靶向胃癌干细胞单克隆抗体2C12的鉴定及功能研究

目的:研究胃癌干细胞的功能性单克隆抗体2C12体外功能实验,为胃癌干细胞的靶向治疗提供候选单抗药物。方法:以胃癌细胞系SNU-5为细胞模型,流式细胞术检测其亲本细胞和通过无血清悬浮培养的球体细胞中2C12+细胞的表达水平,双色细胞免疫荧光检测单抗2C12和CD90识别的抗原在SNU-5细胞中的表达情况。流式细胞术分选SNU-5细胞中2C12+和2C12-细胞,采用无血清悬浮培养成球实验和Transwell小室法分别检测其自我更新能力和侵袭能力。用单抗2C12处理SNU-5的球体细胞后,检测其对SNU-5的球体细胞自我更新能力和侵袭能力的影响。结果:2C12+细胞在SNU-5的球体细胞中的表达水平明显高于亲本细胞。免疫荧光结果显示单抗2C12识别的抗原分子能与CD90在SNU-5细胞上共定位。流式细胞术分选结果表明SNU-5细胞中2C12+细胞成球数明显高于2C12-细胞（103.3±9.07 vs 50.67±5.86）（P<0.01）,侵袭能力也明显较高（209.3±12.9 vs 99.0±3.61）（P<0.01）。对2C12单抗的体外功能研究发现,不同浓度的单抗2C12（0 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL）能显著抑制SNU-5的球体细胞的成球能力（122.0±5.66、83.0±5.66、59.0±4.24）,抑制率达到31.97%和51.64%,同时侵袭能力也显著降低（178.0±8.49、106.5±5.0、78.0±2.83）,抑制率达到40.17%和56.18%。结论:单抗2C12是一株抗胃癌干细胞的功能性单抗,能够显著抑制胃癌干细胞的干性相关特征,为胃癌干细胞靶向治疗的候选抗体药物。     

一株胃癌干细胞功能性单克隆抗体的鉴定及功能研究

[目的]从抗人胃癌干细胞单克隆抗体杂交瘤库中筛选鉴定识别胃癌干细胞的单克隆抗体,并证明其具有抑制胃癌干细胞自我更新能力和侵袭功能的功能性单抗,为靶向人胃癌干细胞治疗胃癌提供有治疗潜能的单抗候选药物。[方法]采用无血清培养、PKH26染色及流式细胞术等方法确定人胃癌细胞系SNU-5中存在肿瘤干细胞,可作为研究抗人胃癌干细胞单抗的细胞模型。应用双色免疫荧光、流式细胞分选等技术分析鉴定单克隆抗体25G5是识别胃癌干细胞的单克隆抗体。用肿瘤干细胞的成球生长实验、Transwell侵袭实验及耐药性实验研究分析25G5单抗对胃癌干细胞功能的影响。[结果]SNU-5细胞在无血清培养基中存活并增殖成球形生长,SNU-5球体细胞中表达胃癌干细胞标志物CD44~+和CD90~+的细胞比例分别为72.4%和8.55%,较亲本细胞分别提高了21.3倍和2.4倍,表明SNU-5中存在有CD44~+、CD90~+的胃癌干细胞。细胞免疫荧光结果显示25G5单抗识别的抗原分子与CD44、CD90胃癌干细胞标志物共染表达于胃癌干细胞膜上。流式细胞术分选的25G5~+细胞的成球率为(21.4±0.3)%,显著高于25G5-细胞(12.3±0.7)%和亲本细胞(16.1±1.0)%。Transwell侵袭实验、细胞耐药性实验和动物体内致瘤实验结果显示25G5~+细胞的侵袭能力和耐药能力也显著高于25G5-细胞和亲本细胞,表明25G5单抗识别的细胞是具有自我更新、高侵袭、高耐药性特征的肿瘤干细胞。体外功能研究发现,单抗25G5能显著抑制SNU-5胃癌细胞在无血清培养液中的成球生长,抑制率可达46.4%,也能显著地抑制SNU-5成球细胞(Sphere细胞)的侵袭,抑制率达58.4%。单抗25G5是一株能显著抑制SNU-5中肿瘤干细胞自我更新和侵袭能力的功能性抗人胃癌干细胞单抗。[结论]单克隆抗体25G5是一株抗胃癌干细胞的功能性单抗,为胃癌干细胞靶向治疗的候选抗体药物。     

抗肝癌干细胞单克隆抗体的鉴定及功能

目的:鉴定可靶向肝癌干细胞的功能性单克隆抗体,为肝癌干细胞靶向治疗提供抗体候选药物.方法:以肝癌细胞系Bel7402-V3为模型,采用流式细胞术分选ESA+细胞后检测其耐药能力及致瘤能力.双色细胞免疫荧光检测单抗3G7和ESA识别的抗原蛋白在Bel7402-V3细胞中的表达情况,同时采用此法检测sphere中PKH26与3G7的共染情况.流式细胞术分选3G7+细胞后检测其自我更新能力,并采用CCK-8法检测其耐药能力;甲基纤维素成球实验,检测单抗3G7对细胞自我更新能力的影响;CCK-8法检测单抗3G7对细胞增殖和耐药能力的影响.结果:流式细胞术分选ESA+细胞的耐药性明显高于ESA-细胞,其IC50值分别为2.30 μmol/L、0.49 μmol/L(P<0.01),ESA+细胞的致瘤性较ESA-细胞高至少40倍.细胞免疫荧光结果显示单抗3G7识别的抗原分子能与ESA在Bel7402-V3细胞上共定位,并能与标识干细胞的PKH26染料共染.流式细胞术分选3G7+细胞体外成球率明显高于3G7-细胞[(30.4±3.4)% vs (8.8±1.8)%](P<0.01),耐药性也明显较高(IC50值:1.014 μmol/L vs 0.365 μmol/L).抗体体外功能研究发现,单抗3G7能显著抑制Bel7402-V3的甲基纤维素成球,抑制率达到37.2%;同时,单抗3G7能抑制sphere细胞的增殖,抑制率为41.7%(P<0.01);经单抗3G7处理过细胞的耐药能力显著降低,实验组与对照组的IC50分别为0.56 μg/ml和0.68 μg/ml.结论:单克隆抗体3G7是一株抗肝癌干细胞的功能性单抗,为肝癌干细胞靶向治疗的候选抗体药物.     

杂交瘤单抗4F11识别CD90+肝癌干细胞并抑制其侵袭【院士点评：靶向CD90+肿瘤干细胞可能治疗肝癌转移】

目的:筛选识别肝癌干细胞的单克隆抗体并研究其体外的抗肿瘤作用,为肝癌干细胞靶向治疗提供候选抗体药物。方法:无血清悬浮培养及PKH26染色分析人肝癌细胞株MHCC97H中是否存在肝癌干细胞。流式细胞术检测MH-CC97H细胞及其成球细胞中7种肿瘤干细胞标志物的表达,以及MHCC97H细胞中肝癌干细胞标志物CD90和不同杂交瘤单抗3G7、4F11、11C9、15B7、15D2识别抗原的共表达情况。无血清悬浮培养法和CCK8法检测单抗4F11对MHCC97H细胞及其成球细胞自我更新和增殖的影响,Transwell实验检测单抗4F11对MHCC97H细胞体外侵袭和迁移的影响。结果:PKH26染色实验显示,MHCC97H细胞球体由单个肝癌干细胞增殖分化形成。MHCC97H细胞球中CD90+MHCC97H细胞比例较亲本MHCC97H细胞显著增加[(18.0±7.5)%vs(2.3±1.0)%,P<0.05]。杂交瘤单抗4F11、3G7、11C9、15B7、15D2均能识别MHCC97H细胞中CD90+MHCC97H细胞,其中单抗4F11对CD90+MHCC97H细胞的识别比例为(47.2±4.4)%,其对MHCC97H成球细胞增殖的抑制率远大于对亲本MHCC97H细胞增殖的抑制率[(29.4±3.8)%vs(12.0±2.2)%,P<0.05]。单抗4F11抑制MHCC97H细胞成球,抑制率达(58.0±20.8)%。单抗4F11能显著抑制MHCC97H细胞体外侵袭和迁移,抑制率分别为(48.6±5.1)%和(47.6±3.6)%。结论:杂交瘤单抗4F11能特异性识别CD90+肝癌干细胞,抑制肝癌细胞的侵袭和迁移,可作为肝癌干细胞靶向治疗的候选抗体药物。     

高转移胃癌细胞株的建立及其肿瘤干细胞的生物学特征

目的:建立高转移胃癌细胞株并研究其肿瘤干细胞生物学特征.方法:将胃癌细胞株SNU-5接种至裸鼠皮下成瘤后,取肺部转移灶,通过机械分离法并反复接种裸鼠,获取细胞株SNU-5-V12,采用无血清悬浮培养及PKH26染色确定SNU-5-V12细胞中存在肿瘤干细胞.流式细胞术分析SNU-5和SNU-5-V12细胞中CD44肿瘤干细胞标志物表达情况,分选SNU-5和SNU-5-V12细胞中CD44+细胞并进行体外生物学特征研究及裸鼠致瘤实验.结果:建立高转移SNU-5-V12细胞株,SNU-5-V12细胞无血清悬浮培养11d后形成的细胞球体中存在单个PKH26阳性细胞.流式分析显示高转移SNU-5-V12细胞中干细胞标志物CD44比例显著高于SNU-5细胞[(72.9±1.5)％ vs (8.96±1.2)％],且SNU-5-V12的CD44+细胞比SNU-5的CD44+细胞具有更强的自我更新能力[成球率(27.8±1.7)％ vs (20.4±1.0)％,P＜0.01],转移细胞数增加1.64倍[(329.5±7.5) vs (200±2.0)个,P＜0.01],耐药能力也显著增强[IC50:(0.286 vs 0.196)μ∥ml,P＜0.01],裸鼠皮下接种2×102个CD44+ SNU-5-V12细胞2个月2/6裸鼠可致瘤,而CD44+ SNU-5细胞需要接种2×104个细胞2个月时仅1/6裸鼠致瘤.结论:获得高转移胃癌细胞株SNU-5-V12,其CD44+细胞体内外功能显著增强,为胃癌干细胞的靶向治疗提供有价值的细胞模型.     

单克隆抗体18H12抑制PAMC-82胃癌干细胞的自我更新和侵袭能力

目的：探讨靶向胃癌干细胞的功能性单克隆抗体18H12对胃癌干细胞自我更新和侵袭能力的作用。方法：以胃癌 细胞株PAMC-82为模型,用流式细胞术检测其亲本细胞和通过成球培养富集干细胞后细胞膜表面烯醇化酶1（enolase-1,ENO1） 的表达水平,用流式细胞术分选出ENO1+和ENO1-细胞,并检测其自我更新和侵袭能力。以商业化的ENO1抗原和抗体作为样 品,利用免疫共沉淀实验（co-immunoprecipitation,CoIP）验证靶向ENO1的18H12抗体能够准确识别ENO1。分别用18H12处理 PAMC-82细胞12、24、48 h后, 用甲基纤维素成球实验和Transwell小室法分别检测18H12对PAMC-82细胞自我更新和侵袭能力的影 响。结果：细胞膜表面的ENO1在PAMC-82球体细胞中的表达水平明显高于亲本细胞（P<0.01）,ENO1可作为一个靶向胃癌干细 胞的潜在靶点。分选的ENO1+细胞的自我更新和侵袭能力明显强于ENO1-细胞和亲本细胞（P<0.05或P<0.01）。18H12抗体能够 准确识别ENO1,与商业化抗体识别的条带一致。单抗18H12能显著抑制PAMC-82细胞的自我更新和侵袭能力（均P<0.01）。结 论：单克隆抗体18H12能够显著抑制胃癌干细胞的自我更新和侵袭能力,有望成为靶向胃癌干细胞的候选抗体药物。     

乳腺癌干细胞富集与鉴定的初步研究

目的:通过从MCF-7、ZR-75-1、MDA-MB-231乳腺癌细胞系中培养富集及鉴定乳腺癌干细胞(breast cancer stem cell,BCSC),寻找培养与富集乳腺癌干细胞的方法。方法:贴壁培养MCF-7、ZR-75-1、MDA-MB-231细胞系,倒置显微镜观察各细胞形态;流式细胞仪分别分选收集CD44-CD24-、CD44-CD24+、CD44+CD24-及 CD44+CD24+ 细胞,其中CD44+CD24-为乳腺癌干细胞,其余三类为对照组;MTT法计数细胞,绘制MCF-7、ZR-75-1、MDA-MB-231细胞系生长曲线;MCF-7细胞系进行无血清悬浮培养1个周期,流式细胞仪检测分子表面标记物CD44+CD24-含量,贴壁培养的CD44+CD24-乳腺癌干细胞为对照组;将分选的MCF-7（CD44+CD24-）和分选的其余MCF-7细胞（非CD44+CD24-）进行干性成球实验,鉴定CD44+CD24-干性表达。结果:MCF-7、MDA-MB-231细胞系富含表面标志物CD44-CD24-的乳腺癌细胞;ZR-75-1细胞系富含分子表面标志物CD44+CD24+的乳腺癌细胞;生长曲线显示MCF-7、ZR-75-1、MDA-MB-231均呈持续增长,MDA-MB-231细胞生长较MCF-7、ZR-75-1细胞快;通过无血清悬浮培养CD44+CD24-乳腺癌干细胞由19.4%富集到88.9%;成球实验中CD44+CD24-表型细胞成球数量较分选的其余MCF-7细胞（非CD44+CD24-表型）明显增多,成球率分别为（36.5±1.7）%,（1.1±0.5）%。结论:流式细胞仪可成功分选出分子表面标志物为CD44+CD24-的乳腺癌干细胞;CD44+CD24-可能不是乳腺癌干细胞唯一的表面标志物;MDA-MB-231细胞系较MCF-7、ZR-75-1细胞系生长快;无血清悬浮培养法可简便、高效地富集乳腺癌干细胞;CD44+CD24-乳腺癌干细胞干性表达较强。     

人参皂苷Rg3 通过PI3K/AKT 信号系统调控CaM 基因表达促进胃癌BGC-823 细胞的凋亡

[摘要] 目的：探讨人参皂甙Rg3 通过PI3K/AKT信号通路干扰CaM基因的表达及对胃癌BGC-823 细胞凋亡的影响。方法:胃癌BGC-823 细胞的培养与传代完成后,Western blotting 检测胰岛素样生长因子-1 (insulin-like growth factor-1,IGF-1)和/或Rg3分别作用胃癌BGC-823 细胞后p-AKT和CaM 蛋白表达水平,MTT法检测IGF-1 和/或Rg3 对胃癌BGC-823 细胞增殖的影响,Transwell 法检测IGF-1 和/或Rg3 对胃癌BGC-823 细胞侵袭的影响,流式细胞术检测IGF-1 和/或Rg3 对胃癌BGC-823 细胞凋亡的影响。结果：随着IGF-1 作用时间延长,胃癌BGC-823 细胞中p-AKT蛋白和CaM蛋白的表达水平均明显提高（均P<0.05）;与空白对照组比较,Rg3 组明显抑制胃癌BGC-823 细胞增殖,而IGF-1 组和IGF-1+Rg3 组明显促进胃癌BGC-823 细胞增殖（均P<0.05）;与空白对照组比较,Rg3 组明显降低胃癌BGC-823 细胞侵袭,而IGF-1 组和IGF-1+Rg3 组明显促进胃癌BGC-823 细胞侵袭能力（均P<0.05）;流式细胞术检测显示,与空白对照组比较,Rg3 组明显促进胃癌BGC-823 细胞凋亡,而IGF-1 组和IGF-1+Rg3 组明显抑制胃癌BGC-823 细胞凋亡（均P<0.05）。结论:人参皂甙Rg3 通过阻断PI3K/AKT信号通路来抑制CaM的表达,进而促进胃癌BGC-823细胞的凋亡。     

外阴鳞状细胞癌肿瘤干细胞的分选和鉴定

目的:分离外阴鳞状细胞癌A-431细胞系中CD44+的细胞亚群,鉴定其具有肿瘤干细胞特性。方法:采用流式细胞术分选出CD44免疫荧光抗体标记的CD44+细胞亚群,检测CD133、CD34蛋白在CD44+和CD44-中表达的差异,检测CD44+及CD44-细胞亚群的细胞周期。结果:A-431细胞系中CD44+细胞亚群约占4%,胚胎干细胞因子CD133、CD34在CD44+和CD44-的VSCC中表达存在显著性差异,主要在细胞膜上表达,CD44+的肿瘤细胞亚群97.69%处于G1期,CD44-的肿瘤细胞亚群61.12%处于S期。结论:在 A-431细胞系中 CD44 可以作为分选肿瘤干细胞的特异性表面标志物,CD133、CD34 在 CD44+的肿瘤细胞高表达,可能成为分选外阴鳞癌肿瘤干细胞的特异性表面标志物,CD44+肿瘤细胞具有典型的干细胞增殖特点。     

曲古菌素A对胃癌细胞系BGC-823组蛋白H4乙酰化水平及细胞凋亡的作用

[目的]探讨组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂曲古菌素A（TSA）对胃癌细胞系BGC-823中组蛋白H4乙酰化水平及细胞凋亡的影响。[方法]免疫细胞化学法检测TSA干预前后胃癌细胞系BGC-823中乙酰化组蛋白H4的表达，流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率。[结果]TSA干预后胃癌细胞系BGC-823中乙酰化组蛋白H4的表达水平明显升高，乙酰化组蛋白H4阳性细胞数从1．38±1．02上升至31．6±1．02，与未干预相比两者表达有显著性差异（P〈0．01），流式细胞仪分析显示G2期细胞增多，从0．01％上升至19．17％，细胞凋亡率增加到29．9％。[结论]TSA可促进胃癌细胞系BGC-823中乙酰化组蛋白H4的表达，诱导BGC-823细胞凋亡。     

胰腺癌干性细胞的分选及其生物学特性的初步鉴定

目的:应用流式细胞仪从人胰腺癌细胞系PANC-1中分选出肿瘤干性细胞,并对其生物学特性进行初步鉴定。方法:流式细胞仪分选出CD44+CD24+、CD44-CD24+、CD44+CD24-和CD44-CD24-4类细胞亚群;6MV X射线照射前后,DCFH-DA探针检查各亚群活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）水平;将各亚群细胞接种于BALB/C-nu/nu裸小鼠,观察、比较成瘤率。结果:4个亚群细胞比例如下:CD44+CD24+（0.6±0.2）%、CD44+CD24-（89.3±2.6）%、CD44-CD24+（4.1±1.3）%和CD44-CD24-（6.0±1.7）%; 与其他亚群比较,CD44+CD24+干性细胞活性氧水平在X线照射后最低,平均荧光强度（MFI）显著低于其他3组细胞（P值均<0.01）。1×102个CD44+CD24+细胞接种于裸鼠,6周后成瘤（1/8）;接种1×104个CD44-CD24-细胞,12周后未成瘤。结论:分选出的各亚群中CD44+CD24+更具有胰腺癌干细胞特性,体内成瘤能力最强,其余依次为CD44+CD24-、CD44-CD24+、CD44-CD24-;CD44+CD24+细胞内ROS低水平,为进一步研究胰腺癌干性细胞ROS的基因调控奠定基础。     

原代胃癌干细胞CD44表达意义探讨

目的 肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)在恶性肿瘤的发生发展中起着重要作用,且是肿瘤耐药及复发的根源.本研究探讨CSCs表面标记蛋白CD44在分离及鉴定胃癌干细胞中的重要作用.方法 收集2015-11-06-2015-12 01华中科技大学同济医学院附属同济医院3例胃癌患者手术标本.首先采用胶原酶消化法获取胃癌细胞,部分细胞分别贴壁及悬浮培养,并采用免疫荧光及流式分析的方法检测胃癌球形体中CD44的表达情况.部分细胞采用流式细胞仪分选得到CD44+及CD44胃癌细胞,并通过无血清悬浮培养法比较两群细胞的球形体形成能力.结果 免疫荧光显示,CD44蛋白在球形体中高表达;流式分析发现,贴壁的原代胃癌细胞中CD44+细胞的比例为(30.73±7.6)％,而球形体中CD44+细胞的比例高达(56.4±5.58)％,差异有统计学意义,P=0.009.球形体形成实验结果表明,与CD44-细胞相比,CD44+胃癌细胞具有更强的球形体形成能力,1 000个CD44+及CD44-胃癌细胞分别形成(14.33±2.52)和(1.67±0.58)个球形体,差异有统计学意义,P=0.001.通过比较发现,球形体培养对胃癌干细胞的富集效率为0.3％,而CD44对胃癌干细胞的富集效率为1.4％.结论 CD44是胃癌干细胞的表面标记蛋白,其可能成为胃癌靶向治疗的可靠靶标.     

人胃癌CD90+干细胞可能影响胃癌的转移和患者的预后

目的： 分离并鉴定人胃癌细胞系SNU-5中的肿瘤干细胞,探讨人胃癌CD90+干细胞对胃癌转移和预后的影响。 方法： 无血清悬浮培养及PKH26染色确定SNU-5细胞系中是否存在肿瘤干细胞,流式细胞术分析SNU-5亲本及球体细胞中肿瘤干细胞标志物的表达,分选CD90+SNU-5细胞并进行体外生物学特征研究及SCID鼠致瘤实验。收集肿瘤医院腹部外科95例胃癌患者肿瘤病理标本,免疫组化方法检测胃癌组织中CD90的表达。 结果： SNU-5细胞无血清悬浮培养11 d后形成的细胞球体中存在单个PKH26阳性细胞。无血清悬浮培养可将CD90+SNU-5细胞富集6.1倍,且CD90可在球体细胞中与标示干细胞的PKH26共染。CD90+SNU-5细胞较CD90- SNU-5细胞和亲本SNU-5细胞具有更高的自我更新能力\[成球率（7.7±1.1）% vs (1.3±0.4)%、(1.8±0.3)%,均P<0.01\]和侵袭能力\[侵袭细胞数(283.3±30.2) vs (48.0±7.5)、(156.7±72)个,均P<0.01\]。CD90+SNU-5细胞在重症联合免疫缺陷（severe combined immune deficency,SCID）小鼠皮下接种2×102个细胞6周即可致瘤（1/6）,而接种2×104个CD90- SNU-5细胞10周才能致瘤（1/6）。95例胃癌患者组织中CD90的表达与胃癌的远处转移显著相关（P<0.01）,且CD90阳性胃癌患者的生存期明显短于CD90阴性的患者（P<0.01）。 结论： 人胃癌细胞系SNU-5中存在具有更强自我更新及侵袭能力的CD90+干细胞,人胃癌组织中CD90+干细胞数量与肿瘤的转移与患者生存期明显相关。     

沉默ERK5对胃癌SGC-7901、BGC-823细胞生物学功能的影响

目的 探讨沉默细胞外信号调节激酶5（extracellular signal regulated kinase 5,ERK5）对胃癌细胞SGC-7901、BGC-823生物学功能的影响。方法 实时荧光定量PCR法（qRT-PCR）检测人胃癌细胞株和人胃黏膜上皮细胞株ERK5 mRNA的表达水平。应用短发荚RNA（shRNA）干扰技术沉默胃癌细胞SGC-7901、BGC-823中ERK5的表达。CCK-8法检测ERK5沉默后胃癌细胞的生长能力,平板克隆实验检测细胞克隆形成能力,Transwell 实验检测细胞侵袭和迁移能力,流式细胞仪检测细胞凋亡和周期分布。结果 与胃黏膜上皮细胞GES-1相比,胃癌细胞SGC-7901、BGC-823、AGS、HGC-27中ERK5 mRNA均呈高表达,相对表达量分别为2.696±0.501、1.865±0.185、1.793±0.137和1.530±0.093（P<0.05）。ERK5-shRNA有效沉默胃癌细胞SGC-7901、BGC-823中ERK5的表达水平,沉默效率分别为（74.4±1.5）%和（69.1±3.9）%,差异有统计学意义（P<0.05）。沉默 ERK5的表达能有效抑制胃癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力（P<0.05）,而促进胃癌细胞凋亡（P<0.05）,并诱导细胞周期阻滞于G0/G1期。结论 沉默ERK5可显著抑制胃癌细胞SGC-7901、BGC-823的生长侵袭,促进细胞凋亡,ERK5可能是胃癌治疗的潜在靶点。     

丹参酮ⅡA对人胃癌BGC-823细胞增殖及凋亡的影响

背景与目的:探讨丹参酮ⅡA(tanshinone Ⅱ A,Tan Ⅱ A)对人胃癌BGC-823细胞增殖及凋亡的影响.材料与方法:采用0～10 μg/ml Tan Ⅱ A分别作用于BGC-823细胞48 h及72 h,MTT比色法观察药物对细胞牛长的抑制效应;2、5、10,μg/ml TanⅡA分别作用于细胞72h,应用HE染色、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术分析药物对细胞凋亡的影响.结果:TanⅡA明显抑制BGG-823细胞增殖、诱导细胞凋亡,镜下可见BGC-823细胞明显的凋亡特征性改变;5、10/μg/ml TanⅡA处理组细胞DNA电泳可见典型的"梯状"条带;FCM结果显示5、10 μg/ml TanⅡA处理组细胞,凋亡率分别为(20.60±1.84)%、(31.03±1.47)%,与对照组(5.23±0.39)%比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论:在一定条件下,TanⅡA可抑制人胃癌BGC-823细胞增殖,诱导其凋亡.     

一株抗胰腺癌干细胞单克隆抗体的鉴定及功能研究

目的 对一株抗胰腺癌干细胞单克隆抗体（简称：单抗）进行初步鉴定和体外功能研究,为靶向胰腺癌干细胞治疗胰腺癌提供候选单抗药物.方法 应用无血清悬浮培养及PKH26染色确定胰腺癌细胞系PANC-1中肿瘤干细胞的存在.流式细胞术检测PANC-1细胞中有干细胞标志物CD44＋CD24＋的细胞比例.双色细胞免疫荧光检测CD24和单抗15D2识别的抗原蛋白在PANC-1细胞中的表达情况.无血清悬浮培养法观察单抗15D2对PANC-1成球细胞自我更新的影响.CCK-8法检测单抗15D2对PANC-1细胞增殖和耐药的影响.免疫组织化学检测单抗15D2识别的靶抗原在人胰腺癌、癌旁组织中的表达情况.结果 PANC-1细胞能在无血清培养液中存活、增殖并形成细胞球,成球率为（2.5±0.5）％.PANC-1球体细胞中CD44＋ CD24＋细胞的比例较亲本细胞提高了11.4倍,其中CD44＋ CD24＋细胞占CD24＋细胞的97％,在此体系中用CD24作为PANC-1细胞干细胞标志物.细胞免疫荧光结果显示单抗15D2识别的抗原分子在细胞膜上表达,并能与CD24在PANC-1细胞共定位.抗体体外功能研究发现,单抗15D2能显著抑制PANC-1细胞在无血清培养液中成球,抑制率达到22％.同时,单抗15D2联合吉西他滨能显著抑制PANC-1球体细胞的增殖,联合组和对照组IC50分别为0.10、0.39 μmol/L.免疫组织化学检测结果显示,单抗15D2所识别的抗原蛋白在76.9％（11/13）的人胰腺癌组织中表达阳性,而在癌旁组织中表达阳性率仅为10.0％（1/10）,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 抗胰腺癌干细胞单抗15D2体外能够显著抑制胰腺癌干细胞的自我更新和耐药能力,为胰腺癌干细胞的靶向治疗提供有应用价值的候选抗体药物.     

CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞分选鉴定及其多药耐药性研究

目的:观察MACS免疫磁珠法分选CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞活性,并检测其与多药耐药的关系。方法:运用MACS免疫磁珠法从多药耐药乳腺癌细胞株MCF-7/ADR中分选CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞,流式细胞术测定分选前后CD44+CD24-/low细胞比例,微球体培养法检测分选细胞自我更新能力,流式检测CD44+CD24-/low细胞表面P-糖蛋白(P-gp)表达水平,Real-time PCR检测多药耐药相关基因MDR1表达水平。结果:MACS免疫磁珠法分选后,CD44+CD24-/low细胞比例为93.85%,其成球能力明显强于non-CD44+CD24-/low细胞亚群。MCF-7/ADR细胞株和CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞P-gp表达强度分别为101 177.10±2 171.86和114 906.70±2 560.19,P<0.05。CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞MDR1基因表达水平为MCF-7/ADR细胞株的(1.07±0.02)倍,P<0.05。结论:经MACS免疫磁珠法分选所得CD44+CD24-/low细胞亚群有更强的自我更新能力,高表达P-gp蛋白和MDR1基因可能是引起乳腺癌多药耐药的重要原因。     

大肠癌细胞HCT-15肿瘤干细胞样细胞分离及成瘤性比较

目的:依据人大肠癌细胞HCT-15的表面标志物,分离其中的干细胞亚群。建立裸鼠体内原代大肠癌荷瘤模型,比较各亚群肿瘤体积和质量。方法:利用免疫磁珠分选技术,分离其中CD133/CD44干细胞亚群。分选得到CD133+CD44+、CD133+CD44-亚群分别接种于裸鼠体内,并观察肿瘤大小和质量。结果:CD133+CD44+和CD133+CD44-细胞亚群成功的从HCT-15细胞中分离出来。接种CD133+CD44+细胞的裸鼠形成的肿瘤体积［（2.76±0.22）cm3］和质量［（5.2±0.21）g］明显高于接种CD133+CD44-细胞裸鼠的肿瘤体积与质量［（1.56±0.34）cm3,（3.4±0.18）g］（P＜0.05）。结论:CD44阳性的大肠癌肿瘤干细胞成瘤能力明显高于CD44阴性的大肠癌肿瘤干细胞。     

吉西他滨联合YH-16对肝癌干细胞样细胞的影响

目的：探讨吉西他滨联合重组人血管内皮抑制素YH-16对裸鼠CD133+MHCC97H肝癌移植瘤中肝癌干细胞样细胞的影响。方法：用免疫磁珠分选MHCC97H中肝癌干细胞样细胞,将其接种到20只裸鼠皮下,建立移植瘤模型。治疗组给予吉西他滨和YH-16,对照组给予等量生理盐水,比较两组移植瘤大小变化及原代培养细胞球形成情况,流式细胞术检测原代培养中CD133+细胞百分率。结果：治疗组的移植瘤明显缩小,治疗组和对照组细胞球形成数目分别为(7.5±2.4)个 vs (16.0±3.5)个,细胞球直径分别为(178.30±19.21) μm vs (131.06±20.96) μm（P＜0.05）;治疗组和对照组原代培养中CD133+细胞百分数分别为（6.24±0.96）% vs（18.26±1.76）%（P＜0.05）。结论：低剂量吉西他滨联合YH-16可抑制血管内皮细胞破坏肝癌干细胞样细胞的血管巢,进而选择性清除肝癌干细胞样细胞。     

肝癌高转移细胞株的肿瘤干细胞生物学特性研究

目的:建立高转移肝癌细胞株,研究其肿瘤干细胞生物学特征,为靶向人肝癌干细胞治疗提供有价值的细胞模型。方法:肝癌细胞系Bel7402接种裸鼠皮下,成瘤后,取小鼠肺部转移灶,通过机械分离法,获取肺部肝转移细胞,体外扩大培养后,再次接种裸鼠。如此反复接种裸鼠,获得稳定肺转移肝癌细胞株Bel7402-V13。采用无血清悬浮培养及PKH26染色确定Bel7402-V13中肿瘤干细胞的存在。流式细胞术分析亲本Bel7402和Bel7402-V13中肿瘤干细胞标志物ESA的表达情况,分选Bel7402和Bel7402-V13中ESA+细胞并进行体外生物学特征研究及裸鼠致瘤实验。结果:建立高转移Bel7402-V13细胞株,Bel7402-V13细胞无血清悬浮培养7d后形成的细胞球体中存在单个PKH26阳性细胞。与Bel7402中ESA+细胞相比,流式分析显示干细胞标志物ESA比例高转移Bel7402-V13显著提高5.67倍（17.6±0.4 vs 3.1±1.5）。Bel7402-V13中ESA+细胞具有更强的自我更新能力［成球率:（94.8±7.5）% vs （52.3±6.9）%,P<0.01］,侵袭能力提高1.51倍（397.7±79.4 vs 262.0±40.1,P<0.01）,耐药能力也显著增强（IC50:0.286 vs 0.196,P<0.01）,ESA+细胞Bel7402-V13在裸鼠皮下接种2×102个细胞3月即可致瘤（3/6）,而接种2×102个ESA+细胞Bel7402细胞3月才能致瘤（1/6）。结论:获得高转移肝癌细胞株Bel7402-V13,伴随ESA+细胞增加,其体内外功能显著增强,为肝癌干细胞的靶向治疗提供有价值的细胞模型。