JAK2/STAT3信号通路对A549细胞株中HIF-1ɑ、VEGF蛋白表达的影响

目的：研究人肺腺癌细胞A549细胞中JAK2/STAT3信号通路对HIF-1ɑ、VEGF蛋白表达的影响。方法：AG490处理在氧含量正常及缺氧条件下（CoCl2200μmol/L）48h后Westernblot法测定A549细胞中HIF-1ɑ、VEGF蛋白表达变化（分组为对照组、AG49050μmol/L、AG490100μmol/L、CoCl2、CoCl2＋AG49050μmol/L和CoCl2＋AG490100μmol/L组）。IL-6（3.85nmol/L）处理A549细胞24h后,检测细胞中STAT3、p-STAT3、HIF-1ɑ、VEGF蛋白表达变化（分组为对照组,IL-6组）。结果：JAK2特异性抑制剂AG490作用48h后,相对于对照组AG490能够下调HIF-1ɑ、VEGF的蛋白表达,且呈浓度依赖性;随浓度的升高,抑制作用更明显。缺氧条件下（CoCl2200μmol/L）能够上调HIF-1ɑ、VEGF的蛋白表达。AG490也能够下调CoCl2诱导的HIF-1ɑ、VEGF的蛋白表达,且呈浓度依赖性,随浓度的升高,抑制作用更显著。IL-6能够上调HIF-1ɑ、VEGF的蛋白表达。结论：在人肺腺癌细胞A549细胞中,缺氧可上调HIF-1α和VEGF蛋白表达。JAK2/STAT3信号通路对HIF-1α和VEGF蛋白的表达具有调节作用。     

紫铆花素抑制脂多糖诱导的骨髓源性巨噬细胞炎症反应的研究

目的：研究紫铆花素（butein）对脂多糖（LPS）诱导小鼠骨髓源性巨噬细胞炎症反应的抑制效应，并探讨JAK2-STAT3通路在其中的作用。方法：分离C57BL/6小鼠骨髓，用40 ng/mL的巨噬细胞集落刺激因子刺激7 d，诱导为骨髓源性巨噬细胞（BMDM）。采用500 ng/mL的LPS刺激BMDM 12 h建立炎症模型，butein干预组采用5、10、20 μmol/L butein与LPS共处理，butein单独处理组为20 μmol/L的butein处理12 h，并设立空白对照组。ELISA法检测BMDM培养液中TNF-α、IL-6和NO的水平；流式细胞术检测细胞内ROS水平；Western blot法检测细胞内iNOS、p-JAK2、JAK2、p-STAT3和STAT3蛋白表达水平，并分析P-JAK2/JAK2和P-STAT3/STAT3蛋白表达水平的比值变化。结果：ELISA实验结果显示，LPS刺激BMDM后，培养液中的TNF-α、IL-6和NO含量显著升高，而5、10、20 μmol/L的butein干预可抑制上述促炎因子的分泌，且呈现剂量-效应关系。流式细胞术检测结果显示，butein抑制了LPS活化BMDM的ROS水平升高。Western blot检测结果表明，LPS刺激后BMDM内iNOS蛋白表达水平升高，JAK2和STAT3蛋白表达水平虽未明显变化，但磷酸化水平显著增加。而butein干预可有效抑制JAK2和STAT3蛋白磷酸化。结论：Butein可抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应，JAK2-STAT3信号通路可能参与调控这一效应，提示butein是一种炎症相关疾病的候选药物。     

JAK2/STAT3信号通路对A549细胞株中HIF-1α、VEGF蛋白表达的影响

目的:研究人肺腺癌细胞A549细胞中JAK2/STAT3信号通路对HIF-1α、VEGF蛋白表达的影响.方法:AG490处理在氧含量正常及缺氧条件下(CoCl2 200μmol/L)48h后Western blot法测定A549细胞中HIF-1α、VEGF蛋白表达变化(分组为对照组、AG490 50μmol/L、AG490 100μmol/L、CoCl2、CoCl2+AG49050μmol/L和CoCl2+AG490 100μmol/L组).IL-6 (3.85nmol/L)处理A549细胞24h后,检测细胞中STAT3、p-STAT3、HIF-1α、VEGF蛋白表达变化(分组为对照组,IL-6组).结果:JAK2特异性抑制剂AG490作用48h后,相对于对照组AG490能够下调HIF-1α、VEGF的蛋白表达,且呈浓度依赖性;随浓度的升高,抑制作用更明显.缺氧条件下(CoCl2200μmol/L)能够上调HIF-1α、VEGF的蛋白表达.AG490也能够下调CoCl2诱导的HIF-1α、VEGF的蛋白表达,且呈浓度依赖性,随浓度的升高,抑制作用更显著.IL-6能够上调HIF-1α、VEGF的蛋白表达.结论:在人肺腺癌细胞A549细胞中,缺氧可上调HIF-1α和VEGF蛋白表达.JAK2/STAT3信号通路对HIF-1α和VEGF蛋白的表达具有调节作用.     

溶瘤新城疫病毒抑制IL-6诱导的人胶质母细胞瘤U87MG细胞的迁移和侵袭

目的：探讨溶瘤新城疫病毒（NDV）对IL-6诱导的人胶质母细胞瘤U87MG细胞增殖、迁移和侵袭的作用及其可能的机制。方法：将U87MG细胞分为对照组、IL-6组、NDV组、NDV+IL-6组,其中IL-6组与NDV+IL-6组用75 ng/mL IL-6预处理1 h,其余组用DMEM预处理1 h,后分别用DMEM、75 ng/mL IL-6、1 HU NDV、1 HU NDV+75 ng/mL IL-6处理24 h。MTT法、细胞划痕实验和Transwell侵袭实验分别检测IL-6、NDV对U87MG细胞增殖、迁移和侵袭的影响,WB法检测各组细胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3和MMP2蛋白的表达水平。结果：与对照组相比,IL-6组细胞迁移率显著升高（P<0.05）,侵袭细胞数目显著增多（P<0.01）;与IL-6组相比,NDV+IL-6组U87MG细胞增殖率显著降低（P<0.05）,细胞迁移率和侵袭细胞数目均显著降低（均P<0.01）。WB实验结果显示,与对照组相比,IL-6组p-STAT3/STAT3比值显著升高（P<0.01）,ND...     

康莱特注射液调控胆固醇代谢以抑制肺腺癌A549细胞的恶性生物学行为

目的：明确康莱特注射液（KLTi）通过调控胆固醇代谢对肺腺癌A549 细胞恶性生物学行为的抑制作用。方法：构建A549 细胞体外培养模型，设置空白对照组（CON组）、KLTi组、顺铂（DDP）组及KLTi+DDP 组，分别给予对应药物干预，采用CCK-8法检测不同分组的药物干预对A549 细胞增殖的影响，并确定IC50 值用于后续实验；使用细胞划痕实验、平板克隆形成实验、 Transwell 侵袭实验观察不同分组药物对A549 细胞恶性生物学行为的影响；流式细胞术检测不同分组药物对A549 细胞晚期凋亡水平的影响；WB法检测各组细胞上皮间质转化（EMT）相关蛋白表达，ELISA 法检测促炎因子释放水平。采用比色法检测细胞胆固醇含量水平的组间差异，借助WB法检测胆固醇代谢相关膜通道蛋白ATP结合盒转运蛋白A1（ABCA1）及功能蛋白ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）、肽基脯氨酰异构酶B（PPIB）表达水平差异。结果：KLTi 及DDP对A549 细胞抑制作用具有时间及剂量依赖性（均P<0.05），最终选择2 mg/mL KLTi、3 μg/mL DDP作为干预剂量，按分组加药干预48 h后显示，KLTi 单用或联合DDP均可抑制A549 细胞克隆形成、迁移、侵袭能力且促进其晚期凋亡，KLTi+DDP 组的效果更加明显（P<0.05 或P<0.01）； KLTi 单用或联合DDP 可通过调控E-cadherin、vimentin、snail 蛋白表达从而影响A549 细胞EMT 进程（P<0.05 或P<0.01），同时下调IL-6 及IL-8的释放水平（P<0.05 或P<0.01）。KLTi 单用及联合DDP 均可以明显降低A549 细胞胆固醇含量（P<0.05 或P<0.01），并且对ABCA1、ACLY、PPIB 表达具有调控作用，联合组的效果更加明显（P<0.05 或P<0.01）。结论：KLTi 可能通过调控胆固醇代谢水平及相关通道蛋白抑制肺腺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为及EMT进程。     

GBX2过表达促进人宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移及侵袭

[摘要] 目的：探讨GBX2 基因在人宫颈癌SiHa 细胞增殖和侵袭转移中的作用及其机制。方法：应用质粒转染技术,分别将过表达GBX2 基因重组质粒pCMV6-entry-GBX2（实验组）及空载体质粒pCMV6-entry（阴性对照组）转染到宫颈癌SiHa 细胞中,用WST-1 法、集落形成实验、流式细胞术分别检测转染细胞的增殖、集落形成和细胞周期,用划痕愈合实验、Transwell 实验检测细胞的迁移、侵袭能力,用ELISA 法检测细胞培养上清中IL-6 的表达水平,用WB检测EMT相关蛋白的表达变化并探讨其可能的作用机制。结果：与SiHa/pCMV6 组相比,上调GBX2 表达后：（1）SiHa/GBX2 组细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力明显增强（均P<0.01）,G0/G1 期的细胞比例减少、S期与G2/M期的细胞比例增加（均P<0.01）;（2）SiHa/GBX2 组细胞EMT相关蛋白上皮钙黏蛋白表达水平下降,神经钙黏蛋白、波形蛋白和snail 表达水平上调（均P<0.01）;（3）SiHa/GBX2 组细胞培养上清中IL-6 的表达水平明显增高（P<0.01）;（4）SiHa/GBX2 组细胞STAT3 磷酸化水平增强,并能被STAT3 抑制剂S31-201 抑制（P<0.01）。结论：GBX2可能通过IL-6/STAT3 通路诱导宫颈癌SiHa 细胞EMT,从而促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。     

神经胶质瘤细胞与人脑微血管内皮细胞之间STAT3信号的交互作用

目的： 探讨神经胶质瘤细胞（A172/U251）与人血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cell, HBMEC)之间STAT3信号通路的交互作用。方法：建立A172、U251细胞与HBMEC的Transwell共培养体系,ELISA检测A172、U251细胞及其分泌因子VEGF对HBMEC分泌IL-6的影响,Western blotting检测HBMEC与A172/U251细胞共培养30 min时HBMEC及其分泌因子IL-6对A172/U251细胞STAT3蛋白及其磷酸化状态p-STAT3的影响,CCK-8、Transwell侵袭实验分别检测HBMEC及其分泌因子IL-6对A172/U251细胞增殖和侵袭的影响。结果：VEGF(50 ng/ml) 组和共培养组（HBMEC分别和A172,U251细胞共培养） HBMEC的IL-6的表达量明显高于对照组(P<0.01)。共培养30 min时,A172/U251细胞的IL-6(50 ng/ml)组、共培养组及（共培养+AZD1480）组的STAT3/p-STAT3蛋白的表达明显高于对照组(P<0.01),（共培养+AZD1480）组的胶质瘤细胞STAT3/p-STAT3蛋白的表达能力显著低于共培养组(P<0.01)。IL-6(50 ng/ml)组,共培养组及（共培养+AZD1480）组的A172/U251细胞增殖及侵袭能力明显高于对照组(P<0.01),（共培养+AZD1480）组的细胞增殖及侵袭能力显著低于共培养组(P<0.01)。结论：神经胶质瘤细胞与人脑微血管内皮细胞之间存在信号交互作用,且与JAK2/STAT3信号通路密切相关。     

IL-17通过JAK2/STAT3信号通路诱导PD-L1在肝内胆管癌细胞中的表达

目的:探讨白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)对人肝内胆管癌细胞程序性细胞死亡蛋白配体1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)表达水平的影响及其潜在机制。方法:使用不同浓度(0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL)的IL-17作用于人肝内胆管癌细胞系RBE和HCCC9810,Western blot检测PD-L1的表达情况,并筛选出IL-17的最佳作用浓度。使用最佳作用浓度处理RBE和HCCC9810细胞,收集mRNA、蛋白质。实时定量逆转录-聚合酶链反应（qRT-PCR）检测PD-L1在mRNA水平的表达情况。Western blot检测JAK2/STAT3信号通路的活化情况,并使用AG490阻断信号通路,Western blot检测通路被阻断后,IL-17对RBE及HCCC9810细胞PD-L1表达水平的影响。结果:IL-17诱导了PD-L1在RBE和HCCC9810细胞中的表达,并且PD-L1的上调幅度与IL-17的浓度相关,当浓度为50 ng/mL和100 ng/mL时,对PD-L1的诱导作用最为显著。与对照组相比,50 ng/mL的IL-17可显著刺激PD-L1在mRNA水平的表达(P＜0.01)。同对照组相比,50 ng/mL的IL-17促进了STAT3和JAK2蛋白的磷酸化水平(P＜0.01),但并不影响STAT3和JAK2总蛋白的表达水平(P＞0.05)。在使用AG490阻断JAK2/STAT3信号通路后,IL-17诱导PD-L1蛋白表达的能力明显减弱(P＜0.05)。结论:IL-17可诱导PD-L1在人肝内胆管癌细胞系RBE和HCCC9810中的表达,其机制可能与促进JAK2/STAT3信号通路蛋白的磷酸化水平有关。     

淫羊藿苷通过IL-6/STAT3通路逆转肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药的作用机制研究

目的 探讨淫羊藿苷(ICA)对A549/DDP细胞顺铂耐药的逆转作用及对白细胞介素-6(IL-6)和信号传导子及转录激活子3(STAT3)信号通路的调节。方法 第4代对数生长期的A549/DDP细胞随机分为A549/DDP组和ICA组，MTT法检测不同浓度ICA对细胞增殖率的影响。采用不同浓度DDP及50、100μmol/L ICA处理A549/DDP细胞，MTT法检测ICA对A549/DDP细胞化疗敏感性的影响。采用4μg/mL DDP和50、100μmol/L ICA处理A549/DDP细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡率，Transwell试验检测细胞侵袭能力，qRT-PCR检测细胞中肺耐药蛋白(LRP)和多药耐药蛋白(MRP) mRNA相对表达量，蛋白印迹法检测IL-6、STAT3、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白相对表达量。结果 细胞增殖率随ICA浓度的增加而降低(P<0.05)。与单独使用不同浓度DDP处理A549/DDP细胞比较，50和100μmol/L ICA处理提高细胞对DDP的敏感性，降低DDP对细胞的半数抑制浓度(IC50)(P&...     

STAT3通过上调Twist基因表达从而诱导肺腺癌细胞上皮-间质转化

目的探讨信号转导子与转录激活子3（STAT3）基因在肺腺癌细胞上皮-间质转化（Epi．thelial-mesenchymal transition,EMT）过程中的作用。方法应用STAT3-siRNA转染人肺腺癌A549细胞,下调STAT3基因表达。转染后观察细胞形态学变化,通过Westernblot检测STAT3和Twist蛋白的表达变化。同时应用Transwell法和划痕实验检测细胞的侵袭和迁移能力。并应用免疫组化法验证STAT3和Twist蛋白在肺腺癌组织中表达的相关性。结果STAT3-siRNA转染人肺腺癌A549细胞后,STAT3基因表达下降,同时降低Twist的表达,并且降低肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力,在肺腺癌组织中我们也观察到随着分化程度升高,两个蛋白在肺癌组织中的的表达均逐渐降低,并呈正相关。结论STAT3基因通过调节Twist的表达,参与EMT过程,从而在肺癌进展中发挥重要作用。     

阿托伐他汀调控上皮间质转化抑制结肠癌细胞生长的机制研究

目的:探讨阿托伐他汀调控上皮间质转化（EMT）对人结肠癌SW480细胞侵袭和迁移的影响。方法:0.1、1、10、100 μmol/L的阿托伐他汀处理SW480细胞24 h、48 h和72 h,MTT检测细胞活力。100 μmol/L的阿托伐他汀处理细胞48 h,Transwell小室检测细胞侵袭能力及迁移能力,Western blotting检测EMT相关蛋白E-cadherin、β-catenin和Twist及PI3K/AKT信号通路PI3K、AKT和p-AKT蛋白表达。结果:随着阿托伐他汀浓度升高,作用时间延长,对SW480细胞活力抑制越明显,各浓度阿托伐他汀组与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05）,同一实验组不同时间点间比较差异具有统计学意义（P<0.05）。与对照组比较,阿托伐他汀组细胞侵袭及迁移能力均明显降低,E-cadherin蛋白表达明显升高,β-catenin、Twist、PI3K和p-AKT蛋白表达明显降低（P<0.05）。结论:阿托伐他汀可抑制结肠癌细胞的侵袭和迁移能力,机制可能与抑制EMT及PI3K/AKT信号通路有关。     

PEDF下调 HIF-1α表达抑制缺氧状态下NSCLC细胞增殖、迁移的作用机制

目的:研究色素上皮衍生因子（PEDF）对缺氧状态下非小细胞肺癌（NSCLC）细胞增殖、迁移和缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达的影响。方法:体外培养NSCLC细胞A549,氯化钴（CoCl2）100 μmol/L 模拟缺氧环境。实验分为4组:正常对照组（A组）、氯化钴干预组（B组）、氯化钴＋PEDF 50 ng/ml干预组（C 组）及氯化钴＋PEDF 200 ng/ml干预组（D组）。MTT检测各组细胞增殖能力,进行划痕实验,在光镜下观察实验组和对照组细胞的移行情况;进行Transwell小室侵袭实验,计算细胞穿透数;进行ELISA法检测各组细胞培养液上清中HIF-1α、血管内皮生长因子（VEGF）蛋白表达水平。结果:细胞增殖能力:B组较A组增加,C组较B组降低,D组较C组降低,各组间差异均具有统计学意义（P<0.05）;细胞迁移能力:B组较A组增加,C组较B组降低,D组较C组降低,各组间差异均具有统计学意义（P<0.05）;细胞穿透数:B组较A组增多,C组较B组减少,D组较C组减少,各组间差异均具有统计学意义（P<0.05）;HIF-1α和VEGF的表达水平:B组较A组升高,C组较B组下降,D组较C组下降,各组间差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论:肺癌A549细胞在缺氧环境较常氧具有更强的增殖力和移行能力;可以分泌HIF-1α,HIF-1α对VEGF的表达有一定的促进作用。PEDF对缺氧状态下A549细胞高表达的VEGF具有一定抑制作用,且该抑制作用可能与PEDF调控HIF-1α有关。     

MicroRNA-29a靶向抑制PTEN基因诱导非小细胞肺癌细胞上皮间质转化的机制研究

目的:探讨microRNA-29a（miR-29a）及其靶蛋白PTEN在TGF-β1诱导非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）中的作用机制。方法:选择A549细胞经终浓度为10 ng/ml TGF-β1诱导48 h后,分为Blank组（不转染任何序列）、阴性对照（negative control,NC）组（转染阴性对照序列）、IN组（转染miR-29a inhibitors）、siRNA组（转染PTEN-siRNA）和IN+siRNA组（共转染miR-29a inhibitors和PTEN-siRNA）。普通显微镜观察各组细胞形态学变化;免疫荧光检测各组细胞中E-cadherin表达水平;qRT-PCR法检测EMT相关因子及PTEN mRNA表达水平;Western blotting法检测转染后EMT相关因子、PTEN、Akt和p-Akt蛋白的表达;划痕实验检测各组细胞迁移能力。构建裸鼠移植瘤模型,观察肿瘤生长,免疫组化检测裸鼠肿瘤组织中PTEN及EMT相关因子蛋白表达水平。结果:A549细胞转染miR-29a inhibitors后TGF-β1诱导细胞的上皮间质转化显著受到抑制,N-cadherin、Vimentin及Slug的mRNA和蛋白表达水平在IN组中显著低于Blank组和NC组,但在siRNA组和IN+siRNA组中显著上调（均P<0.05）。与Blank组和NC组相比,IN组PTEN mRNA和蛋白表达水平明显升高,且p-Akt的表达显著降低,细胞迁移率显著下降,而siRNA组和IN+siRNA组PTEN mRNA和蛋白表达明显降低,p-Akt的表达显著上升,细胞迁移率显著升高（均P<0.05）。裸鼠移植瘤实验结果显示与Blank组和NC组相比,IN组肿瘤生长较慢,重量降低,E-cadherin和PTEN蛋白表达显著升高,N-cadherin、β-catenin、Vimentin、Slug蛋白表达显著降低（均P<0.05）。结论:TGF-β1能诱导NSCLC细胞发生EMT,且能上调miR-29a并抑制PTEN的表达水平;抑制miR-29a的表达水平可能通过上调靶基因PTEN,促进Akt磷酸化,抑制EMT的发生。     

Mesenchymal stem cells enhance lung cancer initiation through activation of IL-6/JAK2/STAT3 pathway

Background

The role of mesenchymal stem cells (MSCs) and IL-6 in lung cancer has not been well-addressed. We aimed to determine if MSCs can enhance the ability of tumor initiation of lung cancer cells, and link MSCs with activation of the IL-6/JAK2/STAT3 signaling pathway.

Materials and methods

Lung cancer cell lines A549 and CL1-5 were directly or indirectly cocultured with MSCs. Spheres were defined as cell colonies with >50% area showing 3-dimensional structure and blurred cell margins. Cells without and with MSCs were injected into NOD/SCID mice. The percentage of tumor formation was determined. The influence of the IL-6/JAK2/STAT3 signaling pathway in cancer cell sphere formation and tumor growth were investigated.

Results

A very small number of lung cancer cells, when mixed with otherwise non-tumorigenic MSCs, obtained de novo tumorigenicity when injected subcutaneously and allowed to form a tumor xenograft. Secretion of IL-6 from MSCs increased activation of the JAK2/STAT3 pathway in cancer cells, and enhanced sphere formation and tumor initiation. A reduced capacity of tumor formation of A549 and CL1-5 lung cancer cells when IL-6 was inhibited in MSCs or STAT3 was silenced in A549 and CL1-5 admixed with MSCs.

Conclusions

Culture of A549 or CL1-5 lung cancer cells with MSCs increased sphere formation, drug resistance, and overexpression of pluripotency markers through activation of the IL-6/JAK2/STAT3 pathway. MSCs enhanced the capability of A549 and CL1-5 lung cancer cells to form tumors in immunodeficient mice. Blockade of the IL-6/JAK2/STAT3 pathway attenuated the capability of A549 and CL1-5 cells to form tumors.