岩藻糖基化抗原对卵巢癌细胞增殖信号通路PI3K/Akt的影响

目的:探讨岩藻糖基化抗原对人卵巢癌细胞系RMG-I增殖的影响,初步探讨其与增殖信号通路磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)的关系。方法:观察PI3K/Akt通路抑制剂LY294002对岩藻糖基化抗原致卵巢癌细胞增殖的影响,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测岩藻糖基化抗原对细胞增殖的增强情况;Western blot观察RMG-I的Akt磷酸化蛋白表达。结果:α1,2-FT基因转染后细胞中Lewis(y)抗原含量明显增高。随着Lewis(y)含量的增加,RMG-I细胞增殖明显加快。Lewis(y)高表达卵巢癌细胞中磷酸化Akt的表达水平明显增高。PI3K抑制剂LY294002显著抑制Lewis(y)高表达卵巢癌细胞的增殖。抗Lewis(y)抗体和LY294002不仅降低了转染前后细胞中磷酸化Akt的表达水平,还消除了存在于细胞间的高低差别。结论:过表达的Lewis(y)抗原通过激活PI3K/Akt信号转导通路促进卵巢癌RMG-I细胞的增殖。抑制Lewis(y)抗原表达可能是一种治疗Lewis(y)高表达肿瘤的新方法。     

Lewis y抗原对人卵巢癌细胞RMG-Ⅰ裸鼠移植瘤p-Akt蛋白表达的影响

目的:探讨α1,2-岩藻糖转移酶基因转染对人卵巢癌细胞株RMG-I裸鼠移植瘤中磷酸化Akt(p-Akt)蛋白表达的影响。方法:利用已经建立的Lewis y抗原稳定高表达的卵巢癌细胞株RMG-I-H建立裸鼠移植瘤模型,利用免疫组织化学染色法检测基因转染前后裸鼠移植瘤组织中Lewis y抗原及p-Akt蛋白的表达。结果:基因转染后的裸鼠移植瘤组织细胞表面Lewis y抗原及p-Akt蛋白的表达均明显增加,转染组与非转染组之间差异有统计学意义(P<0.05)。结论:Lewis y抗原明显促进卵巢癌细胞株RMG-I裸鼠移植瘤p-Akt蛋白的表达。     

计算机辅助设计HER2／neu酪氨酸激酶小分子抑制剂人生物活性研究

目的：用计算机辅助设计法寻找HER2／neu受体酪氨酸激酶小分子抑制剂。方法：用MODERLAR软件模拟出HER2／neu和EGFR受体酪氨酸激酶的三维（three-dimensional,3D)空间结构;根据HER2／neu酪氨酸激酶ATP结合区的空间结构,搜索数据库,找出候选化合物;用Western blot方法检测化合物对HER2／neu受体酪氨酸激酶磷酸化的影响;MTT法检测细胞增殖抑制作用。结果：比较HER2／neu和EGFR（靶蛋白）与胰岛素受体酪氨酸激酶、FGR1受体酪氨酸激酶和Src酪氨酸激酶（模板蛋白）的氨基酸序列发现有35％－41％的相同和52％－55％的相似,用MODELLER程序模拟出HER2／neu和EGFR激酶区域的3D结构,根据HER2／neu受体氨酸激酶结构模型,3D数据库的搜索,获得潜在HER2／neu酪氨酸激酶抑制化合物,经筛选、优化发现ST2325对HER2／neu磷酸化有明显的抑制作用,其IC50值为6．6μmol／L,且抑制作用是可逆的,对EGFR受体磷酸化没有抑制作用。STS2325对HER2／neu受体表达没有影响。ST2325对HER2／neu过表达的肿瘤细胞MDA－MB－453ml的抑制作用更强,而对EGFR过表达的肿瘤细胞MDA－MB－468抑制作用相对较弱,其IC50值分别为29．05μmol/L和60．40μmol/L。结论：其于HER2／neu的结构设计,筛选出对HER2／neu酪氨酸激酶有明显选择性抑制作用的ST2325。     

Lewisy抗原对人卵巢癌细胞RMG—I裸鼠移植瘤P—Akt蛋白表达的影响

目的：探讨α1,2-岩藻糖转移酶基因转染对人卵巢癌细胞株RMG—I裸鼠移植瘤中磷酸化Akt（P—Akt）蛋白表达的影响。方法：利用已经建立的Lewis y抗原稳定高表达的卵巢癌细胞株RMG—I—H建立裸鼠移植瘤模型,利用免疫组织化学染色法检测基因转染前后裸鼠移植瘤组织中LewisY抗原及P—Akt蛋白的表达。结果：基因转染后的裸鼠移植瘤组织细胞表面LewisY抗原及P—Akt蛋白的表达均明显增加,转染组与非转染组之间差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：Lewis y抗原明显促进卵巢癌细胞株RMG—I裸鼠移植瘤P—Akt蛋白的表达。     

计算机辅助设计HER2/neu酪氨酸激酶小分子抑制剂及其生物活性研究

目的：用计算机辅助设计法寻找HER2/neu受体酪氨酸激酶小分子抑制剂。方法：用MODERLAR软件模拟出HER2/neu和EGFR受体酪氨酸激酶的三维(three dimensional,3D)空间结构;根据HER2/neu酪氨酸激酶ATP结合区的空间结构,搜索数据库,找出候选化合物;用Westernblot方法检测化合物对HER2/neu受体酪氨酸激酶磷酸化的影响;MTT法检测细胞增殖抑制作用。结果：比较HER2/neu和EGFR（靶蛋白）与胰岛素受体酪氨酸激酶、FGFR1受体酪氨酸激酶和Src酪氨酸激酶（模板蛋白）的氨基酸序列发现有35％～41％的相同和52％～55％的相似,用MODELLER程序模拟出HER2/neu和EGFR激酶区域的3D结构。根据HER2/neu受体酪氨酸激酶结构模型,3D数据库的搜索,获得潜在HER2/neu酪氨酸激酶抑制剂化合物,经筛选、优化发现ST2325对HER2/neu磷酸化有明显的抑制作用,其IC50值为6.6μmol/L,且抑制作用是可逆的,对EGFR受体磷酸化没有抑制作用。ST2325对HER2/neu受体表达没有影响。ST2325对HER2/neu过表达的肿瘤细胞MDA MB 453m1的抑制作用更强,而对EGFR过表达的肿瘤细胞MDA MB 468抑制作用相对较弱,其IC50值分别为29.05μmol/L和60.40μmol/L。结论：基于HER2/neu的结构设计,筛选出对HER2/neu酪氨酸激酶有明显选择性抑制作用的ST2325。     

HER2/neu过表达通过PI3K/Akt通路对乳腺癌细胞MCF7中p53基因表达及细胞生长和放疗敏感性的影响

目的 研究HER2／neu基因过表达通过磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)通路对乳腺癌细胞MCF7野生型p53基因表达、细胞增殖及对γ射线照射敏感性的影响。方法 以脂质体介导的HER2／neu基因转染MCF7细胞,用G418筛选阳性克隆。通过Western blot鉴定HER2／neu蛋白的表达,并检测p53、信号转导分子Akt和p-Akt蛋白含量的变化及PI3K通路抑制剂LY294002对上述蛋白表达水平的影响。以MTT法检测细胞增殖以及细胞对γ射线照射的敏感性。结果 共获得18个稳定转染HER2／neu基因的阳性克隆,其中1个克隆有HER2／neu基因过表达。过表达HER2／neu的MCF7细胞p-Akt蛋白含量升高,p53蛋白含量低于对照组细胞,LY294002能够抑制p-Akt蛋白和p53蛋白的变化。同时,过表达HER2／neu基因的MCF7细胞生长速度高于对照组细胞,对γ射线照射治疗的敏感性降低,而LY294002能够抑制细胞生长并增强放射治疗的敏感性。结论 MCF7细胞中HER2／neu基因的过表达,能够通过激活PI3K通路导致野生型p53蛋白含量减少、细胞增殖加快及放疗的敏感性降低,这可能是某些p53蛋白为野生型的肿瘤患者对治疗产生抗性的原因。     

Lewis y抗原促进卵巢癌细胞RMG-I血管内皮生长因子受体的表达

目的:探讨α1,2-岩藻糖转移酶(α1,2-fucosyltransferase,α1,2-FT)基因转染对卵巢癌细胞系RMG-I血管内皮生长因子受体(VEGFR)的影响.方法:利用已经建立的α1,2-岩藻糖转移酶及Lewis y稳定高表达的RMG-I-H细胞系、裸鼠移植瘤模型,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)测定基因转染前后细胞中VEGFR mRNA的变化,采用免疫组织化学法测定基因转染前后细胞及裸鼠移植瘤组织中VEGFR蛋白的变化.结果:基因转染后细胞中KDR mRNA表达明显增高(P<0.01),细胞、裸鼠移植瘤组织中KDR蛋白表达也明显增高,差异有统计学意义(P<0.01).结论:Lewis y抗原可能通过VEGF的自分泌和旁分泌途径引起KDR受体数目增多,从而促进肿瘤血管生成,介导卵巢癌的生长、侵袭、转移和耐药等生物学行为.     

丁酸钠对前列腺癌LNCaP细胞HER-2信号通路的影响

 目的 研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠对前列腺癌LNCaP细胞HER 2信号通路的影响，探讨其抗肿瘤作用的分子机制。方法 四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测药物对肿瘤细胞增殖的影响；hoechst 33342染色观察细胞凋亡的形态学变化，Western blot检测凋亡标志蛋白、HER2/ neu、Phos Akt、Phos Erk等信号蛋白的表达。结果 丁酸钠能够有效抑制LNCaP细胞的增殖并诱导细胞凋亡，半效杀伤剂量（EC50）为5.6mmol/L；药物能够抑制HER 2基因的转录和蛋白的表达，并抑制下游信号通路中MAPK和AKT的活化。结论 丁酸钠能够阻断对前列腺癌细胞生长具有重要作用的HER 2信号通路，从而对肿瘤细胞发挥抑制作用。     

腺病毒E1A下调HER2/neu原癌基因表达及其抗瘤效应研究

目的　研究腺病毒E1A基因对HER2 /neu高表达肿瘤细胞生长的抑制作用及增强其化疗敏感性的作用。方法　以腺病毒Ⅴ型为载体 ,经体、内外对HER2 /neu高表达及低表达的肿瘤细胞株转染腺病毒E1A基因后 ,观察E1A基因对肿瘤细胞生长抑制作用 ;用MTT法检测E1A增强肿瘤细胞化疗敏感性作用。结果　E1A能显著抑制HER2 /neu高表达的肿瘤细胞在体内外的生长 ,延长荷瘤裸鼠的生存期。免疫印迹及免疫组织化学分析显示 ,转染E1A的HER2 /neu高表达肿瘤细胞 ,其HER2 /neu基因产物p185蛋白表达明显降低 ;经AdE1A 处理的HER2 /neu高表达的乳腺癌细胞株能明显增强对TaxotereTM的化疗敏感性。结论　E1A通过下调HER2 /neu原癌基因的表达 ,抑制HER2 /neu高表达的肿瘤细胞生长 ,增强肿瘤细胞对化疗药的敏感性。     

miR-581调控FOXO1对卵巢癌SKOV3细胞自噬的影响

目的 探讨miR-581对卵巢癌SKOV3细胞自噬的影响及作用机制。方法 将miR-581 mimics和miR-581 NC转染到卵巢癌SKOV3细胞中,实时荧光定量PCR法（qRT-PCR）检测转染效率;转染成功后,Western blot检测转染后卵巢癌SKOV3细胞中自噬相关蛋白的表达水平;TargetScanHuman数据库预测miR-581靶基因,Western blot验证miR-581与靶基因的作用。结果 过表达miR-581后可显著抑制自噬相关蛋白LC3Ⅱ和Beclin1的表达（P<0.01）;miR-581可负向调控FOXO1的表达（P<0.01）;FOXO1促进卵巢癌SKOV3细胞自噬（P<0.05）。结论 miR-581通过调控FOXO1的表达影响卵巢癌SKOV3细胞自噬。     

HER2基因转染MCF-7细胞及生物学特性观察

目的:建立共表达HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)基因和ER(Estrogen Receptor)基因的细胞模型,并观察转染细胞的生物学活性.方法:构建真核表达载体pcDNA3.1-HER2,利用脂质体介导将其转染ER阳性的乳腺癌MCF-7细胞,经G418筛选阳性克隆.用RT-PCR、Western blot及免疫细胞化学等方法检测HER2基因在MCF-7细胞中的稳定表达情况,并通过MTT法和肿瘤细胞侵袭实验,观察转染细胞的生物学活性.结果:在mRNA和蛋白水平证实,转染细胞内有HER2基因的高表达,转染后细胞的增殖能力和侵袭能力明显增强.结论:构建含HER2基因的重组载体,导入乳腺癌MCF-7细胞后,获得生物学活性稳定的HER2基因和ER基因高表达的细胞模型,为进一步研究奠定了基础.     

抗HER2/neu胞外区的特异性抗体对乳腺癌细胞株酪氨酸磷酸化及细胞增殖的影响

本文运用Westerm blot及抗体介导的特异性细胞增殖试验观察抗HER2/neu胞外区不同表位的单克隆抗体对SKBR3乳腺癌细胞株酪氨酸磷酸化及细胞增殖的影响.实验结果发现单抗c-neu-5对SKBR3细胞P185蛋白酪氨酸磷酸化有明显促进作用,而对SKBR3细胞增殖作用不明显;单抗c-neu-2对SKBR3细胞酪氨酸磷酸化及细胞增殖均有明显抑制作用,对细胞增殖的抑制率可达49.8%.     

原癌基因HER2/neu表达产物p185蛋白免疫原性研究

p185蛋白是由原癌基因HER2/neu编码的跨膜糖蛋白,在许多肿瘤患者体内高表达,与疾病的预后密切相关,表达增高预后较差.已从肿瘤患者体内分离出识别p185蛋白及多肽CTL和CD4~ 的T细胞,也证实患者血清中存在抗p185抗体,p185作为肿瘤抗原已引起广泛关注.为进一步研究将该蛋白作为瘤苗应用于临床可行性,我们用表达p185蛋白的HER2/neu转基因3T3-HER2/neu细胞裂解物免疫BABL/c小鼠,经3次免疫后,免疫鼠脾细胞对表达p185蛋白3T3HER2/neu细胞呈现较强的增殖反应(平均刺激指数分别为SI=3.15±1.88),而对未转染HER2/neul基因的3T3细胞的应答较弱(SI=1.14±0.97).并检测到1号免疫鼠脾细胞对3T3-HER2/neu细胞有特异杀伤.免疫鼠血清中出现高水平的抗P185抗体(OD均值=1.02±0.16),较正常对照组(OD     

HER2/neu在肿瘤中研究进展及抗HER2/neu治疗

HER2/neu是酪氨酸受体家族成员之一,主要通过Ras/MAPK、PI3K/Akt等通路参与细胞的增殖及抗凋亡,通过促进基质金属蛋白酶(MMPs)分泌、激活VEGF的启动子,同时激活丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)及核因子KB(NF-KB)等,促进肿瘤的浸润及转移。HER2/neu蛋白的过表达和基因扩增存在于多种肿瘤中,包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、消化道肿瘤等。关系到肿瘤的发生、发展、转移、治疗及预后。目前抗HER2/neu治疗药物大体可分为4类:作用于受体细胞外区域的抗体、小分子酪氨酸激酶抑制剂、抗体-细胞毒分子耦合剂和伴侣蛋白拮抗剂。现对其与肿瘤的研究现状及抗HER2/neu的治疗作一综述。     

HER2/neu在肿瘤中研究进展及抗HER2/neu治疗

HER2/neu是酪氨酸受体家族成员之一,主要通过Ras/MAPK、PI3K/Akt等通路参与细胞的增殖及抗凋亡,通过促进基质金属蛋白酶（MMPs）分泌、激活VEGF的启动子,同时激活丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT）及核因子KB（NF-KB）等,促进肿瘤的浸润及转移。HER2/neu蛋白的过表达和基因扩增存在于多种肿瘤中,包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、消化道肿瘤等。关系到肿瘤的发生、发展、转移、治疗及预后。目前抗HER2/neu治疗药物大体可分为4类：作用于受体细胞外区域的抗体、小分子酪氨酸激酶抑制剂、抗体-细胞毒分子耦合剂和伴侣蛋白拮抗剂。现对其与肿瘤的研究现状及抗HER2/neu的治疗作一综述。     

siRNA抑制HER2/neu过表达肺腺癌细胞生长和增殖

背景与目的：30％NSCLC存在HER2／neu过表达，与肿瘤发生、转移、肿瘤血管形成、抗凋亡及化疗耐药等有关。本文通过RNA干涉抑制肺腺癌细胞SPC—A-1 HER2／neu过表达，观察肿瘤细胞周期、增殖及集落形成能力的变化。方法：构建针对HER2／neu的siRNA重组质粒，稳定转染SPC—A-1，通过RT—PCR和Western Blot检测HER2／neu表达；FCM分析细胞周期；MTT法观察细胞增殖，绘制细胞生长曲线；平板集落形成实验检测肿瘤细胞的集落形成能力。结果：成功构建了HER2／neu的siRNA重组质粒，稳定转染靶细胞后可显著降低HER2／neu表达；与亲代细胞相比，G0／G1期细胞增加17．1％，S期细胞减少12．8％；细胞生长速度减慢，集落S1抑制率达到49．0％。结论：针对HER2／neu的siRNA可以显著降低肺腺癌细胞过表达HER2／neu，肿瘤细胞阻滞于G0／G1期，造成细胞增殖减慢，集落形成能力明显下降。因此，siRNA对过表达HER2／neu肺癌的治疗具有潜在应用价值。     

变异型EBER2通过抑制PKR通路增强鼻咽癌细胞抗凋亡能力

目的：前期研究发现变异型EB病毒编码小RNA 2（EBER2）基因EB-8m可能与鼻咽癌（NPC）相关,本研究旨在探讨变异型EBER2是否通过增强对RNA激活蛋白激酶（PKR）的抑制作用从而提高NPC细胞的抗凋亡能力。方法：以野生型和EB-8m变异型EBER2基因稳定转染的EB病毒阴性NPC细胞系HONE1和CNE1为研究对象,以未转染EBER2基因细胞为对照,分别用10 000 IU/mLα-干扰素（IFN-α）和2μg/mL顺铂诱导凋亡后以流式细胞术检测细胞凋亡;采用Western blot检测IFN-α诱导凋亡细胞中PKR及下游eIF2α和c-Jun的磷酸化蛋白及Bcl-2蛋白表达水平。对EBER2基因转染细胞进行RNA和PKR蛋白免疫共沉淀,检测共沉淀产物中EBER2富集倍数。结果：EBER2基因转染细胞的凋亡率低于未转染EBER2基因细胞（P < 0.05或P < 0.01）,且变异型的细胞凋亡率低于野生型（P < 0.05）。与未转染EBER2基因细胞比较,EBER2转染细胞中磷酸化PKR、eIF2α和c-Jun减少,Bcl-2表达升高,且磷酸化PKR在变异型转染HONE1和CNE1细胞中的水平低于野生型转染细胞,磷酸化eIF2α在变异型转染HONE1细胞中的水平亦低于野生型转染细胞,差异均有统计学意义（P均 < 0.05）。EBER2基因转染细胞RNA和PKR免疫共沉淀产物中可检测到EBER2,且变异型的富集倍数高于野生型（P < 0.05）。结论：EB-8m变异型EBER2可能增强EBER2对PKR的结合作用,同时抑制eIF2α和c-Jun磷酸化并上调Bcl-2表达,进而增强NPC细胞抗凋亡能力。     

TSPAN8对肺癌A549细胞体外增殖的影响及机制

目的：研究TSPAN8基因对A549肺癌细胞增殖的促进作用及其机制。方法：选取A549为研究对象,MTT法检测转染TSPAN8质粒对细胞增殖的作用;采用流式细胞仪技术检测转染TSPAN8质粒对细胞周期的影响;Real－time PCR和免疫印迹法检测TSPAN8基因对Rb1、E2F1、C－myc、CDK4、Cyclin D1以及ERK信号分子蛋白活性的影响。结果：TSPAN8基因能明显促进A549肺癌细胞的体外增殖能力;Real－time PCR和Western blot显示,转染TSPAN8基因后,E2F1、C－myc、CDK4、Cyclin D1的mRNA和蛋白表达上调,而Rb1的表达明显下调,而且p－ERK磷酸化水平亦明显上升。结论：TSPAN8基因能促进A549肺癌细胞的增殖,其作用可能与调控E2F1、C－myc、CDK4、Cyclin D1基因的表达,以及活化ERK相关信号通路相关。     

重组抗HER2融合蛋白基因ScFv/tBid对骨肉瘤E10细胞的促凋亡作用

目的：构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv/tBid,并探讨其对骨肉瘤E10细胞的促调亡作用。方法：通过间接免疫荧光染色、流式细胞仪（FCM）检测E10细胞膜表面HER2的表达。将抗HER2单链抗体基因e23sFv与铜绿假单胞菌外毒素PE的转膜结构域基因（PEⅡ）和tBid基因连接,构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv/tBid,将其克隆入真核表达载体pCMV中构建重组pCMV-ScFv/tBid载体,转染骨肉瘤E10细胞。间接免疫荧光法检测目的蛋白表达和细胞形态学变化,Annexin V染色流式细胞术及TUNEL法检测E10细胞的凋亡情况。结果：流式细胞仪检测到E10细胞膜表面有HER2的表达。成功构建重组融合蛋白基因质粒pCMV-ScFv/tBid。重组质粒转染E10细胞后,间接免疫荧光双标记染色检测到E10细胞中tBid的过表达;细胞色素C在细胞质中出现;细胞出现明显的固缩、核浓缩等形态特征。Annexin V染色后流式细胞仪检测可见实验组细胞凋亡率较对照组明显升高（16.1% vs 4.5%）;TUNEL染色显示,E10细胞出现典型的凋亡特征。结论：重组抗HER2融合蛋白基因ScFv/tBid可以在转染的骨肉瘤E10细胞中表达,并诱导骨肉瘤细胞发生凋亡。     

SUCI02选择性抑制HER-2/neu受体酪氨酸激酶磷酸化及其对HER-2/neu过表达乳腺癌细胞生长的影响

背景与目的：HER-2／neu受体过度表达与肿瘤的发生发展、对化疗的敏感性以及患者预后有关;我们通过大量筛选,发现SUCI02[N-(4-乙氧苯基)-2-羟基酸胺]能抑制HER2／neu受体酪氨酸激酶磷酸化。本研究拟探讨SUCI02对HER-2／nell过度表达的肿瘤细胞生长的影响。方法：用免疫沉淀、免疫印迹法检测：HER-2／neu受体酪氨酸激酶磷酸化、酪氨酸激酶蛋白水平的变化;MTT法检测SUCI02对乳腺癌细胞的抑制作用。结果：SUCI02能抑制HER-2／neu受体的自身磷酸化,在乳腺癌MDA—MB．453m1细胞中,SUCI02对HER-2／neu受体自身磷酸化的IC50为4．34μg／ml,对HER-2／neu的表达没有任何影响。在用SUCI02处理MDA-MB-453ml细胞30min后,用培养液洗掉药物,继续培养不同时间,结果可见洗掉药物后30min,SUCI02对HER-2／neu受体磷酸化的抑制就开始恢复。SUCI02处理MDA-MB-453ml细胞后其下游靶分子MAPK和AKT激活明显受抑制,呈现剂量依赖性。SUCI02对EGFR受体酪氨酸磷酸化在最高剂量用到40μg／ml下没有明显的抑制作用。应用MTT法检测了SUCI02对过度表达HER-2／neu的MDA-MB-453ml细胞的生长抑制作用,同时应用过表达EGFR的乳腺癌MDA—MB-468细胞作为对照,结果可见SUCI02对HER-2／neu过表达的肿瘤细胞相对于过表达EGFR的肿瘤细胞有更明显的抑制作用。结论：SUCI02选择性抑制HER-2／neu受体酪氨酸激酶磷酸化,阻断其下游信号途径,对过度表达HER-2／neu的肿瘤细胞具有更强的生长抑制作用。