照组、急性IOP损伤3d,1、4、8wk组。利用高眼压(elevated intraocular pressure,IOP)前房灌注法建立SD大鼠急性IOP损伤模型,取各组大鼠的视网膜组织,采用免疫荧光染色法检测视网膜微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)的表达; 利用透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)检测视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)细胞质中自噬体及胞质空泡的产生,验证自噬及副凋亡的发生。

结果：透射电镜观察可见大鼠RGCs细胞质中包裹着电子致密物的双层或多层膜的自噬泡,正常对照组、急性IOP损伤后3d,1、4、8wk组,RGCs细胞质中每50μm²自噬泡数量分别为0.79±0.43、2.14±0.36、2.29±0.47、1.57±0.51、1.21±0.43个,急性IOP损伤后各组大鼠RGCs内每50μm²自噬泡数量均较正常对照组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组视网膜神经节细胞层(ganglion cell layer,GCL)仅见少量LC3阳性表达,LC3阳性细胞百分比15.90%。急性IOP损伤后3d,1、4、8wk组大鼠GCL中LC3阳性细胞百分比均较正常对照组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。急性IOP损伤后3d,1、4、8wk组大鼠每200μm内RGCs数量较正常对照组明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。急性IOP后3d持续至8wk透射电镜观察可见大量由线粒体和/或内质网肿胀形成的细胞质空泡。

结论：急性IOP损伤后RGCs涉及自噬和副凋亡的激活,各种类型的程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)可作为单一细胞死亡的形式或多种细胞死亡形式共存,参与急性IOP后视网膜神经节细胞的损伤。     

外源性硫化氢调节视神经萎缩相关蛋白1（OPA1）表达对视网膜缺血-再灌注损伤的保护作用

目的　探讨外源性硫化氢（H₂S）对急性高眼压模型诱导视网膜缺血-再灌注损伤（retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)大鼠模型的作用和机制。方法　建立SD雄性大鼠急性高眼压模型（前房加压法）:通过自制的升眼压装置维持120 mmHg（1 kPa=7.5 mmHg）眼压,1 h后解除压力造成RIRI。硫氢化钠（NaHS）作为提供外源性H₂S的供体,随机把52只健康无眼疾的SD雄性大鼠分为对照组（4只）、RIRI组（24只）及NaHS干预组（24只;连续5 d大鼠腹腔内注射NaHS液,造模前15 min再次给药）。后两组再分为造模后 1 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 6个时间点（n=4）。TUNEL法检测各组大鼠视网膜细胞凋亡指数,qPCR检测视网膜中视神经萎缩相关蛋白1（optic atrophy 1,OPA1）mRNA表达,Western blot检测各组大鼠视网膜细胞胞质以及线粒体中OPA1、CytC蛋白的表达,透射电镜观察各组线粒体形态。结果　与对照组比较:细胞凋亡指数除NaHS干预组造模后1 h（0.226±0.01）差异无统计学意义外（P＞0.05）,RIRI组和NaHS干预组均增加（均为P<0.05）,两组视网膜中OPA1 mRNA表达均下降（均为P<0.05）,线粒体内OPA1和CytC的蛋白表达均下降（均为P<0.05）,细胞质内均增加（均为P<0.05）。透射电镜下RIRI组和NaHS干预组线粒体肿胀,可见细胞质空泡及自噬小体。与RIRI组比较:NaHS干预组细胞凋亡减少（P<0.05）;视网膜OPA1 mRNA表达从造模后6 h开始均高于RIRI组（均为P<0.05）,线粒体内OPA1和CytC表达从造模后24 h开始均高于RIRI组（均为P<0.05）;在细胞质内OPA1和CytC表达均低于RIRI组（均为P<0.05）;NaHS干预组各时间点线粒体损伤减轻。结论　H₂S可能通过调节OPA1的表达与分布来减轻RIRI,且开始作用时间为造模后24 h。     

NEP1-40对视网膜缺血-再灌注损伤过程中视网膜细胞的保护作用

背景 视网膜缺血-再灌注损伤（RIRI）可导致细胞凋亡,凋亡是一个复杂的过程,与许多基因有关,探讨药物对RIRI后视细胞凋亡的保护作用具有重要意义. 目的 探讨Nogo-A在大鼠RIRI模型中的表达及其与细胞凋亡的关系,研究Nogo受体竞争性拮抗剂NEP1-40对视网膜细胞的保护作用. 方法 将78只SD大鼠按随机数字表法随机分为正常组、RIRI组和NEP1-40组,RIRI组及NEP1-40组大鼠分别用前房升高眼压的方法升高眼压至大鼠视网膜苍白,持续60 min,然后恢复眼压至视网膜色泽恢复,制作RIRI大鼠模型.术后6h、12 h及1、2、3、7d用过量的水合氯醛处死大鼠,制备视网膜标本.透射电子显微镜下观察各时间点各组大鼠视网膜的超微结构,采用TUNEL法检测视网膜细胞的凋亡情况,并计算细胞凋亡指数（AI）.采用免疫组织化学法检测视网膜组织中Nogo-A蛋白的表达,并采用逆转录PCR（RT-PCR）法半定量检测Nogo-A mRNA在视网膜中的表达. 结果 正常组大鼠视网膜各层结构正常;RIRI组大鼠视网膜再灌注12h后可见少量视网膜细胞器的线粒体嵴异常及空泡化,再灌注后1 ～2d可见凋亡小体;NEP1-40组视网膜的视细胞外节膜盘略疏松,部分线粒体嵴短小,空泡化,未见凋亡小体,视网膜细胞超微结构损害明显轻于RIRI组.TUNEL检测显示细胞凋亡出现于再灌注后6h,并逐渐递增,再灌注后1d凋亡细胞数目达高峰,2d后开始下降,但再灌注后3d仍可见TUNEL阳性细胞.NEP1-40组各时间点间凋亡细胞数目较RIRI组明显减少.正常组、RIRI组和NEP1-40组大鼠在不同时间点细胞AI的差异均有统计学意义（F分组=100.850,P=0.000;F时间=34.309,P=0.000）,其中RIRI组和NEP1-40组大鼠视网膜细胞AI明显高于正常组,而NEP1-40组AI明显低于RIRI组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）.Nogo-A蛋白及其mRNA主要表达于RIRI后的视网膜,再灌注后6h大鼠视网膜中Nogo-A蛋白及其mRNA均开始增加,至再灌注id时表达达高峰,然后逐渐减弱,但再灌注后7d仍有表达.3个组大鼠不同时间点视网膜中Nogo-A蛋白的表达差异有统计学意义（F分组=164.139,P=0.000; F时间=21.772,P=0.000）,Nogo-A mRNA的表达差异有统计学意义（F分组=93.889,P=0.000;F时间=6.349,P=0.000）,NEP 1-40组和RIRI组大鼠视网膜中Nogo-A蛋白及其mRNA的表达均明显高于正常组,而NEP1-40组大鼠视网膜中Nogo-A蛋白及其mRNA在各时间点的表达均低于RIRI组,差异均有统计学意义（P＜0.05）. 结论 Nogo-A可促进RIRI后视网膜细胞的凋亡,NEP1-40能抑制Nogo-A的表达,从而减少视网膜细胞的凋亡,对RIRI后的视网膜细胞有保护作用.     

不同剂量N-乙酰-5-羟色胺（NAS）对视网膜缺血-再灌注损伤大鼠视网膜细胞凋亡的影响

目的　探讨不同剂量N-乙酰-5-羟色胺（N-acetylserotonin,NAS）对视网膜缺血-再灌注损伤（retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI）大鼠视网膜细胞凋亡的影响。方法　成年SD大鼠随机分为正常对照组、RIRI 组和 NAS 组。采用高眼压法建立RIRI大鼠模型。NAS组按照给药剂量的不同分为NAS低剂量组（5 mg·kg^-1）、NAS中剂量组（10 mg·kg^-1）和NAS高剂量组（20 mg·kg^-1）,造模前后30 min腹腔注射NAS。HE染色法观察各组大鼠视网膜形态学的改变,免疫组织化学法检测各组大鼠视网膜中活性Caspase-3的表达,TUNEL法检测各组视网膜细胞凋亡的变化。结果　HE染色结果显示,NAS中剂量组大鼠视网膜各层细胞排列最整齐,视网膜内层厚度［（53.24±1.68）μm］显著薄于RIRI组［（60.54±2.52）μm］及NAS低剂量组［（56.78±1.78）μm］（均为P<0.01）,NAS中剂量组视网膜神经节细胞数［（1113.65±74.40）个·mm^-2］显著多于RIRI组［（719.89±83.67）个·mm^-2］及NAS低剂量组［（882.09±55.62）个·mm^-2］（均为P<0.01）。免疫组织化学结果示,视网膜中活性Caspase-3阳性细胞数RIRI组［（246.08±19.23） 个·mm^-2］及NAS低、中、高剂量组［（196.95±19.83）个·mm^-2、（142.77±18.25）个·mm^-2、（133.10±15.19）个·mm^-2］均显著多于正常对照组［（95.37±10.93）个·mm^-2］（均为P<0.01）;NAS中剂量组视网膜中活性Caspase-3阳性细胞数量显著少于RIRI组及NAS低剂量组（均为P<0.01）。TUNEL检测结果显示,TUNEL阳性细胞数RIRI组［（225.45±18.93）个·mm^-2］及NAS低、中、高剂量组［（175.06±17.69）个·mm^-2、（108.85±13.41）个·mm^-2、（100.37±13.53）个·mm^-2］均多于正常对照组［（81.98±11.29）个·mm^-2］（均为P<0.01）;NAS中剂量组视网膜TUNEL阳性细胞数显著少于RIRI组及NAS低剂量组（均为P<0.01）。结论　腹腔注射NAS治疗可减轻RIRI大鼠视网膜细胞凋亡,具有神经保护作用,中剂量NAS治疗方案最佳。     

兔视神经损伤后视网膜一氧化氮的表达与神经节细胞凋亡关系的研究

目的通过建立兔视神经夹伤模型,观察伤后视网膜组织中一氧化氮的表达与视网膜神经节细胞（RGCs）凋亡的关系,从而探讨RGCs凋亡机制及氨基胍（AG）在伤后对RGCs的保护性作用。方法55只成年大耳白兔,随机分正常对照组（5只）、损伤对照组（25只）、AG治疗组（25只）。损伤组双眼夹伤视神经,按伤后1、3、7、14、21d又随机分为5组（5只／组）。AG治疗组于伤后2min耳缘静脉注射2％AG,损伤对照组同法注射生理盐水。应用TUNEL染色计数凋亡阳性细胞;比色法测量一氧化氮（NO）含量、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活力。结果正常组视网膜切片中极少见RGCs凋亡。损伤组于伤后1d偶见,3—7d逐渐增多,至14d达高峰,之后逐渐下降。正常视网膜组织中很少表达iNOS,但含有少量NO。在损伤后二者含量逐渐增高,与RGCs凋亡呈正相关性。同一时间点损伤对照组和AG治疗组比较差异有统计学意义。结论兔视神经夹伤后,NO合成增多可能是引起RGCs凋亡的一个因素。而AG通过减少NO的合成,降低RGCs凋亡,对RGCs有保护性作用。     

黄芪多糖对急性高眼压诱导大鼠视网膜神经节细胞的保护作用

背景青光眼患者视神经保护的问题日益引起关注。黄芪多糖（APS）是黄芪的主要活性成分,可增加再生神经蛋白的表达并促进损伤的周围神经修复,但其对视网膜神经节细胞（RGCs）再生作用的研究少见报道。目的探讨APS对急性高眼压状态下RGCs的保护作用。方法采用抽签法将40只SPF级sD大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、低剂量APS组和高剂量APS组,每组各10只。低剂量APS组和高剂量APS组大鼠自实验开始每日分别给予APS500mg／kg、2000mg／kg（均溶于2．5ml生理盐水）灌胃,模型对照组仅给予2．5ml生理盐水灌胃,正常对照组不做任何处理。用药2周后,除正常对照组外,其余3个组均抽取0．2ml房水继而单眼前房注射等体积甲基纤维素使眼压升高至22mmHg（1mmHg=0．133kPa）以上制作急性高眼压模型。造模后5d,过量麻醉法处死动物,摘除该眼球制作视网膜石蜡切片,常规组织病理学观察视网膜的形态结构变化,采用免疫组织化学法检测caspase-3蛋白在大鼠视网膜中的表达,采用TUNEL染色法观察和计算各组大鼠RGCs的凋亡率。ImageProPlus5．1软件测量各组大鼠视网膜厚度和神经纤维层厚度。结果大鼠成模后5d,模型对照组、低剂量APS组和高剂量APS组大鼠的眼压均明显高于正常对照组,差异均有统计学意义（t=-8．900、-10．700、-11．300,P〈0．01）。正常对照组大鼠视网膜形态正常;模型对照组大鼠视网膜水肿,细胞排列紊乱;低剂量APS组视网膜可见空泡样变性,但视网膜细胞排列较模型对照组整齐,视网膜水肿减轻;高剂量APS组视网膜水肿较明显。低剂量APS组视网膜厚度、外颗粒层及视神经纤维层厚度值均明显低于模型对照组,差异均有统计学意义（t=-23．700、-14．770、-11．640,P〈0．01）,但高剂量APS组外颗粒层及视神经纤维层厚度与模型对照组比较差异均无统计学意义（t=-0．780、-0．460,P〉0．05）。低剂量APS组大鼠caspase-3蛋白阳性RGCs百分比及RGCs凋亡百分率均明显低于模型对照组（caspase-3蛋白：F=87．710,P=0．001;RGCs凋亡：F=272．840,P〈0．01）,差异均有统计学意义（t=-11．700、-8．600,P〈0．01）,高剂量APS组与模型对照组比较caspase-3蛋白阳性RGCs百分比及RGCs凋亡百分率的差异均有统计学意义（t=-7．900、-6．400,P〈0．05）。结论500mg／kgAPS可有效抑制急性高眼压模型大鼠的视网膜水肿及RGCs的凋亡率,对急性高眼压大鼠的RGCs有保护作用。     

美金胺对急性高眼压大鼠视网膜神经节细胞保护作用的实验研究

目的探讨美金胺对急性高眼压大鼠视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）的保护作用。方法以生理盐水在前房内加压灌注制作大鼠急性高眼压模型，然后腹腔内注射美金胺或生理盐水，分为美金胺治疗组和急性高眼压对照组各20只，另设健康对照组大鼠8只。采用免疫组织化学法和脱氧核苷酸末端转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸末端标记法（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated 2＇-deoxyuridine 5＇-triphosphate-biotin nick end labeling，TUNEL），检测大鼠RGCs caspase-3和凋亡细胞的表达。结果健康对照组无caspase-3与凋亡细胞表达。急性高眼压对照组在高眼压6h后视网膜出现凋亡细胞，逐渐增加至24h达高峰，后逐渐减少，72h时仅有少数凋亡细胞；caspase-3表达改变与凋亡细胞表达相似。美金胺治疗组的变化规律同急性高眼压对照组。急性高眼压6，24和72h后凋亡细胞与caspase-3的表达在3组间的差异均有统计学意义（P值均〈0．01）。结论细胞凋亡可能在视网膜急性高眼压损伤过程中起重要作用，美金胺对RGCs具有保护作用。     

骨髓间充质干细胞移植对缺血-再灌注损伤视网膜中Fas／FasL及caspases-3表达的影响

背景视网膜缺血-再灌注损伤（RIRI）严重影响视力,其损伤机制是视网膜细胞的凋亡,治疗效果不佳。研究证实骨髓间充质干细胞（BMSCs）视网膜下移植后可显著减轻RIRI,而BMSCs视网膜移植所产生的神经保护机制是否与其抑制凋亡作用有关目前尚不清楚。目的观察BMSCs视网膜下移植对RIRI大鼠视网膜中凋亡相关因子Fas／FasL和caspases-3蛋白表达的影响,探讨BMSCs移植治疗RIRI的神经保护机制。方法无菌条件下分离SD大鼠的股骨和胫骨骨髓,离心收集细胞后用DMEM低糖培养液制成骨髓细胞悬液,体外培养大鼠BMSCs,并以1×10^6～2×10^6个／ml的细胞密度和1：2进行传代。64只清洁级健康成年SD大鼠按随机数字表法随机分为正常对照组、模型对照组、BMSCs移植组及PBS对照组,每组16只。用视神经线栓法制备大鼠视网膜RIRI模型,BMSCs移植组大鼠于造模后24h视网膜下注入5×10^4个活BMSCs,PBS对照组以同样的方式注入PBS。用颈椎脱臼法处死大鼠,制备16μm厚视网膜切片。采用免疫组织化学法动态观察BMSCs移植后6、24、48、72h各组大鼠视网膜中Fas、FasL及caspase-3蛋白表达的变化。结果BMSCs视网膜下移植后72h,荧光显微镜观察可见视网膜下Hoechst33324阳性细胞。BMSCs视网膜下移植后6、24、48、72h,正常对照组大鼠视网膜仅见微量Fas、FasL和caspase3的阳性表达;BMSCs视网膜下移植后各时间点,模型对照组与BMSCs移植组大鼠视网膜均可见Fas、FasL、caspase-3阳性表达细胞,免疫组织化学染色强度和细胞数量值均明显高于正常对照组,差异均有统计学意义（均P〈0．01）。随着BMSCs移植时间的延长,各组大鼠视网膜中Fas、FasL及caspase-3阳性细胞数均逐渐下降,各时间点BMSCs移植组大鼠视网膜中Fas、FasL、caspase-3的阳性表达值均明显低于模型对照组和PBS对照组大鼠,差异均有统计学意义（P〈0．05）,但各时间点模型对照组与PBS对照组间大鼠视网膜中Fas、FasL、caspase-3阳性细胞数变化的差异均无统计学意义（均P〉0．05）。结论视网膜下移植BMSCs可下调RIRI大鼠视网膜中凋亡相关蛋白Fas、FasL及caspase-3的表达,从而减轻RIRI大鼠视网膜神经节细胞的凋亡。     

低氧预适应对缺血再灌注损伤大鼠视网膜低氧诱导因子-1α和血红素氧合酶-1表达的影响

目的 观察低氧预适应(hypoxic preconditioning,HPC)后视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)大鼠视网膜低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)的动态变化。方法 取65只Wistar成年大鼠随机分为正常对照组5只,RIRI组30只,HPC+RIRI组30只(HPC后采用高眼压法制成RIRI模型),后两组于RIRI后6 h、12 h、24 h、36 h、3 d、7 d各处死5只鼠。采用尼氏染色观察HPC对各组大鼠视网膜的影响,免疫组织化学法动态观察HPC对RIRI大鼠视网膜HIF-1α、HO-1表达的影响。结果 尼氏染色显示正常对照组大鼠视网膜结构清晰,各层细胞排列整齐紧密;RIRI组大鼠视网膜各层高度水肿,随着时间延长,神经节细胞数量逐渐减少,分布较紊乱、稀疏;HPC+RIRI组与RIRI组比较,各层细胞水肿明显减轻,细胞排列比较规整,神经节细胞数量减少降低,分布较整齐。正常对照组大鼠视网膜组织HIF-1α、HO-1微量表达。RIRI组HIF-1α表达升高,峰值在RIRI后12 h,阳性细胞数为(120.64±5.67)个·mm-2;RIRI后6 h起HPC+RIRI组HIF-1α表达较RIRI组升高,RIRI后12 h达高峰且阳性细胞数为(158.54±4.77)个·mm-2,24 h起逐渐下降,RIRI后7 d时HPC+RIRI组HIF-1α表达仍高于RIRI组;RIRI后RIRI组HO-1表达升高,峰值在RIRI后24 h且阳性细胞数为(129.54±4.58)个·mm-2;RIRI后6 h起HPC+RIRI组HO-1表达较RIRI组升高,RIRI后12 h达高峰且阳性细胞数为(157.56±4.67)个·mm-2,RIRI后24 h仍高表达且阳性细胞数为(150.78±4.97)个·mm-2,此后逐渐下降,RIRI后7 d,HPC+RIRI组仍明显高于RIRI组。与RIRI组比较,HPC+RIRI组RIRI后各时间点HIF-1α、HO-1阳性细胞数均增多,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 HPC可促进RIRI大鼠视网膜HIF-1α、HO-1蛋白的表达,减轻视网膜损伤,具有视网膜保护作用。     

横向定量牵拉损伤对大鼠视网膜神经节细胞自噬水平的影响

目的：研究不同程度牵拉力对大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)存活率和神经传导功能的影响,探讨RGCs自噬水平对上述指标的影响。

方法：选取健康雄性SD大鼠30只随机分为空白组、假手术组、0.15N组、0.3N组、0.6N组,每组各6只。模型组采用横向定量牵拉法制作视神经损伤大鼠模型。空白组大鼠不予处理。假手术组仅暴露视神经,不予牵拉。造模后第1、3d行闪光视觉诱发电位(f-VEP)检查,第3d取视网膜组织行Brn-3a免疫组织化学染色观察RGCs存活情况,透射电子显微镜观察自噬小体,蛋白质印迹法检测LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表达水平。

结果：造模后第3d,与假手术组比较,模型组大鼠f-VEP P2潜伏期延长,振幅降低,视网膜组织中RGCs存活率降低,LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表达水平降低,且各组大鼠视网膜组织中均可见自噬小体。

结论：视神经牵拉伤会降低大鼠早期视网膜自噬水平,导致RGCs死亡和相应的神经传导功能障碍,且不同牵拉力造成的损伤程度不同,RGCs存活情况可能与其自噬水平有关。     

血管内皮细胞生长因子抑制剂对视网膜血管内皮细胞自噬的促进作用

目的　观察血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）抑制剂对小鼠视网膜血管内皮细胞（retinal vascular endothelial cells,RVECs）自噬水平的影响。方法　将RVECs随机分为五组:正常对照组、缺氧对照组、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）组、VEGF抑制剂（anti-VEGF）组和3-MA+anti-VEGF组。采用Western blot法检测RVECs中两种自噬标志蛋白微管相关蛋白1 轻链 3 （LC3）及Beclin-1的表达;计算绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）阳性斑点细胞占比;透射电子显微镜下观察细胞内形成的自噬体的超微结构。结果　正常对照组、缺氧对照组、3-MA组、anti-VEGF及3-MA+anti-VEGF组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ分别为0.182±0.125、0.587±0.101、0.309±0.151、0.914±0.037及0.585±0.098;Beclin-1分别为0.205±0.035、0.590±0.120、0.425±0.082、0.842±0.087及0.607±0.022;GFP阳性斑点细胞比例分别为17.107%±3.521%、90.278%±2.684%、82.591%±4.490%、94.798%±1.760%及89.472%±3.764%。与正常对照组相比,缺氧对照组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1蛋白表达增高,GFP阳性斑点细胞的比例增加（均为P<0.05）,同时自噬体增多。与缺氧对照组相比,3-MA组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平及GFP阳性斑点细胞比率降低（均为P<0.05）,同时自噬体减少;anti-VEGF组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平及GFP阳性斑点细胞比率升高（均为P<0.05）,同时自噬体增多。与anti-VEGF组相比,3-MA+anti-VEGF组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平及GFP阳性斑点细胞比率降低（均为P<0.05）,同时自噬体减少。结论　VEGF抑制剂对缺氧状态下视网膜血管内皮细胞的自噬水平有促进作用。     

Activation of autophagy in the retina after optic nerve crush injury in rats

AIM: To investigate the activation of autophagy in rat retina after optic nerve crush (ONC) and evaluate its relationship with apoptosis of retinal ganglion cells (RGCs). METHODS: The ONC model was established. Western blots were performed to investigate expression of p62, LC3 and Beclin-1. Transmission electron microscopy was performed to discover the autophagosomes in the retina after ONC. Immunohistochemistry was used to confirm the distribution of LC3. TUNEL was performed to confirm the relationship between autophagy and RGC apoptosis. RESULTS: p62/Beclin-1 ratio was declined shortly after ONC until to day 7 after ONC and then restored to a normal level at day 21. There was an opposite change in the LC3-II/LC3I ratio in the retina compared to the p62/Beclin-1 ratio. Increased autophagosomes were found after ONC using transmission electron microscopy, and most of the LC3-stained cells were colocalized with RGCs and Müller cells. More LC3-immunoreactive cells and apoptotic RGCs were found on day 7 following ONC. CONCLUSION: Possible activation of autophagy in RGCs after ONC; autophagy mainly occurred in RGCs and Müller cells, and the apoptosis of RGCs after ONC may be partly associated with autophagic activation.     

热休克蛋白72（HSP72）对大鼠青光眼模型视网膜神经节细胞和视神经的保护作用

目的　探讨热休克蛋白72（heat shock protein 72,HSP72）对大鼠青光眼模型视网膜神经节细胞（retinal ganglial cells,RGCs）和视神经的保护作用。方法　选取Wistar大鼠46只，采用随机数字表法将所有大鼠分为正常对照组（6只）和实验组（40只），实验组40只大鼠中8只不作处理（实验对照组），在制作青光眼模型后2 d，给予16只大鼠热休克反应处理（热休克反应组），16只大鼠硫酸锌腹腔注射（硫酸锌注射组）。观察及比较治疗前后各组大鼠眼压、RGCs中HSP72抗体含量、RGCs平均密度。结果　激光后3 d、7 d、14 d、28 d，各组大鼠右眼眼压均较激光前有所上升，且各组间差异均无统计学意义（均为P>0.05）。正常对照组大鼠不同时间点HSP72抗体在RGCs中无表达，激光后3 d实验组各组大鼠RGCs中HSP72抗体含量缓慢上升，7 d、14 d达高峰，此后逐渐下降至接近正常水平。激光后，实验组各组大鼠RGCs中HSP72抗体含量显著高于正常对照组，且热休克反应组RGCs中HSP72抗体含量均高于实验对照组，低于硫酸锌注射组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。激光后3 d、7 d、14 d、28 d实验组各组大鼠RGCs平均密度均明显低于正常对照组，且热休克反应组RGCs平均密度显著高于实验对照组和硫酸锌注射组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　热休克蛋白反应可在青光眼模型大鼠RGCs中诱导HSP72的生成，且对青光眼性RGCs和视神经具有保护作用。     

银杏叶提取物对急性缺血再灌注后视网膜神经节细胞的保护作用

目的探讨银杏叶提取物（EGb761）对大鼠急性高眼压诱导缺血再灌注模型中视网膜神经节细胞（RGCs）的保护作用。方法60只SD大鼠随机分为5组,右眼为损伤眼,行前房穿刺灌注形成110mmHg的眼压维持60min,左眼未损伤,作为空白对照。损伤后2h及此后每日1次灌胃给药,各组分别给予生理盐水5mg／kg、1％灯盏细辛5mg／kg、0．25％EGb761 5mg／kg、1％EGb7615mg／kg和4％EGb761 5mg／kg。动物损伤后第23天用荧光金行双上丘逆行标记,第28天取眼球标本做视网膜铺片并拍摄照片,计数RGCs并计算其的存活率。结果生理盐水组、1％灯盏细辛组、0．25％EGb761、1％EGb761和4％EGb761组RGCs存活率分别为66．58％、75．62％、74．92％、76．57％、79．87％。生理盐水组与各EGb761组之间差异均有统计学意义（q=0．00,q=0．19,q=0．10,P〈0．01）,不同质量浓度EGb761组之间差异均无统计学意义（q=0．22,q=0．13,q=0．45,P〉0．05）;1％灯盏细辛组与生理盐水对照组比较差异有统计学意义（q=0．16,P=0．02）,与0．25％EGb761组、1％EGb761组、4％EGb761组比较差异均无统计学意义（q=0．20,q=0．01,q=0．50,P〉0．05）。结论在急性高眼压诱导缺血再灌注模型中,银杏叶提取物能有效地保护RGCs。     

睫状神经营养因子对大鼠急性高眼压眼视网膜神经节细胞的保护作用

背景 青光眼可以引起视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡,据报道睫状神经营养因子(CNTF)对外伤性视神经损伤有修复作用,其是否对青光眼视神经病变有保护作用尚少见报道. 目的 观察CNTF对大鼠急性高眼压眼RGCs的保护作用.方法 24只Wistar大鼠双眼采用眼前房平衡盐液加压灌注法建立大鼠急性高眼压模型,造模前2d左眼玻璃体内注入0.5μg CNTF 5μl,右眼以同样的方法注射磷酸钠溶液5μl,另取3只正常大鼠作为正常对照.造模后1、3、7、14 d过量麻醉法处死动物并摘除眼球,制备视网膜组织学切片后采用苏木精-伊红染色法进行形态学观察,光学显微镜下计数RGCs数目;采用免疫组织化学染色法观察RGCs层谷氨酸的表达情况.结果 正常对照组大鼠视网膜各层排列整齐,细胞边界清晰;模型对照组大鼠RGCs细胞膜、细胞核均发现异常改变,有细胞空泡样变;CNTF治疗组大鼠造模后变性的RGCs数量少.与模型对照组比较,造模后3、7、14 d CNTF治疗组RGCs数目明显增加,差异均有统计学意义(均P=0.000).免疫组织化学染色表明,造模后3～7d,CNTF治疗组RGCs层谷氨酸阳性细胞数分别为(5.50±1.04)个／3个高倍视野和(6.00±1.41) 个/3个高倍视野,明显低于模型对照组的(9.00±2.91)个／3个高倍视野和(10.83±1.94)个／3个高倍视野,差异均有统计学意义(均P=0.000),而造模后1d和14 d两组间谷氨酸阳性细胞数的差异均无统计学意义(P=0.578、0.180).结论 CNTF能够下调急性高眼压眼谷氨酸在RGCs中的表达,从而对RGCs提供保护作用.     

甘露醇对实验性视网膜挫伤后神经上皮层水通道蛋白4表达的影响

目的　探讨甘露醇对实验性视网膜挫伤后神经上皮层水通道蛋白4（aquaporin 4,AQP-4）表达的影响。方法　取健康成年大白兔36只,随机分为治疗组、生理盐水组和实验对照组,每组分别在造模后1 d、3 d、7 d、15 d四个时间点进行观察,每个时间点均选取3只兔,均选取右眼为致伤眼。治疗组在造模后立即静脉注射甘露醇（依据体质量按0.5 g·kg^-1用量）,然后每12 h给药1次;生理盐水组造模后在各时间点给予相应剂量的生理盐水;实验对照组造模后不给予任何处理。采用免疫组织化学法检测AQP-4在神经上皮层表达情况。结果　各组兔视网膜神经上皮层AQP-4均有表达,阳性表达主要见于视网膜神经节细胞层与内核层。造模后1 d和3 d,治疗组、生理盐水组和实验对照组3组间视网膜神经上皮层AQP-4的表达总体比较差异均有统计学意义（均为P<0.05）;造模后7 d和15 d,3组间AQP-4的表达总体比较差异均无统计学意义（均为P>0.05）;造模后1 d和3 d治疗组与生理盐水组和实验对照组相比,AQP-4的表达均明显降低（均为P<0.05）;生理盐水组与实验对照组相比,AQP-4的表达在4个时间点差异均无统计学意义（均为P>0.05）。造模后视网膜神经上皮层AQP-4的表达随时间呈动态变化;治疗组、生理盐水组和实验对照组AQP-4的表达在造模后1 d、3 d、7 d、15 d均逐渐下降,4个时间点总体比较差异均有统计学意义（均为P<0.05）;各组在造模后1 d和7 d AQP-4的表达差异均有统计学意义（均为P<0.05）,造模后1 d和15 d以及3 d和15 d比较差异亦均有统计学意义（均为P<0.05）,其余各时间点间两两比较差异均无统计学意义（均为P>0.05）。结论　AQP-4与挫伤后视网膜水肿的发生发展密切相关;甘露醇可明显降低视网膜挫伤后早期神经上皮层AQP-4的表达。     

不同N-乙酰-5-羟色胺(NAS)给药途径对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤的影响

目的探讨腹腔与尾静脉注射N-乙酰-5-羟色胺(N-acetylserotonin,NAS)两种给药途径对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤(retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)组织病理学、活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达及细胞凋亡的影响。方法健康无眼疾成年Sprague-Dawley雄性大鼠54只,采用随机数字表法分为正常对照组(n=6)、RIRI腹腔组(n=12)、RIRI静脉组(n=12)、NAS腹腔组(n=12)和NAS静脉组(n=12),后四组采用升高眼压法建立大鼠RIRI模型。NAS腹腔组、NAS静脉组于建模前30 min分别经腹腔、尾静脉注射NAS(10 mg·kg^-1),RIRI腹腔组、RIRI静脉组于造模前30 min分别经腹腔、尾静脉注射同等剂量的生理盐水。RIRI后24 h,采用免疫组织化学染色检测各组大鼠视网膜中活性Caspase-3的表达,TUNEL染色检测各组视网膜细胞凋亡情况;RIRI后7 d,HE染色观察各组视网膜组织病理学变化。结果HE染色结果示,正常对照组大鼠视网膜各层细胞排列整齐、规则;RIRI后7 d,RIRI腹腔组与RIRI静脉组大鼠视网膜细胞排列稀疏、紊乱,形态不规则,视网膜内层厚度变薄;NAS腹腔组视网膜细胞形态较规则,排列较规整;NAS静脉组视网膜各层形态及细胞排列均趋于正常。NAS静脉组视网膜内层厚度(91.67±1.43)μm显著高于NAS腹腔组(87.80±1.33)μm、RIRI腹腔组(82.37±1.09)μm和RIRI静脉组(82.81±0.90)μm,差异均具有统计学意义(均为P<0.05);且NAS静脉组视网膜神经节细胞数(616.90±79.51)个·mm^-2显著高于NAS腹腔组(529.25±92.05)个·mm^-2、RIRI静脉组(434.42±87.17)个·mm^-2、RIRI腹腔组(390.72±72.12)个·mm^-2,差异均具有统计学意义(均为P<0.05)。免疫组织化学染色结果发现,RIRI后24 h,NAS静脉组活性Caspase-3阳性细胞数(145.01±22.54)个·mm^-2少于NAS腹腔组(221.34±30.84)个·mm^-2,差异具有统计学意义(P<0.05),二者活性Caspase-3阳性细胞数均显著少于RIRI静脉组(380.54±41.25)个·mm^-2和RIRI腹腔组(387.79±26.72)个·mm^-2,差异均具有统计学意义(均为P<0.05)。TUNEL染色结果示,RIRI后24 h,NAS静脉组TUNEL染色阳性细胞数(1468.03±128.40)个·mm^-2少于NAS腹腔组(1968.96±254.98)个·mm^-2,差异具有统计学意义(P<0.05),二者TUNEL染色阳性细胞数均显著少于RIRI静脉组(2122.77±165.76)个·mm^-2和RIRI腹腔组(2140.53±177.96)个·mm^-2,差异均具有统计学意义(均为P<0.05)。结论腹腔及静脉注射NAS治疗均可减少视网膜细胞凋亡,从而减轻RIRI大鼠视网膜损伤,且静脉注射给药的疗效优于腹腔给药。