shRNA介导的Y-盒结合蛋白-1表达沉默抑制神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的体内成瘤能力

目的:观察shRNA介导的Y-盒结合蛋白-1(YB-1)表达沉默对神经母细胞瘤细胞体内成瘤能力的影响.方法:构建针对YB-1的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,利用LipofectamineTM2000脂质体转染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞.Western blot技术检测干扰后YB-1蛋白表达水平变化.平板克隆形成实验检测YB-1蛋白受抑是否影响细胞凋亡.通过测量肿瘤体积和重量评估YB-1蛋白受抑对裸鼠体内成瘤的影响.HE染色和TUNEL实验评估干扰对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响.结果:Western blot技术检测无效转染组(NC组)与对照组(SH-SY5Y组)相比,YB-1表达量无显著差异,而转染组(YB-1 shRNA组)与SH-SY5Y组相比,YB-1表达水平明显下降.克隆形成实验显示NC组细胞克隆形成能力与SH-SY5Y组细胞相比未发生显著变化(P>0.05),而与SH-SY5Y组相比,YB-1 shRNA组克隆形成能力显著下降(P<0.01).裸鼠成瘤统计分析结果显示,SH-SY5Y组的平均肿瘤体积和平均肿瘤重量明显高于YB-1 shRNA组(P<0.01),NC组肿瘤体积与重量与SH-SY5Y组相比无明显差异(P>0.05).HE染色和TUNEL染色发现SH-SY5Y组和NC组细胞与YB-1 shRNA组相比分裂活跃,凋亡细胞较少.结论:shRNA介导的YB-1表达沉默抑制细胞生长,诱导凋亡,显著抑制神经母细胞瘤的体内成瘤能力.     

水通道蛋白-5对结直肠癌细胞迁移、凋亡的影响及机制研究

目的:探讨短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）沉默水通道蛋白-5（aquaporin-5,AQP5）对人结直肠癌HT-29细胞和HCT116细胞迁移、凋亡的影响及相关机制。方法:构建pRNA-H1.1-AQP5的干扰质粒和pRNA-H1.1-NC的对照质粒转染HT-29和HCT116细胞,利用Real-time PCR（RT-PCR）、Western blot方法验证AQP5基因敲降效率,划痕试验检测AQP5-shRNA对结直肠癌细胞迁移率的影响,流式细胞术检测各组细胞的细胞凋亡率,Western blot检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2基因在蛋白水平的表达。选用NF-κB抑制剂BAY 11-7082（BAY）处理转染AQP5-shRNA的HT-29和HCT116细胞,划痕试验检测各组细胞的迁移率,Western blot检测凋亡基因Bax和Bcl-2的表达情况。结果:AQP-shRNA转染HT-29和HCT116细胞中,AQP5表达量明显低于NC-shRNA转染的HT-29和HCT116细胞（P＜0.05）。划痕试验结果表明,对比NC组,AQP5-shRNA明显抑制HT-29和HCT116细胞的迁移（P＜0.05）。流式细胞术结果表明AQP5-shRNA显著提高HT-29和HCT116细胞的凋亡率（P＜0.05）。对比NC-shRNA组,AQP5-shRNA组细胞中Bax蛋白表达明显提高,而Bcl-2蛋白表达显著下降。BAY处理后,AQP5-shRNA所抑制的结直肠癌细胞迁移率显著下降,AQP5-shRNA所促进的细胞凋亡率显著升高,且对比AQP5-shRNA组,AQP5-shRNA与BAY共同处理的细胞中Bax蛋白表达明显升高,Bcl-2蛋白表达明显降低。结论:AQP5-shRNA抑制结直肠癌细胞迁移,促进结直肠癌细胞凋亡受NF-κB信号调控。     

STAT3基因沉默对胰腺癌细胞放射敏感性的影响及其机制

目的:探讨信号转导和转录激活因子3（STAT3）基因沉默对人胰腺癌细胞AsPC-1和PANC-1放射敏感性的影响及其机制。方法:体外培养人胰腺癌细胞AsPC-1和PANC-1，通过脂质体转染STAT3 shRNA作为实验组（shSTAT3组），设置阴性对照（shNC组）和空白对照组（NC组）。采用qRT-PCR检测转染后各组AsPC-1和PANC-1细胞中STAT3 mRNA表达水平，Western blot检测细胞中STAT3蛋白表达水平。MTT实验检测各组细胞增殖能力，流式细胞仪检测各组细胞电子射线照射后的凋亡情况，qRT-PCR和Western blot分别检测各组细胞电子射线照射后的Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA和蛋白的表达情况。结果:shSTAT3组AsPC-1和PANC-1细胞中STAT3 mRNA和蛋白表达水平比NC组和shNC组明显降低（P<0.05）。接受电子射线照射后，shSTAT3组AsPC-1和PANC-1细胞增殖率显著低于shNC组（P<0.05），其细胞凋亡率较shNC组明显升高（P<0.05）。接受电子射线照射后，转染STAT3 shRNA后能够明显上调细胞中Bax和Caspase-3的表达和下调Bcl-2的表达（P<0.05）。结论:沉默STAT3基因能够通过上调Bax和Caspase-3的表达和下调Bcl-2的表达促进细胞凋亡，增强胰腺癌细胞的放射敏感性。     

miR-647通过靶基因NLRC5调控子宫内膜癌细胞的增殖和凋亡

目的:探讨miR-647对子宫内膜癌细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制。方法:实验设置miR-NC组、miR-647组、anti-miR-NC组、anti-miR-647组、si-NC组、si-NLRC5组、miR-647+pcDNA组、miR-647+pcDNA-NLRC5组。实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测miR-647和核苷酸寡聚化域样受体亚家族C5（nucleotide oligomerization domain-like receptor subfamily C5,NLRC5）mRNA表达水平;蛋白质印迹（Western blot）法检测NLRC5、细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（p21）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）的蛋白表达;四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡;荧光素酶报告实验检测miR-647和NLRC5的靶向关系。结果:子宫内膜癌组织中miR-647低表达,NLRC5高表达（P＜0.05）;过表达miR-647或抑制NLRC5表达,细胞活性显著降低,细胞凋亡率显著升高,CyclinD1、Bcl-2表达水平显著降低,p21、Bax表达水平显著升高（P＜0.05）。miR-647靶向调控NLRC5,NLRC5过表达逆转了miR-647过表达对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖和凋亡的作用。结论:过表达miR-647可能通过靶向下调NLRC5的表达抑制子宫内膜癌细胞增殖,促进细胞凋亡。     

RBMS3-AS3对宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响及作用机制

目的：探讨RNA结合基序单链相互作用蛋白3反义链3（RBMS3-AS3）对宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响及作用机制。方法：培养人宫颈永生化细胞Ect1/E6E7和宫颈癌HeLa、Caski和SiHa细胞，实时荧光定量PCR检测细胞中RBMS3-AS3表达水平，Western blot法检测RNA结合基序单链相互作用蛋白3（RBMS3）蛋白水平。将HeLa细胞分为对照组（细胞正常培养）、si-RBMS3-AS3组（转染RBMS3-AS3小干扰RNA）、阴性序列组（转染乱序无意义阴性序列）、si-RBMS3-AS3+si-RBMS3组（共转染RBMS3-AS3和RBMS3的小干扰RNA）和si-RBMS3-AS3+阴性序列组（共转染RBMS3-AS3与乱序无意义阴性序列），四甲基噻唑蓝染色法（MTT）检测细胞增殖率，流式细胞术检测细胞凋亡率，Transwell检测细胞侵袭能力，Western blot检测各组HeLa细胞中细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白（Bax）和基质金属蛋白酶2（MMP-2）蛋白表达水平。结果：宫颈癌细胞系HeLa、Caski和SiHa中RBMS3-AS3表达水平均高于Ect1/E6E7细胞（P < 0.05），而RBMS3蛋白表达低于Ect1/E6E7细胞（P < 0.05）。与对照组或阴性序列组相比，si-RBMS3-AS3组HeLa细胞的活性、侵袭细胞数、Cyclin D1、Bcl-2和MMP-2蛋白表达水平降低（P < 0.05），细胞凋亡率及RBMS3和Bax蛋白表达水平升高（P < 0.05）。与si-RBMS3-AS3+阴性序列组比较，si-RBMS3-AS3+si-RBMS3组HeLa细胞活性、侵袭细胞数及Cyclin D1、Bcl-2和MMP-2蛋白表达水平升高（P < 0.05），细胞凋亡率和Bax蛋白表达水平降低（P < 0.05）。结论：抑制RBMS3-AS3表达可抑制宫颈癌细胞增殖和侵袭，并促进细胞凋亡，这可能与上调RBMS3表达有关。     

2,3-吲哚醌诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡及周期阻滞

背景与目的:2,3-吲哚醌(isatin,ISA)是存在于哺乳动物体液及组织中的一种天然物质,已发现其对肿瘤细胞的生长有抑制作用,但具体作用机制尚不明。本研究以人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y为靶细胞,观察ISA对SH-SY5Y细胞的作用及其机制。方法:采用荧光染色、流式细胞术(flow cytometry,FCM)及Western blot等方法检测不同浓度ISA(0、100、200、400μmol/L)诱导SH-SY5Y细胞凋亡及细胞周期阻滞的作用机制。结果:400μmol/L ISA作用48h后,在荧光显微镜下观察到SH-SY5Y细胞出现核固缩、DNA断裂等典型的凋亡形态学改变。Western blot结果显示,随ISA浓度的增加,Bcl-2蛋白表达下降、Bax蛋白表达无明显改变,Bcl-2/Bax下降。100、200、400μmol/L ISA处理SH-SY5Y细胞48h,活化Caspase-3的表达率分别为19.28%、25.88%、33.43%,明显高于对照组(P<0.05)。Western blot进一步检测到其下游底物Caspase激活的脱氧核糖核酸酶抑制剂(inhibitor of caspase-activated DNase,ICAD)被降解。细胞周期分析表明,经100、200、400μmol/L ISA处理48h后,G1期SH-SY5Y细胞数明显增加,呈明显的G1期阻滞;磷酸化的ERK蛋白及Cyclin D1(CDK1)蛋白表达显著减少(P<0.05)。结论:ISA能明显诱导SH-SY5Y细胞凋亡和细胞周期G1期阻滞,该作用可能与Bcl-2/Bax降低、Caspase-3激活,以及下调磷酸化ERK和细胞周期因子CDK1表达有关。     

RBMS3-AS3对宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响及作用机制

目的：探讨RNA结合基序单链相互作用蛋白3反义链3（RBMS3-AS3）对宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响及作用机制。方法：培养人宫颈永生化细胞Ect1/E6E7和宫颈癌HeLa、Caski和SiHa细胞,实时荧光定量PCR检测细胞中RBMS3-AS3表达水平,Western blot法检测RNA结合基序单链相互作用蛋白3（RBMS3）蛋白水平。将HeLa细胞分为对照组（细胞正常培养）、si-RBMS3-AS3组（转染RBMS3-AS3小干扰RNA）、阴性序列组（转染乱序无意义阴性序列）、si-RBMS3-AS3+si-RBMS3组（共转染RBMS3-AS3和RBMS3的小干扰RNA）和si-RBMS3-AS3+阴性序列组（共转染RBMS3-AS3与乱序无意义阴性序列）,四甲基噻唑蓝染色法（MTT）检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞凋亡率,Transwell检测细胞侵袭能力,Western blot检测各组HeLa细胞中细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白（Bax）和基质金属蛋白酶2（MMP-2）蛋白表达水平。结果：宫颈癌细胞系HeLa、Caski和SiHa中RBMS3-AS3表达水平均高于Ect1/E6E7细胞（P < 0.05）,而RBMS3蛋白表达低于Ect1/E6E7细胞（P < 0.05）。与对照组或阴性序列组相比,si-RBMS3-AS3组HeLa细胞的活性、侵袭细胞数、Cyclin D1、Bcl-2和MMP-2蛋白表达水平降低（P < 0.05）,细胞凋亡率及RBMS3和Bax蛋白表达水平升高（P < 0.05）。与si-RBMS3-AS3+阴性序列组比较,si-RBMS3-AS3+si-RBMS3组HeLa细胞活性、侵袭细胞数及Cyclin D1、Bcl-2和MMP-2蛋白表达水平升高（P < 0.05）,细胞凋亡率和Bax蛋白表达水平降低（P < 0.05）。结论：抑制RBMS3-AS3表达可抑制宫颈癌细胞增殖和侵袭,并促进细胞凋亡,这可能与上调RBMS3表达有关。     

雌激素受体β1对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响

目的观察雌激素受体β1（ERβ1）被阻断后对Bax和Bcl-2表达的影响,探讨ERβ1在乳腺癌中的生物学作用机制。方法应用脂质体法,将针对人ERβl基因的siRNA转染人类乳腺癌细胞株MDA—MB-231。分别用Real time-PCR、Western Blot检测ERβ1被干扰前后细胞中ERβ1、Bcl-2、Bax等基因mRNA和蛋白表达水平的变化;通过细胞增殖曲线观察ERβ1基因被干扰后细胞增殖活性的变化;采用流式细胞仪分析细胞凋亡率的改变。计量资料的比较采用t检验或单因素方差分析。结果RNA干扰技术阻断乳腺癌MDA—MB-231细胞ERβ1基因的表达后,ERβ1 mRNA和蛋白水平显著下降（P〈0．05）,生长曲线显示细胞增殖能力明显增强（P〈0．05）;pSilencer—ERβ1转染组细胞的Bax基因mRNA及蛋白水平显著下降（P〈0．01）,Bcl-2基因的表达未发生变化,Bcl-2／Bax比值明显上升;pSilencer-ERβ1转染组细胞凋亡率较未转染组明显减少（t=6．22,P=0．00）。结论ERβ1可通过调控细胞凋亡相关基因Bax而促进细胞的凋亡,是ERβ1抑制细胞增殖的原因之一。     

RNA干扰沉默Survivin表达提高131I对甲状腺癌FTC-133细胞增殖的抑制作用

目的:探讨RNA干扰沉默Survivin表达对131I抑制甲状腺癌FTC-133细胞生长的作用及其机制。方法:采用脂质体法将Survivin-siRNA及其阴性对照NC-siRNA转染至干扰组和NC组细胞中,Real-time PCR和Western blot检测Survivin mRNA和蛋白的表达;以131I孵育后,MTT法、流式细胞仪检测Survivin对FTC-133细胞增殖、周期和凋亡的影响,Western blot检测细胞中CDK2、Cyclin E、Bax和Bcl-2蛋白的表达变化。结果:转染Survivin-siRNA成功沉默FTC-133细胞中Survivin mRNA和蛋白的表达,抑制FTC-133细胞增殖,诱导细胞阻滞于G0/G1期和细胞凋亡,并下调细胞中CDK2、Cyclin E和Bcl-2蛋白的表达,上调Bax蛋白的表达;131I孵育后,干扰组细胞中的上述变化较NC组明显增强。结论:沉默Survivin表达可提高131I对FTC-133细胞增殖的抑制作用和对细胞凋亡的促进作用,其作用机制可能与下调CDK2、Cyclin E、Bcl-2和上调Bax蛋白的表达有关。     

肌动蛋白相关蛋白2/3复合体亚基2基因沉默对甲状腺乳头状癌TPC-1细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨沉默肌动蛋白相关蛋白2/3复合体亚基2(ARPC2)基因对甲状腺乳头状癌(PTC)TPC-1细胞生物学特性的影响。方法采用无义短发夹RNA(shRNA)序列慢病毒(shCtrl)感染的TPC-1细胞作为对照组,采用含有ARPC2 shRNA干扰序列慢病毒(shARPC2)感染的TPC-1细胞作为实验组。利用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、流式细胞术、蛋白质印迹法以及克隆形成实验检测抑制ARPC2表达对TPC-1细胞增殖、细胞周期及其相关蛋白表达、克隆形成的影响;利用流式细胞术和蛋白质印迹法检测抑制ARPC2基因对TPC-1细胞凋亡及相关蛋白的影响。结果shARPC2可以高效感染TPC-1细胞,72 h后感染效率达到85%以上。MTT法检测显示,与对照组相比,实验组TPC-1细胞的增殖被抑制。实验组S期细胞比例较对照组低[(14.79±0.21)%比(21.13±0.33)%,t=27.77,P<0.05],实验组G1与G2/M期细胞比例较对照组增高[G1期:(67.57±0.08)%比(62.06±0.36)%,t=25.56,P<0.05;G2/M期:(17.64±0.12)%比(16.91±0.17)%,t=6.154,P<0.05]。实验组细胞周期相关蛋白CDK2、CyclinE和CyclinD的表达均降低。实验组形成克隆数低于对照组,差异有统计学意义[(10±2)个比(161±6)个,t=9.011,P<0.05]。实验组细胞凋亡率高于对照组[(8.60±0.77)%比(4.08±0.40)%,t=9.011,P<0.05]。对照组抗凋亡因子p21与bcl-2蛋白表达降低,促凋亡因子bax蛋白表达上调。结论shRNA干扰ARPC2基因的表达可以抑制PTC TPC-1细胞的增殖,并促进细胞凋亡。ARPC2可能是PTC治疗的生物学新靶标。     

RANKL/RANK通路介导神经母细胞瘤细胞迁移的机制探讨

目的:探讨RANKL/RANK通路对神经母细胞瘤（neuroblastoma,NB）SH-SY5Y细胞系细胞侵袭和转移的作用机制。方法:通过pcDNA3.1+-RANKL和siRNA-RANKL转染NB SH-SY5Y细胞系过表达或沉默外源基因RANKL;细胞增殖实验(cell counting kit-8,CCK-8)检测外源基因RANKL转染NB SH-SY5Y细胞系对细胞增殖的影响;划痕试验检测外源基因RANKL转染NB SH-SY5Y细胞系对细胞迁移的影响;Western blot实验检测外源性基因RANKL转染NB SH-SY5Y细胞系后细胞内基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9,MMP9）、基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2,MMP2）表达变化。结果:通过pcDNA3.1+-RANKL和siRNA-RANKL对NB SH-SY5Y细胞系转染外源性RANKL基因后三组NB细胞增殖能力无统计学差异;RANKL基因过表达后NB SH-SY5Y细胞迁移能力增强（P<0.01）,RANKL沉默后NB SH-SY5Y细胞迁移能力减弱（P<0.01）;RANKL基因过表达后NB SH-SY5Y细胞内MMP9、MMP2表达增强（P<0.05、P<0.001）,RANKL沉默后NB SH-SY5Y细胞内MMP9、MMP2表达减弱（P<0.05、P<0.01）。结论:RANKL/RANK通路介导NB细胞迁移,并可能通过抑制细胞内MMP2、MMP9表达实现。     

顺铂联合迷迭香酸抑制Huh7细胞增殖诱导凋亡

目的:探讨含铂抗癌药物顺铂（Cisplatin,CDDP）联合中药单体迷迭香酸（Rosmarinic acid,RA）对人原发性肝癌Huh7细胞系增殖与凋亡的影响。方法:通过CCK-8细胞增殖实验检测并计算CDDP和RA治疗24 h、48 h、72 h后的IC50值,随后设置未经药物处理组（control组）、5 μg/mL CDDP处理组、200 μg/mL RA处理组以及5 μg/mL CDDP联合200 μg/mL RA处理组。采用流式细胞术检测control组、CDDP处理组、RA处理组以及联合用药组的细胞凋亡率分别为（7.28±0.56）%、（18.23±2.53）%、（26.44±1.99）%和（37.27±0.28）%。最后,利用免疫印迹试验(Western blot)检测Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3以及Procaspase-3凋亡相关蛋白的表达水平。结果:RA可增强CDDP对Huh7细胞增殖的抑制能力并呈现出浓度依赖性（P＜0.05）,在CDDP联合RA处理组中Huh7细胞的凋亡率显著升高（P＜0.05）,CDDP联合RA作用后促凋亡蛋白Bax与Cleaved-caspase-3的表达水平增加,而Bcl-2的表达水平下降（P＜0.05）。结论:RA能抑制Huh7细胞增殖并且诱导细胞凋亡,与顺铂联用具有协同作用,其机制可能与激活线粒体凋亡通路有关。     

ACY-1在儿童神经母细胞瘤组织和细胞中的表达及其意义

目的:探究氨基酰化酶-1(aminoacylase-1,ACY-1)在儿童神经母细胞瘤组织和细胞中的表达及其意义.方法:采用qRT-PCR和Western blot技术对儿童神经母细胞瘤患者的肿瘤组织和癌旁组织中ACY-1的表达进行检测.然后对人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞株)进行体外细胞功能实验,运用重组腺病...