雷帕霉素对豚鼠形觉剥夺性近视的干预作用及相关机制研究

目的　探讨球结膜下注射雷帕霉素对豚鼠形觉剥夺性近视（FDM）的干预作用及相关机制。方法　选取2～3周龄豚鼠80只（80眼）,雌雄不限,随机分为4组:空白对照组、FDM组、雷帕霉素组、FDM+雷帕霉素组;空白对照组不做任何处理;FDM组单纯缝合豚鼠右眼眼睑;雷帕霉素组于实验第1天、第7天豚鼠右眼球结膜下注射雷帕霉素50 μg;FDM+雷帕霉素组于实验第1天、第7天豚鼠右眼球结膜下注射雷帕霉素50 μg后再缝合右眼眼睑。记录各组豚鼠实验前及实验第7天、第14天的眼轴长度、屈光度;并取各组豚鼠视网膜行过碘酸-雪夫染色（PAS染色）及透射电镜检查,观察各组豚鼠视网膜形态变化;取各组豚鼠巩膜行RT-PCR检测巩膜组织中mTOR、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及转化生长因子β1（TGF-β1）的mRNA表达;利用Western blot 检测各组豚鼠巩膜组织中AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR的蛋白表达。结果　FDM组与空白对照组相比,实验第7天、第14天豚鼠的右眼眼轴长度、屈光度增加,形成了相对近视;FDM组巩膜中MMP-2、α-SMA 的mRNA相对表达量与空白对照组相比均增加,TGF-β1 mRNA相对表达量减少,差异均具有统计学意义（均为P<0.05）;与空白对照组相比,FDM组豚鼠巩膜中mTOR mRNA和AKT、P-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白的相对表达量变化不大,差异均无统计学意义（均为P>0.05）,但视网膜变薄,各层结构排列紊乱、疏松。雷帕霉素组与空白对照组相比,实验第7天、第14天豚鼠右眼眼轴长度、屈光度差异均无统计学意义（均为P>0.05）,且视网膜形态无明显变化。FDM+雷帕霉素组与FDM组相比,实验第7天豚鼠右眼眼轴长度、屈光度差异均无统计学意义（均为P>0.05）,实验第14天右眼眼轴长度和屈光度均减小,差异均有统计学意义（均为P<0.05）,TGF-β1 mRNA的相对表达量增多,MMP-2、α-SMA、mTOR 的mRNA和AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR的蛋白相对表达量均减少,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　雷帕霉素球结膜下注射可延缓豚鼠FDM的形成,可能是通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路、调节巩膜中的MMP-2、TGF-β1、α-SMA的表达而发挥作用的,且对正常豚鼠视网膜结构没有影响。     

miR-370通过FoxM1相关通路调控人视网膜母细胞瘤细胞凋亡机制研究

目的　探讨miR-370对人视网膜母细胞瘤细胞Y79增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制。方法　通过Lipofectamine TM 2000将miR-370-mimics、miR-370-NC及miR-370-inhibitor转染至Y79细胞内,分别建立miR-370过表达组（mimics组）、对照组（NC组）和抑制组（inhibitor组）,三组转染24 h、48 h、72 h和96 h时,均使用CCK-8检测各组细胞增殖活性;转染48 h后,RT-PCR检测各组细胞内miR-370表达;Annexin V-FITC/PI联合流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,Western Blot检测各组细胞PI3K、P-AKT、FoxM1蛋白表达。结果　mimics组细胞miR-370 mRNA表达远高于其他两组（均为P<0.05）,inhibitor组细胞miR-370 mRNA表达显著低于其他两组（均为P<0.05）。自转染48 h起,inhibitor组细胞增殖活性显著高于其他两组（均为P<0.05）,而mimics组细胞增殖活性显著低于其他两组（均为P<0.05）,这种趋势一直持续至转染后96 h。mimics组细胞早期凋亡率显著高于其它两组（均为P<0.05）,而inhibitor组细胞早期凋亡率在三组中最低（P<0.05）。mimics组细胞内PI3K、P-AKT、FoxM1蛋白表达均显著低于其他两组（均为P<0.05）,而inhibitor组细胞内PI3K、P-AKT、FoxM1蛋白表达显著高于其他两组（均为P<0.05）。结论　miR-370能够抑制人视网膜母细胞瘤细胞Y79的增殖,促进其凋亡,这种影响可能是通过降低PI3K/AKT/FoxM1信号通路的活性实现的。     

反义c-myc基因转染抑制人晶状体上皮细胞增殖的研究

目的探讨腺病毒介导的反义cmyc基因(AdASmyc)转染对人晶状体上皮细胞(HLEC)系B3(HLEB3)增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法将AdASmyc转染HLEB3,观察细胞形态变化;采用生长曲线法、噻唑蓝比色法分析细胞增殖改变;使用流式细胞仪测定细胞凋亡变化、分析细胞周期改变(DNA倍体法);采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法、Western免疫印迹法检测细胞cmycmRNA及其蛋白产物表达的变化。结果AdASmyc成功转染后,HLEB3逐渐变圆、脱壁。转染后24~96h细胞的增殖受到抑制,与相应对照组比较,差异均有统计学意义(P<001);凋亡细胞比例(转染48h为1833%,转染96h为2693%)明显升高,与相应对照组(48h为319%,96h为175%)比较,差异均有统计学意义(P<001);细胞出现G1期阻滞现象,表现为G1期细胞比例[转染48h为(6050±759)%,转染96h为(8190±860)%]增加和S期细胞比例[转染48h为(2840±338)%,转染96h为(1675±897)%]下降,与相应对照组比较,差异均有统计学意义(P<001);RTPCR法和Western免疫印迹法检测发现cmycmRNA及其蛋白产物水平特异性下调。结论AdASmyc可成功转染HLEB3,并特异性抑制cmyc基因的表达,诱发细胞G1期阻滞,有效抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

自噬调节高浓度葡萄糖诱导的人晶状体上皮细胞上皮间质转化

目的:探究自噬水平变化对高糖诱导人晶状体上皮细胞上皮间质转化(EMT)的影响及其机制。方法:人晶状体上皮细胞(HLE-B3)分为正常对照组(NC组)和高糖处理组(HG组),分别用含5.5mmol/L葡萄糖的DMEM和添加了30mmol/L葡萄糖的上述DMEM培养12、24、48h,用Western blot检测上皮间质转化标志蛋白(E-cadherin、α-SMA)和自噬标志蛋白(LC3、Beclin 1和SQSTM1/p62)的表达变化,用划痕实验观察细胞的移行能力以明确高糖对晶状体上皮细胞自噬和EMT的影响。利用雷帕霉素调节自噬水平,将细胞分为正常对照组(NC组)、高糖处理组(HG组),高糖处理细胞的同时添加DMSO溶剂组(DMSO组)和添加200nmol/L雷帕霉素的雷帕霉素组(RAPA组),处理细胞24h,用Transwell实验观察细胞的移行能力,用Western blot检测EMT、自噬标志蛋白和TGF-β信号通路蛋白(TGF-β2、Smad2/3、p-Smad2/3、Snail)的表达。用细胞免疫荧光染色观察SQSTM1/p62与Smad2/3在细胞内的表达,免疫共沉淀方法检测细胞中SQSTM1/p62与Smad2/3之间的相互结合。结果:在高糖刺激后12、24、48h,HG组细胞E-cadherin、LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1蛋白表达逐渐降低(F=67.52、163、206,均P<0.0001),而α-SMA、SQSTM1/p62蛋白表达增加(F=53.37、302.1,均P<0.0001),细胞移行也较NC组增加(均P<0.001),提示高糖刺激后细胞发生EMT,而自噬水平降低;雷帕霉素处理后,与HG组和DMSO组相比,RAPA组LC3Ⅱ/Ⅰ和E-cadherin蛋白表达水平增加,α-SMA、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3及Snail蛋白表达降低(均P<0.05),TGF-β2表达无明显改变(均P>0.05),细胞移行被抑制(均P<0.001),提示雷帕霉素在提高自噬水平的同时下调了TGF-β信号通路分子的表达进而抑制了EMT。细胞免疫荧光染色结果显示SQSTM1/p62与Smad2/3在胞浆内存在共定位,免疫共沉淀实验证实了SQSTM1/p62与Smad2/3蛋白相互结合。结论:高糖可刺激HLE-B3细胞发生EMT,下调细胞的自噬水平;自噬通过SQSTM1/p62与Smad2/3相互作用,改变了TGF-β信号通路中Smad2/3的表达,实现对EMT的调节。     

热休克蛋白5调控内质网应激在视网膜色素上皮细胞保护中的作用

目的　探讨相对分子质量70 000的热休克蛋白5（heat shock 70 kDa protein 5,HSPA5）调控内质网应激在N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺（N-retinylidene-N-retinylethanolamine,A2E）联合蓝光诱导视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞损伤对RPE细胞的保护作用。方法　建立A2E联合蓝光诱导RPE细胞损伤模型,显微镜下观察RPE细胞对A2E的摄取。在RPE细胞损伤后3 h、6 h、12 h、24 h和48 h,运用CCK-8法检测RPE细胞活力;Western blot检测RPE细胞内质网应激相关蛋白HSPA5和CHOP的表达情况。构建HSPA5 shRNA慢病毒载体抑制RPE细胞中HSPA5的表达,实验分3组,HSPA5干扰组转染了HSPA5干扰序列,阴性干扰组转染了阴性对照序列,野生型组为未转染的RPE细胞。检测在RPE细胞损伤时,干扰HSPA5对内质网应激相关凋亡分子CHOP、Caspase-12表达以及RPE细胞活力的影响。结果　细胞活力检测结果显示,A2E联合蓝光照射后3 h、6 h、12 h、24 h和48 h,RPE细胞活力分别是对照组的（80.9±6.2）%、（73.3±5.8）%、（70.6±5.4）%、（62.3±6.1）%和（51.4±4.5）%,与对照组相比差异均有统计学意义（均为P<0.05）。Western blot检测结果显示,HSPA5和CHOP蛋白表达在RPE细胞损伤后均有不同程度增高（P<0.05）。在A2E联合蓝光处理后12 h,HSPA5干扰组的CHOP和Caspase-12蛋白表达较对照组显著升高,并且RPE细胞活力明显下降（均为P<0.05）。结论　A2E联合蓝光可诱导RPE细胞发生损伤,损伤机制与内质网应激相关。HSPA5具有调控内质网应激,减轻A2E及蓝光损伤,促进RPE细胞存活的作用。     

缺氧及小干扰RNA转染对人RPE细胞增生及血小板源性生长因子-BB表达的影响

背景 增生性玻璃体视网膜病变（PVR）为视网膜表面发生无血管、纤维细胞性增生膜,其发生和发展的具体机制尚未完全阐明.人视网膜色素上皮（hRPE）及血小板源性生长因子（PDGF）在PVR发展中的作用是近几年研究的热点. 目的 探讨缺氧对体外培养hRPE细胞PDGF-BB表达及增生的影响. 方法 hRPE细胞在6孔板中培养,实验组用10、15、20、30、40 μmol/L CoCl2模拟体外培养hRPE细胞的缺氧环境,对照组用未加CoCl2的培养液培养hRPE细胞,采用逆转录PCR（RT-PCR）与ELISA法检测PDGF-BB mRNA和蛋白的表达,采用MTT法检测hRPE细胞增生率.依据转染siRNA的不同将细胞分为PDGF-BB siRNA1组、PDGF-BB siRNA2组、PDGF-BB siRNA3组（为针对PDGF-BB的3条不同的siRNA,其中有一条为有效siRNA）、β-actin siRNA组、无关siRNA组和只加Lip2000的空白对照组.转染4～6h后,除空白对照组外,其余各组加入对细胞PDGF-BB mRNA和蛋白及对hRPE细胞增生影响最明显的15 μmol/L CoCl2模拟细胞缺氧环境24 h,检测PDGF-BB mRNA和蛋白及hRPE细胞增生率. 结果 未加CoCl2的对照组未检测出PDGF-BBmRNA和蛋白的表达,不同浓度CoCl2培养hRPE细胞PDGF-BB mRNA和蛋白的表达量不同,差异均有统计学意义（F=43.737,P＜0.01;F=54.612,P＜0.05）,15μmol/L CoCl2组PDGF-BB的表达量最多,与其他各组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）.MTT检测结果显示,不同浓度CoCl2处理后PDGF-BB蛋白表达及hRPE细胞增生率明显不同,差异均有统计学意义（F=95.379,P＜0.01;F=63.375,P＜0.05）,15 μmol/L CoCl2组hRPE细胞增生率明显高于其他浓度组,差异均有统计学意义（P＜0.05）,PDGF-BB蛋白表达量与hRPE细胞增生率呈线性正相关（r=0.994,P＜0.05）.各细胞转染组hRPE细胞中PDGF-BB mRNA及蛋白的表达整体比较,差异均有统计学意义（F=156.330、125.650,P＜0.01）,且PDGF-BB siRNA2组PDGF-BB mRNA较其他各组明显下降,差异均有统计学意义（P＜0.01）.MTT检测结果显示,各细胞转染组PDGF-BB蛋白的表达及hRPE细胞增生率明显不同,差异均有统计学意义（F=73.131、98.564,P＜0.01）,PDGF-BB siRNA2组PDGF-BB蛋白的表达及细胞增生率与其他各组比较明显下降,差异均有统计学意义（P＜0.05）,PDGF-BB蛋白表达与hRPE细胞增生率呈线性正相关（r=0.996,P＜0.05）.结论 缺氧能够促进PDGF-BB的表达,PDGF-BB的表达上调可显著促进hRPE细胞的增生.在转染靶向PDGF-BB siRNA后,PDGF-BB的表达受到抑制,可有效降低hRPE细胞的增生率.     

胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）基因表达对脉络膜黑色素瘤细胞增殖、凋亡及STAT3信号通路的调控作用

目的　探讨胰岛素样生长因子1受体（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）基因表达对脉络膜黑色素瘤（choroidal melanoma，CM）细胞增殖、凋亡及STAT3信号通路的调控作用。方法　参照Lipofectamine^TM2000说明将干扰IGF-1R表达的siRNA转染人CM细胞OCM-1作为IGF-1R-siRNA组，并设置无干扰作用的siRNA及加入脂质体的细胞作为阴性对照组和空白对照组，AG490作为STAT3信号通路抑制剂，收集转染48 h的细胞，通过CCK8法及流式细胞仪分别检测细胞活力及细胞凋亡率；Western blot检测STAT3信号通路磷酸化的p-JAK2和p-STAT3及下游靶基因Cyclin D1和Bcl-xL的表达。结果　阴性对照组IGF-1R表达量（0.243±0.036）与空白对照组（0.228±0.030）差异无统计学意义（P>0.05），IGF-1R-siRNA组IGF-1R表达量（0.071±0.010）低于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。IGF-1R-siRNA转染的OCM-1细胞IGF-1R的表达明显降低；与空白对照组比较，IGF-1R-siRNA组细胞活力显著降低，细胞凋亡率显著升高（均为P<0.05）。IGF-1R-siRNA组p-JAK2、p-STAT3、Cyclin D1和Bcl-xL的蛋白表达均低于空白对照组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。IGF-1R-siRNA+AG490组细胞活力低于IGF-1R-siRNA组，细胞凋亡率高于IGF-1R-siRNA组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。IGF-1R-siRNA组p-JAK2、p-STAT3、Cyclin D1和Bcl-xL的蛋白表达均高于IGF-1R-siRNA+AG490组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　下调 IGF-1R基因表达可通过抑制STAT3信号通路降低CM细胞增殖并诱导细胞凋亡。     

mTOR通路抑制剂雷帕霉素对真菌性角膜炎小鼠角膜瘢痕化的影响

目的　探讨mTOR通路抑制剂雷帕霉素对真菌性角膜炎小鼠角膜瘢痕化的影响。方法　取96只SPF级C57BL/6J雄性小鼠,随机分为雷帕霉素组和对照组，每组各48只。两组小鼠同时建立真菌性角膜炎模型。雷帕霉素组模型制作前1 d按6.0 mg·kg^-1雷帕霉素对小鼠进行腹腔注射预处理，之后按0.2 g·L^-1浓度在结膜下注射5 μL，持续3 d；对照组注射PBS溶液。造模后对各组小鼠进行角膜临床评分，Western blot和实时荧光定量PCR分别检测造模后各组小鼠不同时间角膜LC-3Ⅱ、α-SMA和 TGF-β1表达情况。结果　造模后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、336 h，对照组小鼠角膜临床评分均明显高于雷帕霉素组，差异均有统计学意义(均为P＜0.05) 。造模后144 h、216 h雷帕霉素组小鼠角膜LC-3Ⅱ表达上调，LC-3Ⅱ蛋白和mRNA相对表达量与对照组相比，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；而在造模后72 h及336 h两组LC-3Ⅱ蛋白和mRNA相对表达量差异均无统计学意义（均为P>0.05）。与对照组相比，造模后144 h、216 h雷帕霉素组小鼠角膜α-SMA蛋白及 mRNA相对表达量下降，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；造模后144 h、336 h雷帕霉素组TGF-β1 mRNA相对表达量亦下降，与对照组相比，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。结论　雷帕霉素通过促进自噬作用下调角膜瘢痕化相关因子的表达，减轻了真菌性角膜炎模型小鼠角膜瘢痕化程度。     

人巩膜成纤维细胞中miR-184表达与近视发生、发展的关系及其对PI3K-Akt信号通路的调控作用

目的　探讨人巩膜成纤维细胞中miR-184表达与近视发生、发展的关系及其对磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路的调控作用。方法　利用形觉剥夺法建立豚鼠左眼（实验眼）近视模型，右眼为对照眼，采用实时定量PCR法检测豚鼠实验眼巩膜组织中miR-184以及PI3K-Akt信号通路相关mRNA的表达水平，采用Pearson相关分析豚鼠实验眼巩膜组织中miR-184与PI3K、Akt、雷帕霉素机械靶蛋白(mTOR) mRNA表达水平的相关性。体外培养人巩膜成纤维细胞，并分为对照组（mimics对照组）、高表达组（转染miR-184 mimic）、低表达组（转染anti-miR-184）和PI-103组（加入PI3K通路抑制剂PI-103）。采用Western blot检测各组人巩膜成纤维细胞中PI3K-Akt信号通路相关蛋白表达水平，流式细胞检测技术检测细胞增殖，Annexin V-FITC染色观察细胞凋亡。结果　豚鼠实验眼巩膜组织中miR-184与PI3K、Akt、mTOR mRNA表达水平均明显低于对照眼(均为P<0.05)，且实验眼巩膜组织中miR-184与PI3K、Akt、mTOR mRNA表达水平均呈正相关性(均为P<0.05)。体外实验中，培养24 h、48 h、72 h、96 h时，高表达组人巩膜成纤维细胞增殖倍数>对照组>低表达组>PI-103组；培养24 h 时，4组人巩膜成纤维细胞增殖倍数比较差异无统计学意义（P>0.05）；培养48 h、72 h、96 h时，4组人巩膜成纤维细胞增殖倍数整体比较以及组间两两比较差异均有统计学意义（均为P<0.05）。培养24 h时，4组人巩膜成纤维细胞凋亡率差异有统计学意义（P<0.05），PI-103组>低表达组>对照组>高表达组，组间两两比较差异均有统计学意义（均为P<0.05）。培养72 h时，4组人巩膜成纤维细胞中PI3K、Akt、mTOR蛋白表达水平差异均有统计学意义（均为P<0.05），高表达组人巩膜成纤维细胞中PI3K、Akt、mTOR蛋白表达水平>对照组>低表达组>PI-103组，组间两两比较差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　近视眼的发生、发展与巩膜组织中miR-184表达下调有关，其作用机制可能为miR-184表达下调导致PI3K-Akt信号通路调控受阻，进而抑制巩膜成纤维细胞增殖以及促进细胞凋亡。     

miR-34a-5p对ARPE-19细胞TGF-β/Smad通路相关蛋白表达及细胞增殖、迁移和上皮-间质转化的影响

目的 探讨miR-34a-5p对ARPE-19细胞TGF-β/Smad通路相关蛋白表达及细胞增殖、迁移和上皮-间质转化(EMT)的影响。方法 将ARPE-19细胞分为4组：对照组、转化生长因子(TGF)-β1组、miR-34a-5p过表达组与复合干预组,对照组与TGF-β1组采用Lipofectamine 2000转染试剂转染对照模拟物,miR-34a-5p过表达组与复合干预组转染miR-34a-5p模拟物,培养24 h后采用无血清培养基饥饿培养12 h, TGF-β1组与miR-34a-5p过表达组均添加10 mg·L^-1的TGF-β1,复合干预组添加10 mg·L^-1的TGF-β1与10μmol·L^-1的TGF-β通路激活剂SRI-011381,各组细胞继续培养24 h,测定细胞增殖、迁移与EMT。采用Western blot检测细胞TGF-β/Smad通路相关蛋白的表达水平,Ki67荧光染色检测细胞增殖情况,免疫荧光染色测定细胞EMT相关蛋白表达情况,划痕实验和Transwell实验测定细胞的迁移和侵袭能力。结果 ...     

PI3K/AKT/mTOR signaling pathway inhibitors in proliferation of retinal pigment epithelial cells

AIM: To determine whether the PI3K/AKT/mTOR pathway is activated in proliferative vitreoretinopathy (PVR) in homo-sapiens. METHODS: The retina of controls and patients with PVR were collected and their levels of PI3K, phospho-AKT, phospho-mTOR, phospho-p70S6k and phospho-4EBP-1 were determined by Western blot. The cultured human retinal pigment epithelial cell line D407 was treated with a specific mTOR inhibitor, rapamycin (RAPA) or a PI3K inhibitor, LY294002, of various concentrations and durations. Cell morphology was observed by phase contrast microscopy and the proliferation and apoptosis of treated cells were determined by MTT assay and flow cytometry. RESULTS: Levels of PI3K, phospho-AKT, phospho-mTOR, phospho-P70S6K and phospho-4EBP1 was increased in the retina in PVR (P<0.05). In D407 cells, both RAPA and LY294002 significantly inhibited cell proliferation and cell cycle progression, and promoted apoptosis (P <0.05); morphologically, the cells became smaller. Both RAPA and LY294002 reduced levels of phospho-AKT, phospho-mTOR, phospho-p70S6k and phospho-4EBP1 expression (P <0.05). RAPA, but not LY294002, had no significant effect on PI3K expression. CONCLUSION: PI3K/AKT/mTOR signaling pathway is highly activated in the retinal pigment epithelial cells of PVR. The inhibitors of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway, RAPA and LY294002, could inhibited the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway by reducing the levels of phosphorylation of mTOR pathway components.     

姜黄素对碱烧伤诱导的兔眼角膜新生血管抑制作用的实验研究

目的探讨姜黄素对碱烧伤诱导的大耳兔眼角膜新生血管(CNV)的影响及其机制。 方法采用碱烧伤法制备CNV模型。模型制作成功后,采用数字表法将健康的成年雄性日本大耳兔48只随机平均分为4组,对照组给予二甲基亚砜,实验1组给予40 μmol/L姜黄素,实验2组给予80 μmol/L姜黄素,实验3组给予160 μmol/L姜黄素。右眼分别滴眼相应药物,所有滴眼药物用量均为20 μl,4次/d,连续用药14 d。用裂隙灯显微镜观察CNV的生长情况。采用酶联免疫吸附试验检测大耳兔眼碱烧伤2 d、4 d、7 d及14 d后的房水中血管内皮生长因子(VEGF)、4E结合蛋白(4EBP1)因子的蛋白含量;采用逆转录-聚合酶链反应检测眼角膜组织中4EBP1、S6蛋白激酶(P70S6K)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的信使核糖核酸(mRNA)的相对表达量。组间比较采用两因素重复测量方差分析,当差异有统计学意义时,进一步采用SNK法两两比较。计算Spearman相关系数判断4EBP1与VEGF蛋白之间的相关性。 结果大耳兔眼角膜碱烧伤后4 d时,各实验组与对照组的平均CNV面积无统计学差异(F＝0.592,P>0.05);眼角膜碱烧伤后7 d、14 d时,则各实验组与对照组平均CNV面积差异有统计学意义(F＝27.5,28.64;P<0.05)。大耳兔眼角膜碱烧伤后2 d时,各实验组房水中的4EBP1、VEGF蛋白含量与对照组的差异无统计学意义(F＝2.46,3.62;P>0.05)。大耳兔眼角膜碱烧伤后4 d、7 d、14 d时,各实验组房水中的4EBP1、VEGF蛋白含量与对照组相比,差异具有统计学意义(F＝10.73,49.15,62.37,17.55,106.61,202.13;P<0.05),且4EBP1与VEGF的蛋白表达呈线性正相关(r＝0.969,0.803,0.67,0.972;P<0.05)。大耳兔眼角膜碱烧伤后7 d时,实验1组的角膜组织中mTOR、4EBP1及P70S6K的mRNA相对表达量为(0.73±0.26)、(0.58±0.19)和(0.52±0.29);实验2组的相对表达量分别为(0.48±0.13)、(0.39±0.21)和(0.41±0.18);实验3组的相对表达量分别为(0.36±0.09)、(0.22±0.09)和(0.18±0.07)。大耳兔眼角膜碱烧伤后14 d时,各实验组mTOR、4EBP1和P70S6K的mRNA表达量较眼角膜碱烧伤后7 d时的mRNA表达量降低;且随着姜黄素浓度的增高,mTOR、4EBP1和P70S6K在mRNA水平的相对表达量依次降低。 结论姜黄素可通过抑制mTOR信号传导通路降低VEGF蛋白的表达,从而抑制眼角膜碱烧伤后新生血管的生长。     

MicroRNA-4516、MicroRNA-198在视网膜母细胞瘤Y79细胞中的表达及其意义

目的 探究MicroRNA-4516(miR-4516)、MicroRNA-198(miR-198)在视网膜母细胞瘤(RB)Y79细胞中的表达及其临床意义.方法 收集2018年3月至2021年3月行眼球摘除术治疗的35例RB患儿的肿瘤组织及30例正常视网膜组织标本,比较肿瘤组织、正常视网膜组织和Y79细胞中miR-45...     

腺相关病毒介导的增强型绿色荧光蛋白基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞的实验研究

目的　比较四种不同血清型腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)介导增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞（guinea pig scleral fibroblast,GSF）的转染效率及安全性，筛选合适的基因转染载体。方法　原代分离培养GSF并鉴定，利用AAV2、AAV5、AAV8、AAV9介导EGFP基因并按不同感染复数（multiplicity of infection,MOI）10、100、1000、10 000转染GSF，空白对照组加入空白培养基，转染后2 d、3 d、4 d、5 d荧光显微镜下观察GFP表达强度及细胞生长状态，流式细胞术检测细胞转染率及凋亡率，CCK-8法检测细胞活力。结果　AAV感染GSF后2 d各组均可见弱荧光，荧光强度随时间延长及MOI值增大而增强，而AAV9-EGFP组全程弱荧光，空白对照组全程无荧光。转染后5 d，MOI=10 000时各组荧光最强，基因转染率组间整体比较，差异具有统计学意义（P<0.05）；组间两两比较，AAV8-EGFP组均高于其他各组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。各组Annexin V阳性凋亡率与空白对照组比较，差异均无统计学意义（均为P>0.05）。各组在450 nm波长处光密度值与空白对照组比较，差异均无统计学意义（均为P>0.05）。结论　AAV8能有效地转染GSF，且对细胞凋亡、细胞活力无明显影响，是安全可行的。     

Phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K)/Akt but not PI-3K/p70 S6 kinase signaling mediates IGF-1-promoted lens epithelial cell survival

PURPOSE: To investigate the ability of insulin-like growth factor (IGF)-1 to prevent apoptosis in lens epithelial cells and the involvement of phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K)/Akt and PI-3K/p70 S6 kinase (p70 S6K) signaling in the cell-survival process. METHODS: Apoptosis in rabbit lens epithelial cell cultures was induced by staurosporine (10 ng/mL). Cellular apoptosis was detected by identifying the characteristic ladder-like fragmentation of genomic DNA in agarose gels and the intense blue fluorescence exhibited by apoptotic nuclei of cells in live cultures in the presence of Hoechst 33,258 dye. Proliferation of lens epithelial cells grown in culture was measured with a DNA-binding fluorescent dye. Overexpression of the constitutively active Akt (CA-Akt) in epithelial cells was achieved by the transfection of cells using Fugene 6 reagent with a plasmid carrying Akt cDNA. Western immunoblotting was performed to identify various proteins of interest. RESULTS: IGF-1 (5 to 50 nM) and insulin (100 to 400 nM) suppressed lens epithelial cell apoptosis in a dose-dependent manner, as determined by a significant inhibition of genomic DNA fragmentation and the decreased number of intense blue fluorescent Hoechst stain-positive apoptotic nuclei in live cultures. DNA degradation was almost completely inhibited in the presence of 50 nM IGF-1 or 400 nM insulin. PI-3K inhibitors wortmannin and LY294002 blocked the IGF-1 effect on cell survival. Stimulation of lens epithelial cells with IGF-1 for 10 minutes to 24 hours resulted in the sustained activation of both Akt and p70 S6K. IGF-1 also induced the phosphorylation of Bad (a pro-apoptotic protein of the Bcl-2 family), which was inhibited by PI-3K inhibitors, but not by the p70 S6K inhibitor rapamycin. Furthermore, activation of Akt but not p70 S6K signaling by IGF-1 resulted in the inhibition of caspase-3 endogenous substrate poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) degradation and apoptosis. The overexpression of CA-Akt in lens epithelial cells inhibited PARP breakdown and suppressed apoptosis. Inhibition of p70 S6K activation by rapamycin blocked IGF-1-promoted lens epithelial cell proliferation but not the cell-survival effect. CONCLUSIONS: These studies demonstrated a role for IGF-1 in the prevention of the lens epithelial cell apoptosis process. Furthermore, these studies indicated that anti-apoptotic and proliferative signals from IGF-1 bifurcate downstream of PI-3K. Whereas IGF-1-mediated PI-3K/Akt signaling plays a pivotal role in cell survival by inactivating proapoptotic Bad protein and suppressing caspase activation, its stimulation of the PI-3K/p70 S6K cascade promotes proliferation.     

Kruppel样因子6抑制人晶状体上皮细胞增生的研究

背景 研究表明,Kruppel样因子6（KLF6）与生长发育、细胞分化、增生、凋亡、血管生成及组织修复等生理或病理过程有关.在眼科领域,关于人晶状体上皮细胞（LECs）中KLF6蛋白表达水平及KLF6对LECs增生的影响报道较少. 目的 探讨KLF6对LECs株（HLE-B3）增生的抑制作用. 方法 首先用逆转录PCR（RT-PCR）法构建真核表达质粒pEGFP-C2-KLF6,并用双酶切法和PCR法对表达质粒进行鉴定.用含体积分数10％胎牛血清的低糖DMEM对HLE-B3进行培养和传代,按照干预方法的不同将培养的HLE-B3分成4个组,各组均给予KLE-B3转染试剂,空白对照组不加入任何外源质粒及胰岛素样生长因子-1（IGF-1）;单纯IGF-1刺激组仅给予IGF-1刺激;空质粒转染＋IGF-1组加入pEGFP-C2质粒空载体,同时给予IGF-1刺激;pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组加入pEGFP-C2-KLF6真核表达质粒,且给予IGF-1刺激.细胞干预24 h后,采用水溶性四唑盐-1（WST-1）实验检测各组细胞的吸光度（A450）值;采用Western blot法测定各组细胞中KLF6蛋白的表达水平.以1＆#215;104个/片的密度将HLE-B3细胞爬片培养24 h,并分别将0、0.10、0.25 μg pEGFP-C2-KLF6转染到各组铺片细胞中,用终质量浓度为50 μg/L的IGF-1刺激24 h,然后应用免疫细胞化学技术检测各组细胞中Ki-67蛋白的相对表达量;采用荧光半定量PCR法检测各组细胞中Ki-67 mRNA的表达变化.结果 扩增得到的PCR产物反应条带与KLF-6基因长度相符,PCR和EcoR I、Sal I限制性内切酶双酶切法鉴定条带大小与预期相符,成功构建pEGFP-C2-KLF6真核表达质粒.WST-1实验显示空白对照组、单纯IGF-1刺激组、空质粒转染＋IGF-1组和pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组细胞A值分别为0.86±0.00、2.10±0.01、2.24±0.12和1.06±0.02,4个组间差异有统计学意义（F=38.322,P＜0.05）,其中pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组A值明显低于单纯IGF-1刺激组和空质粒转染＋IGF-1组,差异均有统计学意义（q=6.42、7.31,P＜0.05）.Western blot法检测显示,4个组间细胞中KLF6蛋白相对表达量的差异有统计学意义（F=591.858,P＜0.05）,pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组KLF6蛋白相对表达量分别是空白对照组、单纯IGF-1刺激组和空质粒转染＋IGF-1组的1.47、2.04、3.27倍.Ki-67蛋白在pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组细胞中的表达强度随质粒转染剂量的增加而逐渐减弱,0.10 μg和0.25 μg pEGFP-C2-KLF6转染后细胞中Ki-67 mRNA相对表达值分别为0.15±0.08和0.11±0.03,明显低于0μg pEGFP-C2-KLF6转染的细胞0.77±0.12,组间的总体差异有统计学意义（F=54.825,P＜0.05）. 结论 KLF-6能够抑制IGF-1诱导的HLE-B3的增生,是HLE-B3细胞增生的调控因子.     

自噬激活剂雷帕霉素对A2E诱导视网膜色素上皮细胞自噬调节的影响

目的 探讨自噬激活剂雷帕霉素对N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2E)诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞自噬调节的影响。方法 取人RPE细胞(ARPE-19细胞系)进行培养。将细胞分为4组,其中,对照组：使用DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;A2E组：使用含20μmol·L^-1 A2E的DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;雷帕霉素组：使用含100 nmol·L^-1雷帕霉素的DMEM-F12完全培养基预处理细胞1 h后,再用DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;雷帕霉素联合A2E组：使用100 nmol·L^-1雷帕霉素预处理细胞1 h后,再用含20μmol·L^-1 A2E的DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞。使用CCK-8法检测各组细胞增殖情况,Procarta细胞因子分析试剂盒检测各组细胞培养上清液中细胞因子表达情况。透射电镜观察各组细胞超微结构,Western blot法检测各组细胞自噬相关蛋白Beclin-1和P62的表达,免疫荧光染色法检测...