融合蛋白Kininogen D5_（60-148）-TRAIL_（114-281）的表达及其抑制血管新生和诱导细胞凋亡的作用

目的：采用原核表达系统表达人Kininogen D560148TRAIL114281融合蛋白,并对其生物学活性进行研究。方法：PCR技术扩增Kininogen D560148和TRAIL114281的编码序列,分别构建原核表达载体pMALKininogen D560148（pMALKD5）、pMALTRAIL114281（pMALTRAIL）和pMALKininogen D560148 TRAIL114281（pMALKT）,重组质粒分别转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达融合蛋白MBPKD5、MBPTRAIL和MBPKT,并经亲和层析纯化。MTT法检测细胞的增殖,管状形成实验检测内皮细胞血管形成,流式细胞仪和电镜检测细胞凋亡。结果：成功构建原核表达载体pMALKD5、pMALTRAIL和pMALKT,并获得纯化的融合蛋白MBPKD5、MBPTRAIL和MBPKT。融合蛋白MBPKT与MBPKD5、MBPTRAIL相比可显著抑制内皮细胞ECV304和胰腺癌细胞SW1990的增殖、明显抑制ECV304细胞体外管腔的形成,同时,MBPKT剂量依赖性地诱导SW1990细胞凋亡。结论：融合蛋白Kininogen D560148 TRAIL114281既能诱导肿瘤细胞凋亡又能抑制血管生成,为进一步开发靶向性抗肿瘤药物奠定了基础     

融合蛋白Kininogen D560-148 TRAIL114-281的表达及其抑制血管新生和诱导细胞凋亡的作用

目的:采用原核表达系统表达人Kininogen D560-148-TRAIL114-281融合蛋白,并对其生物学活性进行研究.方法:PCR技术扩增Kininogen D560-148和TRAIL114-281的编码序列,分别构建原核表达载体pMAL-Kininogen D560-148(pMAL-KD5)、pMAL-TRAIL114-281(pMAL-TRAIL)和pMAL-Kininogen D560-148-TRAIL114-281(pMAL-KT),重组质粒分别转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达融合蛋白MBP-KD5、MBP-TRAIL和MBP-KT,并经亲和层析纯化.MTT法检测细胞的增殖,管状形成实验检测内皮细胞血管形成,流式细胞仪和电镜检测细胞凋亡.结果:成功构建原核表达载体pMAL-KD5、pMAL-TRAIL和pMAL-KT,并获得纯化的融合蛋白MBP-KD5、MBP-TRAIL和MBP-KT.融合蛋白MBP-KT与MBP-KD5、MBP-TRAIL相比可显著抑制内皮细胞ECV304和胰腺癌细胞SW 1990的增殖、明显抑制ECV304细胞体外管腔的形成,同时,MBP-KT剂量依赖性地诱导SW1990细胞凋亡.结论:融合蛋白Kininogen D560-148-TRAIL114-281既能诱导肿瘤细胞凋亡又能抑制血管生成,为进一步开发靶向性抗肿瘤药物奠定了基础.     

TRAIL联合吉西他滨对肺癌NCI-H460细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察吉西他滨(gemcitabine)联合TNF相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)对人肺癌细胞NCI-H460增殖和凋亡的影响。方法:MTT法检测NCI-H460细胞的增殖,流式细胞术检测NCI-H460细胞的凋亡。结果:吉西他滨和TRAIL单用或联用均可浓度(0.001~10μg/ml)和时间(24、48、72 h)依赖性抑制NCI-H460细胞的增殖,两药联用比单用时抑制率更高,3组药物作用72 h时对肿瘤的抑制率分别为14.9%~77.5%、23.4%~74.8%、22.3%~80.5%;作用72 h时两药单用和联用对细胞增殖抑制的IC50分别为0.085 3、0.098 2、0.043 5μg/ml。两药联用对NCI-H460细胞增殖的抑制效果还与用药顺序以及两药比例有关,吉西他滨作用24 h后再加TRAIL比TRAIL作用24 h后再加吉西他滨对NCI-H460的抑制效果更好,吉西他滨与TRAIL联用的比例为1∶0.3时对NCI-H460细胞增殖的抑制率最大。吉西他滨和TRAIL联用时NCI-H460细胞的凋亡率显著高于两药单用的凋亡率(49.04%vs29.33%、25.69%,P<0.01)。结论:吉西他滨与TRAIL联用可协同抑制肺癌细胞NCI-H460的增殖、促进细胞凋亡。     

石蒜碱诱导肺癌NCI-H460细胞凋亡作用及其机制

目的 通过研究石蒜碱在体外对人肺癌NCI-H460细胞增殖抑制和诱导凋亡的作用，探讨石蒜碱抗肿瘤机制。方法 MTT法检测石蒜碱对NCI-H460细胞增殖的抑制作用，流式细胞术检测NCI-H460细胞的凋亡率，比色法检测凋亡因子相关因子Caspase 3活性。结果 石蒜碱能够有效抑制肺癌NCI-H460细胞增殖，IC₅₀为（5.79±0.11）μmol/L，对NCI-H460细胞的凋亡具有诱导效应，可增强肺癌Caspase 3的活性。结论 石蒜碱在体外能有效地抑制NCI-H460细胞增殖并促进其凋亡，其机制可能与激活Caspase 3的表达从而诱导肿瘤细胞凋亡有关。     

紫杉醇提高胃癌MGC803细胞对TRAIL的敏感性

目的:研究紫杉醇对TRAIL诱导胃癌细胞凋亡的影响,探讨死亡受体5(DR5)在TRAIL诱导细胞凋亡中的作用。方法:采用MTT法测定细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡,western blot检测蛋白表达。结果:在MGC803细胞中,100ng/ml的TRAIL导致轻度的增殖抑制和细胞凋亡,TRAIL(100ng/ml)联合紫杉醇(3.41g/ml)引起明显的增殖抑制和细胞凋亡(P<0.05)。TRAIL单药没有改变死亡受体5(DR5)的表达,而3.41g/ml紫杉醇作用MGC803细胞后明显上调了DR5的表达。结论:紫杉醇通过上调DR5的表达增强TRAIL诱导的胃癌MGC803细胞凋亡。     

人内皮-单核活化多肽-2的重组表达及其活性鉴定

目的: 采用原核表达系统重组表达抗肿瘤细胞因子——人内皮单核活化多肽2（endothelail monocyteactivating polypeptide Ⅱ, EMAPⅡ）,并探讨重组EMAPⅡ的抗肿瘤生物学活性。方法: 采用pMAL p2x表达系统和BL21菌株克隆表达人EMAPⅡ147312, 对表达产物进行纯化。以发光底物法测定重组EMAPⅡ介导人脐静脉内皮细胞ECV304产生组织因子的活性；以流式细胞术测定其增强ECV304细胞对于TNFα致凋亡的敏感性；以MTT法检测定其对胰腺癌SW1990细胞增殖的抑制效果。结果:测序证实EMAPⅡ编码序列被正确克隆进表达载体，经诱导表达、纯化，获得重组EMAPⅡ产物，每克菌体（湿重）可获得约500 μg的重组蛋白，纯度为电泳纯。重组EMAPⅡ在体外培养条件下可使ECV304细胞产生TF因子；并可增强ECV304细胞对于TNFα介导凋亡的敏感性，使凋亡率明显增加\[(16.6±2.5)％vs（25.6±2.3）%,P<0.01\];在一定的质量浓度(1 μg/ml)下，EMAPⅡ对SW1990细胞的增殖有一定抑制作用(P<0.05)。结论:本研究采用原核表达系统pMAL-p2x可表达高纯度的重组EMAPⅡ，该因子具有良好的抗肿瘤生物学活性。     

腺病毒介导的IL-24对人大细胞肺癌NCI-H460细胞的体外抑制效应

目的研究腺病毒介导的IL-24基因表达对NCI-H460肺癌细胞抑癌增效作用及分子机制。方法将Ad-IL-24重组腺病毒感染NCI-H460细胞。以Western blot法鉴定IL-24基因在NCI-H460细胞中的表达;MTT法检测重组腺病毒对NCI-H460细胞的生长抑制作用;经Annexin-V-PE/7-AAD染色后流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率变化;RT-PCR检测NCI-H460细胞中bax、caspase-3、bcl-2、survivin等因子的表达。结果腺病毒介导的IL-24基因在NCI-H460细胞中能够有效表达;Ad-IL-24组对NCI-H460细胞的生长具有明显的抑制作用, Ad-IL-24能够上调bax、caspase-3等因子的表达,下调bcl-2、survivin等因子的表达,诱导细胞凋亡。结论腺病毒介导的IL-24 基因在体外可明显抑制人肺癌细胞NCI-H460的生长,诱导其凋亡,其分子机制可能与上调bax、caspase-3等促凋亡因子的表达,下调bcl-2、survivin等凋亡抑制因子的表达有关。     

奥沙利铂通过上调死亡受体表达增强TRAIL诱导胃癌细胞凋亡的实验研究

目的:研究奥沙利铂对TRAIL诱导胃癌细胞凋亡的影响,探讨死亡受体5(DR5)在TRAIL诱导细胞凋亡中的作用.方法:采用MTT法测定细胞活力、采用流式细胞仪检测细胞凋亡,采用Western blot检测DR5蛋白表达.结果:100ng/ml的TRAIL导致轻度的增殖抑制,诱导不超过5%的细胞凋亡;TRAIL(100ng/ml)联合奥沙利铂(23.44μg/ml)引起明显的细胞增殖抑制和细胞凋亡(P＜0.05),TRAIL没有明显改变死亡受体5(DR5)的表达,而23.44 μg/ml奥沙利铂作用胃癌细胞24小时后,明显上调了DR5的表达.结论:奥沙利铂通过上调DR5的表达增强TRAIL诱导的胃癌细胞凋亡.     

TRAIL基因原核表达载体的构建、表达与抗体制备

目的:获取抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)抗体.方法:利用PCR技术和基因重组技术将TRAIL基因构建于原核表达载体pPreTMH-Tb中,经酶切、测序鉴定证实构建完全正确后,通过IPTG诱导在大肠杆菌DH-5α中获得表达,并将TRAIL蛋白免疫家兔,通过Dot blot及Western blot检测抗TRAIL抗体的产生.结果:成功构建TRAIL基因原核表达载体,并在大肠杆菌DH-5α中获得表达,TRAIL蛋白表达量占菌体蛋白质总量的11.8%,Dot blot及Western blot检测证实获得了抗TRAIL抗体.结论:成功制备抗TRAIL抗体,这为TRAIL在真核细胞水平研究奠定了实验基础.     

紫杉醇提高胃癌MGC803细胞对TRAIL的敏感性

目的：研究紫杉醇对TRAIL诱导胃癌细胞凋亡的影响,探讨死亡受体5（DR5）在TRAIL诱导细胞凋亡中的作用。方法：采用MTT法测定细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡,western blot检测蛋白表达。结果：在MGC803细胞中,100ng/ml的TRAIL导致轻度的增殖抑制和细胞凋亡,TRAIL（100ng/ml）联合紫杉醇（3.41g/ml）引起明显的增殖抑制和细胞凋亡（P〈0.05）。TRAIL单药没有改变死亡受体5（DR5）的表达,而3.41g/ml紫杉醇作用MGC803细胞后明显上调了DR5的表达。结论：紫杉醇通过上调DR5的表达增强TRAIL诱导的胃癌MGC803细胞凋亡。     

白细胞介素-18基因转染的肺癌细胞与树突状细胞融合体的抗肿瘤作用

目的研究白细胞介素-18(IL-18)基因转染的肺癌细胞与树突状细胞(DC)融合体的抗肿瘤作用。方法(1)从人外周血单核细胞诱导培养DC,与IL-18基因转染的NCI-H460肺癌细胞融合,经免疫磁珠筛选。(2)设转染组(GT组)、空载体转染组(PT组)、未转染组(NT组)和对照组(BC组),分别以IL-18转染的融合细胞、pcDNA3.1~ 转染的融合细胞、未转染的融合细胞活化的T细胞为效应细胞,BC组不含效应细胞,用乳酸脱氢酶(LDH)法测定效应细胞对NCI-H460细胞的杀伤作用。(3)荷瘤裸鼠皮下注射上述3种效应细胞,以BC组为空白对照,比较4组裸鼠肿瘤体积和重量。结果3组效应细胞在体外对NCI-H460细胞的杀伤率分别为53.1%,30.1%和31.5%;3组裸鼠肿瘤体积及肿瘤重量明显低于BC组,以GT组最低。结论IL-18基因转染的融合细胞可有效诱导抗肿瘤免疫。     

肿瘤细胞膜模型筛选抗肿瘤多肽新方法的建立

背景与目的：部分多肽类药物具有靶向选择性抗肿增作用,目前针对多肽抗肿瘤的研究都是基于某一或数个肽链的信息,受到现有多肽信息的限制。本研究旨在通过肿瘤细胞膜模型的建立,应用核糖体表达法进行抗肿瘤多肽筛选。方法：选择已知可在肿瘤细胞膜上穿孔的阳性对照多肽Mast21和MastoparanX优化人工合成的肿瘤脂质体细胞膜模型。组建可直接用于体外多肽表达的DNA库,应用核糖体表达法进行特异性抗肿瘤多肽筛选,应用MTT法检测筛选的多肽在体外抗肿瘤效果。结果：应用核糖体体外表达法和脂质体(PE／PS,3：7)肿瘤细胞膜模型成功地从设计的肽库中筛选出一些肽,体外实验证实部分多肽能抑制非小细胞肺癌细胞株(NC1-H460)生长,而对正常人体纤维细胞CCD-27SK无影响。结论：合适的肿瘤细胞膜模型和核糖体表达法,可从肽库中筛选特异性抗肿瘤多肽,为开发作用机制完全不同的抗肿瘤新药奠定基础。     

EGFR inhibitors sensitize non-small cell lung cancer cells to TRAIL-induced apoptosis

Apoptosis induced by tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) can be regulated by the epidermal growth factor (EGF) signaling pathway. In this study, recombinant adenoviral vectors that encode TRAIL gene from the hTERT/RGD promoter (AdTRAIL) was combined with drugs including gefitinib, elotinib, and cetuximab that inhibit EGFR and the EGF signaling pathway in non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines to investigate their antitumor activity. In vitro, compared to single reagent, AdTRAIL combined with EGFR inhibitors reduced proliferation and enhanced apoptosis in H460, A549, and SW1573 cell lines. Western blot results suggested that these effects were relative to up-regulation of pro-apoptosis protein BAX and down-regulation of p-AKT. In vivo, AdTRAIL combined with cetuximab resulted in a significant growth reduction in H460 xenografts without damage to the main organs of nude mice. Histological examination and TUNEL analyses of xenografts showed that cetuximab enhanced cell apoptosis induced by AdTRAIL. These results indicate that EGFR inhibitors enhanced AdTRAIL anti-tumor activity in NSCLC cell lines and that inhibiting the AKT pathway played an important role in this enhancement.     

Functional identification of a non-fusion TRAIL extracellular protein and preparation of its polyclonal antibody

Human tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand (TRAIL) can selectively induce apoptosis in a variety of transformed cells and is currently being developed as a cancer therapeutic drug. Here we expressed the TRAIL protein including extracellular (114-281aa) without any tag protein named TRAIL-NT, and prepared anti-TRAIL polyclonal antibodies (Poly-Ab). The human TRAIL extracellular gene was amplified from PBMC and cloned into pGEM-T-Easy vector for sequence analysis. The expression vector pET-28a/TRAIL was constructed using the DNA recombinant method, and the recombinant protein without any tag protein was expressed in Escherichia coli BL21(DE3). The TRAIL-NT protein was purified by cation ion-exchange column and identified by SDS-PAGE and Western blot analysis. The proliferation inhibition activity of TRAIL-NT was detected by the MTT method, Wright-Giemsa staining assay, and FACS. The polyclonal antibody of TRAIL-NT was obtained after the BALB/C mice were immunized with purificated TRAIL-NT protein. Results showed that the target protein expressed in E. coli BL21(DE3) has the same molecular weight as that expected and could be recognized by anti-TRIAL Poly-Ab. The TRAIL-NT protein could also inhibit proliferation and induced apoptosis of Jurkat cells but no cytotoxicity to human liver cells and PBMC was observed. This preliminary research laid a solid foundation for further research on its biological activity and application in anti-tumor therapy.     

重组腺病毒TRAIL基因联合抗EGFR靶向药物对肺癌细胞增殖的影响

目的:观察重组腺病毒TRAIL基因制剂联合抗EGFR靶向药物对H460肺癌细胞株及裸鼠移植瘤增殖的影响。方法:重组腺病毒TRAIL基因治疗制剂分别与EGFR信号通路靶向治疗药物Iressa、Tarceva、以及C225联合应用于H460肺腺癌细胞株,采用MTT法以及流式细胞仪检测不同用药方案的抗肿瘤作用;在裸鼠H460肺癌模型中验证重组腺病毒TRAIL制剂与C225的协同抗肿瘤作用。结果:在体外实验中发现Iressa和Tarceva可以增加重组腺病毒TRAIL基因制剂对H460肺癌细胞的抗肿瘤作用(P<0.05);重组腺病毒TRAIL基因制剂在体外实验中与C225并不存在协同效应(P>0.05),但在裸鼠H460肺癌模型中重组腺病毒TRAIL基因制剂与C225有明显的协同抗肿瘤作用(P<0.05)。结论:本研究初步探讨了基因治疗与靶向治疗的联合抗肿瘤作用,实验发现EGFR信号通路上的靶向治疗药物包括小分子酪氨酸激酶抑制剂以及EGFR单克隆抗体均可以增加重组腺病毒TRAIL基因制剂抗肺癌作用。     

lncRNA MALAT1在结直肠癌中的表达、生物学功能及其与患者预后的关系

目的:探讨lncRNA MALAT1在结直肠癌（colorectal cancer,CRC）中的表达、生物学功能及其与患者预后的关系。方法:采用生物信息方法在TCGA数据库和Oncomine数据库中分析比较MALAT1在CRC患者癌组织和癌旁组织中的差异表达情况,并比较高低表达组患者总生存期（OS）和无病生存期（DFS）是否存在差异。采用cBioPortal在线分析TCGA数据库中MALAT1突变种类及频率。采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)技术检测我院收治并手术治疗的30例CRC患者手术切除标本的癌组织、癌旁组织、肠癌细胞系(SW620、LOVO、HCT116)及正常人肠上皮细胞(NCM460)中MALAT1的相对表达水平。小干扰RNA敲低SW620细胞中MALAT1表达后观察MALAT1细胞迁移和侵袭能力改变情况。siRNA下调SW620细胞MALAT1,利用免疫印迹实验检测上皮间质化标志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达水平。结果:Oncomine数据库中,CRC患者癌组织中高表达MALAT1的研究有6项;30对人配对CRC组织标本中,相比癌旁组织,MALAT1 在46.7%（14/30）的CRC患者组织中表达增高（P＜0.05）;Real-time PCR结果显示,肠癌细胞系(SW620、LOVO、HCT116)中MALAT1的相对表达量显著高于正常人肠上皮细胞(NCM460),差异有统计学意义（P＜0.05）。MALAT1基因突变类型主要为融合突变、扩增突变及深度缺失突变,其在各种肿瘤中的总体突变率为1.1%,在CRC组织中的突变率为0.34%。小干扰RNA抑制MALAT1表达可明显抑制SW620细胞的划痕迁移与小室侵袭能力。抑制MALAT1表达后,SW620细胞中E-cadherin的表达水平升高,同时N-cadherin和Vimentin的表达水平明显降低,表明上皮间质化过程受到明显抑制。MALAT1表达水平与结肠癌患者DFS存在明显的关系,高表达患者DFS显著低于低表达患者（HR=1.6,P=0.044）。结论:lncRNA MALAT1在肠癌中表达上调,并通过抑制上皮间质化抑制细胞迁移和侵袭能力。MALAT1高表达结肠癌患者预后不良,可能成为结肠癌预后分子标志物。     

lncRNA NEAT1调控miR-4262表达影响甲状腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制研究

目的:研究长链非编码RNA NEAT1（lncRNA NEAT1）对甲状腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其作用机制。方法:qPCR检测NEAT1和miR-4262在人正常甲状腺滤泡上皮细胞株Nthy-ori 3-1与甲状腺癌细胞株FTC-133、ML-1、SW579中的表达。用si-NEAT1或miR-4262 mimic转染SW579细胞,考察其在细胞增殖、迁移和侵袭中的作用。生物学信息预测结合双荧光素酶报告实验分析NEAT1和miR-4262之间的靶向关系。MTT法检测细胞增殖抑制率;Western blot检测细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、p21、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达;Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭。共转染si-NEAT1和anti-miR-4262,观察抑制miR-4262表达对抑制NEAT1表达诱导的SW579细胞增殖、迁移及侵袭的影响。结果:NEAT1在甲状腺癌细胞中的表达显著上调（P＜0.05）,miR-4262表达下调（P＜0.05）。抑制NEAT1表达或过表达miR-4262显著增加SW579细胞增殖抑制率和p21蛋白表达量（P＜0.05）,显著降低迁移细胞数、侵袭细胞数及CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达量（P＜0.05）。miR-4262是NEAT1的靶基因。上调或下调NEAT1表达明显调控miR-4262表达（P＜0.05）。抑制miR-4262表达能逆转抑制NEAT1表达对SW579细胞增殖抑制率和p21蛋白表达的促进作用,以及对细胞迁移、侵袭及CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达的抑制作用。结论:lncRNA NEAT1通过靶向miR-4262影响甲状腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。     

Aurora-A激酶在人类不同肺癌细胞株中的表达

背景与目的近年来的研究发现Aurora-A在多种恶性肿瘤中高表达。本研究检测Aurora-A激酶在人类不同肺癌细胞株中的表达及其与DNA含量的关系,旨在寻找肺癌新的分子治疗靶点和肿瘤标记物,为指导肺癌个性化治疗提供一种新的方法。方法应用RT-PCR与Westernblot方法检测PG(高转移的巨细胞肺癌)、A549(肺腺癌)、NCI-H460(大细胞肺癌)3种肺癌细胞株Aurora-A的表达;流式细胞仪检测3种肺癌细胞DNA含量(四倍体及多倍体),分析Aurora-A的表达与DNA含量的相关性。结果半定量RT-PCR电泳结果显示,A549、PG、NCI-H460中Aurora-A/β-actin比值分别为1.16、1.14、0.84;Westernblot结果在A549、PG与NCI-H460中的Aurora-A/β-actin比值分别为21.13、8.96与6.43,提示3种肺癌细胞Aurora-A均呈高表达。A549、PG、NCI-H460细胞含有四倍体的细胞比例分别为14.97%、19.88%和10.60%,三者有显著性差异(P<0.01);其多倍体(>4N)的细胞比例分别为3.59%、2.66%、2.30%。提示Aurora-A表达强弱与肺癌细胞多倍体的比例高低有相关性。结论3种肺癌细胞中Aurora-A基因均高表达,其表达水平在不同肺癌细胞株中存在差异。     

ANTP-SMACN7 fusion peptide alone induced high linear energy transfer irradiation radiosensitization in non-small cell lung cancer cell lines

Objective: The aim of the present study was to investigate the mechanisms responsible for the radiation-sensitizing effect of antennapedia proteins, ANTP-SMACN7, on lung cancer cells treated with accelerated carbon and Fe particle irradiation.Methods: The ANTP-SMACN7 fusion peptide was synthesized and linked to fluorescein isothiocyanate to determine its ability to penetrate cells. A549 and NCI-H460 cells, human non-small cell lung cancer(NSCLC) cell lines, were irradiated with X-ray or high lin...