热疗联合Id-1基因沉默对舌鳞癌CAL-27细胞增殖及侵袭的影响

目的: 探讨热疗联合Id-1基因沉默对舌鳞癌细胞增殖及侵袭的影响及其机制。方法: 将培养的舌鳞癌细胞株CAL-27分为4组。①沉默Id-1组（Id-1-siRNA）—用siRNA基因转染法沉默舌鳞癌CAL-27细胞中Id-1的表达,RT-PCR法检测其Id-1的mRNA表达变化;②热疗组（HT）—细胞置于42.5℃恒温培养箱内40min;③联合组（HT+ Id-1-siRNA）—siRNA基因转染法沉默细胞内Id-1的表达后进行42.5℃、40 min的热疗处理;④空白对照组—常规培养细胞。通过CCK8和Transwell侵袭实验,分别检测CAL-27细胞的增殖能力和侵袭能力变化; Western免疫印迹法检测CAL-27细胞中PI3K、磷酸化Akt（p-Akt）蛋白表达变化。采用SPSS19.0软件包对数据进行统计学分析。结果: siRNA能成功沉默CAL-27细胞内Id-1的表达,沉默Id-1组与空白对照组相比,Id-1的mRNA表达水平下降81.6%。沉默Id-1和热疗均可抑制CAL-27细胞的增殖和侵袭能力,下调PI3K、p-Akt蛋白表达（P<0.05）,热疗联合沉默Id-1作用于CAL-27细胞后的结果更为显著（P<0.01）。结论: 热疗协同沉默Id-1可显著抑制人舌鳞癌细胞的增殖及侵袭能力,其作用是通过PI3K/Akt信号通路来实现。     

尼古丁对舌鳞状细胞癌Cal27细胞的生物学影响

目的 探讨吸烟对舌鳞癌患者Cal27细胞系的影响。方法 将舌鳞癌Cal27细胞传代培养,将对数生长期细胞分为空白对照组、尼古丁组及 7型烟碱乙酰胆碱受体（ 7nAChR）抑制组。空白对照组不作任何处理,尼古丁组用尼古丁连续处理细胞1周, 7nAChR抑制组给予尼古丁及 7nAChR抑制剂α-银环蛇毒素（ -BTX）处理细胞1周。采用电子显微镜观察空白对照组及尼古丁组细胞形态;采用CCK-8试剂盒检测空白对照组及尼古丁组细胞增殖力;细胞划痕实验检测空白对照组及尼古丁组细胞迁移能力;Transwell小室检测空白对照组及尼古丁组细胞侵袭能力;免疫印迹实验测定尼古丁组、空白对照组及 7nAChR抑制组细胞Wnt信号通路蛋白相对表达水平。采用SPSS 20.0软件包对数据进行统计学分析。结果 Cal27细胞形态为不规则多角形,体积较大,周围可见伪足伸展,在细胞培养基上呈铺路石样排列。空白对照组、尼古丁组及 7nAChR抑制组Cal27细胞形态无显著差异。孵育96 h后,尼古丁组细胞数显著大于空白对照组及 7nAChR抑制组（P<0.05）;相同时间内尼古丁组细胞划痕愈合程度显著大于空白对照组与 7nAChR抑制组（P<0.05）;相同时间内,尼古丁组穿过小室细胞数显著大于空白对照组及 7nAChR抑制组（P<0.05）;尼古丁组细胞β-catenin、c-Myc、p-GSK3β及Ror2等Wnt通路蛋白相对表达水平显著高于空白对照组及 7nAChR抑制组细胞（P<0.05）。结论 尼古丁可通过激活Wnt信号通路,提高舌鳞癌Cal27细胞增殖、迁移及侵袭能力。     

顺铂诱导舌鳞癌细胞发生上皮-间充质转化及获得肿瘤干细胞样特性的实验研究

目的: 建立舌鳞癌顺铂耐药株,观察其是否具有肿瘤干细胞样特性以及是否发生上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。方法: 使用顺铂梯度浓度递增法构建舌鳞癌顺铂耐药细胞株,通过MTS、流式细胞术和球囊培养对比舌癌顺铂耐药株和其亲本细胞株化疗耐药性及肿瘤干细胞特性的变化,通过qRT-PCR和Western 免疫印迹检测肿瘤干性因子SOX2、OCT4、BMI1和ABCG2的表达,以及舌癌顺铂耐药株和其亲本细胞株中EMT的指标E-cadherin和Vimentin的表达水平,通过Transwell侵袭迁移实验研究侵袭和迁移能力的变化。采用SPSS 17.0 软件包对数据进行统计学处理。结果: 成功构建了2株舌鳞癌顺铂耐药株CAL27-res和SCC9-res,2株细胞对顺铂具有更强的耐药性。与亲本的舌癌细胞CAL27和SCC9相比,CAL27-res和SCC9-res细胞呈现间充质表型, E-cadherin显著下调(P<0.001),Vimentin和N-cadherin显著上调(P<0.001),侵袭、迁移能力显著增强(P<0.001)。同时,CAL27-res和SCC9-res细胞球囊形成能力增强,肿瘤干性因子SOX2、OCT4、BMI1和ABCG2上调(P<0.001),CD44⁺/CD24^-细胞的比例增高(P<0.001)。结论: 顺铂诱导的舌鳞癌耐药细胞发生EMT且获得了肿瘤干细胞样特性。     

Twist1调控上皮-间质转化促进舌鳞癌细胞顺铂耐药机制的研究

目的: 探讨Twist1调控上皮-间质转化（EMT）促进舌鳞状细胞癌细胞顺铂耐药的机制。方法: 在CAL27/CDDP中转染Twist1 siRNA,免疫印迹及免疫荧光检测E-cadherin、Vimentin的表达;免疫印迹检测Twist1、Slug的表达;Transwell及划痕实验检测细胞的侵袭、迁移能力;MTT检测细胞对顺铂的半抑制率。采用SPSS17.0 软件包对结果进行单因素方差分析。结果: 转染Twist1 siRNA可逆转CAL27/CDDP的EMT表型, E-cadherin表达增强,Vimentin、Twist1及Slug表达降低,细胞的侵袭、迁移能力明显降低,IC₅₀下降41.75%±5.10%（P<0.01）。结论: Twist1可通过调控上皮-间质转化而促进舌鳞癌细胞的顺铂耐药。     

miR-181a抑制舌鳞癌细胞上皮-间充质转化及化疗耐药机制的研究

目的:探讨miR-181a调控上皮-间充质转化(EMT)促进舌鳞状细胞癌细胞顺铂耐药的机制。方法:分别在CAL27/CDDP、CAL27中转染miR-181a mimics、miR-181a LNA,免疫印迹及免疫荧光检测E-cadherin、Vimentin的表达;免疫印迹检测Twist1、Slug的表达;Transwell及划痕实验检测细胞的侵袭、迁移能力;MTT法检测细胞对顺铂的半抑制率。利用生物信息学方法:预测Twist1可能为miR-181a的靶基因。构建包含Twist1结合序列片段的荧光素酶报告基因质粒,进行双荧光素酶报告基因实验。采用SPSS17.0软件包对结果进行单因素方差分析。结果:转染miR-181a mimics可逆转CAL27/CDDP的EMT表型,E-cadherin表达增强,Vimentin、Twist1及Slug表达降低,细胞的侵袭、迁移能力显著降低,IC₅₀下降47.57%±6.23%（P<0.05）。转染miR-181a LNA可诱导CAL27细胞发生EMT,E-cadherin表达降低,Vimentin、Twist1及Slug表达增强,细胞侵袭、迁移能力显著增强,IC₅₀升高55.61%±7.20%（P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验证实,Twist1是miR-181a的靶基因。结论:miR-181a靶向调控Twist1,从而抑制舌鳞癌细胞上皮-间充质转化与顺铂耐药。     

miR-138靶向PLD2基因对口腔癌细胞增殖、迁移的影响

目的：探讨miR-138靶向PLD2基因抑制口腔癌细胞增殖、迁移的机制。方法：口腔癌细胞转染miR-138后,采用RT-PCR检测细胞中miR-138的表达水平,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞转染miR-138后细胞周期的分布,Transwell迁移实验检测细胞的迁移能力;采用Western 免疫印迹实验检测胃癌细胞MMP-9、PLD2及Cyclin D1的表达水平,采用荧光素酶报告实验分析miR-138与PLD2基因的靶向关系。采用SPSS 21.0软件包对数据进行统计学分析。结果：口腔癌细胞转染miR-138后,miR-138相对表达水平为4.28±0.16,显著高于空白对照及miR-NC组（P<0.05）。荧光素酶报告基因实验发现,口腔癌细胞转染miR-138后,PLD2野生质粒荧光素酶相对活性低于其他组（P<0.05）,miR-138组的PLD2的mRNA表达水平低于空白对照及miR-NC 组（P<0.05）。口腔癌细胞转染miR-138后,miR-373组的口腔癌细胞的增殖能力低于空白对照及miR-NC组（P<0.05）。流式细胞术实验发现,miR-138组的G₀/G₁期比例为（64.39±6.49）%,显著高于空白对照组及miR-NC组（P<0.05）;miR-138组S期比例为（13.28±3.16）%,显著低于空白对照组及miR-NC组（P<0.05）;各组G₂/M期比例差异无统计学意义（P>0.05）。Transwell实验发现,口腔癌细胞转染miR-138后,迁移细胞数量为138.46±24.37,显著低于空白对照组及miR-NC组（P<0.05）。Western免疫印迹实验发现,miR-138组MMP-9的相对水平为0.14±0.04、Vimentin的相对水平为0.17±0.02、Cyclin D1的相对水平为0.15±0.03,均显著低于空白对照组及miR-NC组（P<0.05）。结论：miR-138可靶向调控PLD2基因表达,对口腔癌的增殖、迁移能力产生抑制作用。     

Cdc42在舌鳞状细胞癌中的表达及其对细胞增殖、迁移、侵袭的影响

目的：观察细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)在舌鳞癌中的表达及与临床病理特征和预后的关系,探讨体外沉默Cdc42基因对舌鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭及上皮-间质转化（EMT）的影响及作用机制。方法：通过免疫组织化学法检测Cdc42基因在舌鳞癌及癌旁组织中的表达,分析Cdc42表达与舌鳞癌临床病理学参数的相关性及对预后的影响。将人舌鳞状细胞癌CAL27和SCC-4细胞随机分为3组,分别为Cdc42-siRNA组、阴性对照组和空白对照组。设计并构建针对人Cdc42基因序列的3条小干扰RNA (siRNA),应用脂质体介导转染方法分别将Cdc42-siRNA和NCsiRNA转染至Cdc42-siRNA组和阴性对照组,空白对照组仅加入转染试剂。通过实时荧光定量反转录PCR(qRTPCR)和蛋白免疫印迹法（Western blot）检测各组细胞Cdc42的mRNA及蛋白表达,将沉默效率最高的Cdc42-siRNA转染组作为后续实验组。Western blot检测EMT及MAPK JNK/p38通路相关蛋白的表达,CCK-8、细胞划痕实验和Transwell侵袭实验分别检测各组细胞的体外增殖、迁移和侵...     

体外沉默Rce1对舌鳞状细胞癌细胞侵袭和迁移能力的影响

目的 通过RNA干扰技术沉默Rce1基因,探讨Rce1对舌癌细胞侵袭和迁移能力的影响。方法 体外培养舌鳞状细胞癌Cal-27和SCC-4细胞,设计合成Rce1基因的小干扰RNA（siRNA）,采用脂质体载体瞬时转染沉默Rce1基因。根据转染的siRNA不同,将实验组分为Rce1-siRNA-1组、Rce1-siRNA-2组、Rce1-siRNA-3组,脂质体载体分别转染相对应序列的siRNA。脂质体转染siCON作为阴性对照组,不转染siRNA作为空白对照组。采用实时定量聚合酶链反应检测各组Rce1、RhoA以及K-Ras基因的表达,蛋白质印迹法（Western blot）检测Rce1、RhoA、K-Ras、金属基质蛋白酶（MMP）-2及MMP-9的表达,采用体外侵袭实验检测Cal-27和SCC-4的侵袭能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果 实时定量聚合酶链反应及Western blot检测结果显示,与阴性对照组和空白对照组相比,实验组的Rce1基因及蛋白表达均下调（P<0.05）,RhoA、K-Ras基因及蛋白表达无统计学差异（P>0.05）,MMP-2、MMP-9表达下降（P<0.05）。体外侵袭实验表明,与对照组相比,实验组在聚碳酯膜上的细胞总数明显减少（P<0.05）。细胞划痕实验表明,实验组划痕处细胞闭合时间明显长于对照组（P<0.05）。结论 体外沉默Rce1可以有效下调其在舌癌细胞Cal-27和SCC-4中的表达水平,降低迁移和侵袭能力。     

体外沉默二牛龙牛儿基转移酶Ⅰ对舌癌细胞迁移和侵袭的影响

目的 应用RNA干扰技术,体外沉默二牛龙牛儿基转移酶Ⅰ（GGTase-Ⅰ）,研究其在舌癌迁移、侵袭中的作用。方法 登录Genebank确定人GGTase-Ⅰ基因序列,针对GGTase-Ⅰ的基因序列设计并构建3条siRNA,分别将RNA干扰组（GGTase-Ⅰ siRNA1、GGTase-ⅠsiRNA2、GGTase-Ⅰ siRNA3）、阴性对照组（NC-siRNA）和空白对照组转染至舌癌细胞Cal-27,实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）检测各组细胞转染后GGTase-Ⅰ、RhoA基因的mRNA、蛋白表达;选取沉默效率最高的一组siRNA作为实验组,蛋白质印迹法检测各组细胞基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9的表达,GST-pull down实验检测GTP-RhoA蛋白的表达,划痕实验检测细胞迁移能力变化,Transwell小室检测细胞侵袭能力变化。结果 干扰后细胞的GGTase-Ⅰ mRNA、蛋白表达明显下降（P<0.05）,RhoA mRNA和蛋白表达无明显改变,MMP-2、MMP-9、GTP-RhoA的表达下降,迁移、侵袭能力明显下降（P<0.05）。结论 抑制GGTase-Ⅰ表达,可降低舌癌细胞的迁移、侵袭能力,对GGTase-Ⅰ的深入研究可能为舌癌的治疗提供新的有效分子靶点。     

Ezrin对人舌鳞癌顺铂耐药细胞上皮-间质转化的影响

目的：探讨Ezrin蛋白下调是否能影响人舌鳞癌顺铂耐药细胞CAL27/CDDP发生上皮—间质转化（epithelial?to?mesenchymal transition ,EMT）。方法以人舌鳞癌细胞株CAL27（亲本细胞）及其顺铂耐药细胞株CAL27/CDDP（耐药细胞）为研究对象,MTT检测CAL27及CAL27/CDDP的半数抑制率（half maximal inhibitory concentration ,IC50）,光学显微镜下观察细胞形态学变化;蛋白印迹检测上皮间质相关标记蛋白Vimentin、E?cadherin的表达变化和Ezrin的表达水平,Transwell检测细胞的迁移能力。通过小干扰RNA（Ezrin?Si1、Ezrin?Si2）转染CAL27/CDDP,检测Ezrin、Vimentin与E?cadherin蛋白表达及细胞迁移能力的变化。结果人舌鳞癌顺铂耐药细胞CAL27/CDDP较亲本细胞CAL27 IC50提高6.8倍,差异具有统计学意义（t=5.283,P=0.0007）;CAL27细胞呈多边形上皮样结构、成簇生长、细胞之间连接紧密,CAL27/CDDP表现为单个分散的长梭形细胞,细胞间连接消失,呈现间质细胞表型;同时,相较于亲本细胞CAL27,CAL27/CDDP间质标志蛋白Vimentin表达升高（t=4.450,P=0.011）,上皮标志蛋白E?cadherin表达降低（t=10.980,P<0.001）,Ezrin蛋白表达上调（t=6.487,P=0.003）,细胞的迁移能力增强（t=3.403,P=0.010）。小干扰RNA转染人舌鳞癌顺铂耐药细胞CAL27/CDDP后Ezrin蛋白表达明显降低,Vimentin表达降低,E?cadherin表达升高,细胞的迁移能力显著下降。结论下调Ezrin能抑制人舌鳞癌顺铂耐药细胞发生上皮—间质转化及转移。     

Met激酶抑制剂BMS-777607对舌鳞癌细胞CAL27增殖、凋亡的影响

目的:探讨Met激酶抑制剂BMS-777607对人舌鳞状细胞癌(鳞癌)CAL27细胞增殖、凋亡的影响.方法:采用MTT、克隆形成实验及EdU细胞成像实验,检测BMS-777607对CAL27细胞增殖的影响.通过Heochst33342染色,观察BMS-777607对CAL27细胞的凋亡形态变化.采用JC-1染色,检测B...     

基质金属蛋白酶9抑制剂对人舌鳞癌SCC-25细胞侵袭、迁移能力的影响及机制探讨

目的:探讨基质金属蛋白酶9(MMP-9)抑制剂对人舌鳞状细胞癌(TSCC)SCC-25细胞侵袭、迁移能力的影响及其相关机制.方法:取对数生长期SCC-25细胞,分别采用0、5、10、20μmol/L的MMP-9抑制剂BB-94干预,分别设为对照组、实验A组、实验B组和实验C组.采用RT-qPCR和Western免疫印迹...     

shRNA干扰Rce1基因表达对口腔鳞癌细胞放射敏感性的影响

目的:观察shRNA干扰Ras转化酶1（Rce1）基因表达对口腔鳞癌（OSCC）细胞放射敏感性的影响。方法:取对数期CAL27细胞,随机分为Control组、shRNA-NC组、shRNA-Rce1组。Control组不处理,shRNA-NC组、shRNA-Rce1组分别采用脂质体转染法转染shRNA-NC、shRNA-Rce1表达载体。采用二甲基噻唑（MTT）法检测不同放射剂量（2、4、6、8、10 Gy）射线照射对CAL27细胞增殖抑制率的影响,计算放射对细胞的半数抑制剂量。利用AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,Western免疫印迹法检测细胞B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）、存活蛋白（Survivin）、半胱天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）蛋白表达量。采用SPSS 19.0软件包对数据进行统计学分析。结果:与Control组、shRNA-NC组相比,不同放射剂量对shRNA-Rce1组CAL27细胞的增殖抑制率显著升高,半数抑制剂量显著降低（P<0.05）;与Control组、shRNA-NC组相比,shRNA-Rce1组凋亡率显著升高（P<0.05）;与Control组、shRNA-NC组相比,shRNA-Rce1组Bcl-2、Survivin蛋白表达量显著降低,Caspase-3蛋白表达量显著升高（P<0.05）。结论:shRNA干扰Rce1基因表达可增强OSCC细胞放射敏感性,降低半数抑制剂量,促进细胞凋亡,并减少凋亡抑制蛋白Bcl-2、Survivin表达,增加凋亡蛋白Caspase-3表达。     

丙泊酚对人咽鳞癌FADu细胞系增殖、迁移、侵袭和凋亡的调节作用

目的:探讨丙泊酚对人咽鳞癌FADu细胞系增殖、迁移、侵袭和促进凋亡的潜在机制.方法:将不同浓度(0、5、10、20 μg/mL)丙泊酚处理的人咽鳞癌FADu细胞系分别进行CCK-8毒性测试,平板克隆实验测试增殖能力,划痕实验检测细胞横向迁移能力,Transwell实验检测细胞纵向迁移能力和侵袭能力,通过Western免...     

干扰素诱导蛋白10对舌鳞癌细胞增殖、凋亡的影响

目的: 探讨干扰素诱导蛋白10（IP-10）对舌鳞癌细胞CAL-27增殖、凋亡的影响以及与CXCR3A、CXCR3B基因表达的关系。方法: 将CAL-27 细胞分为 3 个实验组和 1 个对照组,3 个实验组分别采用10、20、40 ng/mL 的IP-10刺激,对照组不予刺激。刺激12、24、48、72 h时,利用CCK-8法检测 4 组细胞的增殖活性;24 h 时,利用流式细胞仪检测细胞凋亡。采用Q-PCR检测10 ng/mL IP-10作用下,CAL-27细胞在12、24、48、72 h时CXCR3A、CXCR3B mRNA的表达情况。采用SPSS16.0软件包对数据进行单因素方差分析。结果: 12 h和24 h 时,3种浓度的IP-10 均能促进 CAL-27 细胞增殖（P<0.05）;在 48 h 时,只有40 ng/mL的 IP-10 能够促进 CAL-27 细胞增殖（P<0.01）; 而在72 h时,3种浓度的 IP-10对 CAL-27 细胞的增殖均无促进作用（P>0.05）。24 h后,3个实验组与对照组相比,CAL-27细胞的增殖率降低。24 h 时,3种实验组细胞凋亡率分别为（3.377±0.575）%、（6.867±2.848）%和（5.317±2.794）%,与对照组相比具有显著差异（P<0.05）,但各实验组间无显著差异（P>0.05)。12、24、48、72 h时,CXCR3A mRNA的表达量分别为0.0130±0.0007、0.0274±0.0005 、0.0204±0.0011和0.0174±0.0006,组间差异显著（P<0.05）;CXCR3B mRNA的表达量分别为0.0124±0.0015、0.0209±0.0016、0.0297±0.0013和0.0386±0.0010,组间差异显著（P<0.05）。结论: IP-10既能促进舌鳞癌细胞CAL-27增殖又能够诱导其凋亡,随着作用时间的推移,细胞增殖率降低;CXCR3A mRNA的表达先升高后降低,而CXCR3B mRNA的表达逐渐升高。CXCR3A、CXCR3B可能参与调控IP-10诱导下的舌鳞癌细胞的增殖和凋亡。     

β肾上腺素受体在舌癌CAL-27细胞系的表达及β受体阻滞剂对其增殖、迁移、侵袭的影响

目的: 研究舌癌CAL-27细胞系中β-AR的表达及β受体阻滞剂对其增殖、迁移、侵袭的影响。方法: 采用Pan CK抗体对培养的正常口腔上皮细胞进行鉴定;免疫组织化学法及qRT-PCR法检测β-AR在舌癌CAL-27细胞的表达;CCK-8法、细胞划痕实验、Transwell法分别检测普萘洛尔及美托洛尔对CAL-27细胞增殖、迁移、侵袭的影响。采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学分析。结果: β1-AR、β2-AR在CAL-27细胞的表达均显著高于正常口腔上皮细胞（P<0.05）;β2-AR在CAL-27细胞的mRNA水平表达低于正常口腔上皮细胞而β1-AR表达高于正常口腔上皮细胞;两种药物对CAL-27细胞增殖均有抑制作用,药物浓度>50 μmol/L时,普萘洛尔抑制增殖的作用更强（P<0.05）;2种药物浓度>2.5 μmol/L,对CAL-27细胞迁移均有抑制作用,普萘洛尔的抑制作用更强;药物浓度>1.0 μmol/L,2种药物对CAL-27细胞侵袭均有抑制作用（P<0.05）,普萘洛尔对CAL-27细胞迁移抑制作用更强。结论: 在舌癌CAL-27细胞中, β1-AR在mRNA水平的表达高于正常口腔上皮细胞而β2-AR的表达低于正常口腔上皮细胞;低浓度普萘洛尔及美托洛尔对CAL-27细胞的增殖无明显抑制作用,但能抑制CAL-27的迁移和侵袭。