FOXK1对肝癌高转移细胞系Huh7侵袭和迁移能力的影响

目的 探讨叉头框转录因子1(FOXK1)对肝癌高转移细胞Huh7侵袭和迁移能力的影响。方法 采用实时定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测40例肝癌组织及其癌旁正常组织FOXK1 mRNA的表达,qRT-PCR和Western blot检测正常肝细胞HL7702、肝癌细胞BEL7402和肝癌高转移细胞Huh7中FOXK1 mRNA和蛋白的表达。小RNA干扰技术下调FOXK1表达后,qRT-PCR和Western blot检测肝癌高转移细胞Huh7 FOXK1 mRNA和蛋白的表达,Transwell实验检测其侵袭和迁移能力。 结果 qRT-PCR检测结果显示,肝癌组织中FOXK1 mRNA的表达高于癌旁正常组织(2.87±0.21 vs 1.35±0.11,P=0.004);qRT-PCR和Western blot检测结果显示,相比正常肝细胞HL7702,肝癌细胞BEL7402和肝癌高转移细胞Huh7中FOXK1 mRNA和蛋白表达升高(P<0.001)。下调FOXK1表达后,肝癌高转移细胞Huh7中FOXK1 mRNA和蛋白表达显著下调(P<0.01),侵袭和迁移细胞数目明显减少(P<0.01)。结论 下调FOXK1表达能抑制肝癌高转移细胞Huh7侵袭和迁移能力。     

SAMHD1通过调控p27表达抑制肝细胞癌细胞增殖的研究

背景与目的：不育α基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1（sterile alpha motif and histidine/aspartic acid domain-containing protein 1,SAMHD1）具有抑制多种肿瘤细胞生长的作用,但其调节肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）细胞增殖的作用及机制尚未见报道。探究SAMHD1调控p27的表达对HCC细胞Huh7的增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法：首先通过蛋白质印迹法（Western blot）检测正常肝细胞和不同类型HCC细胞中SAMHD1的表达情况。利用基因修饰技术构建过表达SAMHD1、dNTP酶活性位点突变体（SAMHD1-D207N）和磷酸化位点突变体（SAMHD1-T592E）的重组质粒,然后利用四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法检测过表达SAMHD1及其突变体或siRNA干扰沉默SAMHD1对HCC细胞增殖的影响,采用流式细胞术检测细胞周期与细胞凋亡情况。在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库中分析SAMHD1和p27表达的相关性。结果：HCC细胞中SAMHD1表达上调,过表达SAMHD1、SAMHD1-D207N和SAMHD1-T592E可以抑制Huh7细胞增殖,细胞周期停滞在G ₁ /G ₀ 期;相反,干扰SAMHD1后细胞增殖加快,细胞周期停滞在G ₂ /M期。机制研究表明,SAMHD1上调细胞周期蛋白激酶抑制因子p27的表达。在HCC组织中,p27的表达与SAMHD1表达呈正相关。结论：过表达SAMHD1可以上调p27的表达,导致细胞周期停滞在G ₁ /G ₀ 期,从而抑制HCC细胞增殖,这种抑制作用不依赖于其dNTP酶活性和磷酸化修饰。     

雪灵芝水提物对人胃癌MGC-803细胞增殖及细胞周期的影响

目的探讨雪灵芝水溶性提取物(arenaria kansuensis aqueous extract,AKAE)对人胃癌细胞株MGC-803细胞增殖及细胞周期的影响。方法体外培养的MGC-803细胞经不同浓度AKAE处理,采用MTT法检测受试细胞增殖水平;应用流式细胞术检测AKAE处理12 h后各组细胞的细胞周期;Western blot检测不同浓度、不同时间AKAE处理组MGC-803细胞中cyclin D1蛋白表达水平;实时定量 PCR检测各组MGC-803细胞中cyclin D1、p16和p21基因的mRNA相对表达量。结果AKAE对体外培养的MGC-803细胞增殖具有浓度依赖性抑制作用（P<0.05）,IC₅₀为(0.134±0.005)mg/ml;经AKAE处理12 h,0.8 mg/ml组MGC-803细胞的 G₁期细胞比例高于对照组、S期细胞比例低于对照组（P<0.05）;(0.2～0.8) mg/ml浓度的AKAE处理,对MGC-803细胞中cyclin D1的蛋白及mRNA表达具有明显抑制作用（P<0.05）;AKAE促进MGC-803细胞中p16、p21基因mRNA 表达,0.2 mg/ml处理组p16、p21 mRNA相对表达量分别为对照组的3.3倍和18.5倍。结论雪灵芝水提物(AKAE)对MGC-803细胞增殖具有抑制作用,其机制与G₁期阻滞和对G₁期相关因子表达的影响有关。     

survivin基因沉默对宫颈癌XB1702细胞增殖和对吉非替尼敏感度的影响

目的研究survivin基因沉默对人宫颈癌XB1702细胞增殖和对化疗药物吉非替尼敏感度的影响。方法 设计合成survivin的siRNA序列,LipofectamineTM2000 转染入XB1702细胞。采用RT-PCR和Western blot检测survivin在干扰后mRNA和蛋白的表达情况,利用流式细胞仪检测细胞周期。通过MTT法和细胞克隆形成试验法观察survivin基因沉默后XB1702细胞对吉非替尼的敏感度。结果 Survivin基因沉默48 h后,XB1702细胞的survivin基因和蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞周期被阻滞在G₀/G₁期,S期细胞数减少;差异有统计学意义(P<0.05)。survivin基因沉默组细胞对吉非替尼的敏感度显著增强。结论 survivin特异性siRNA能显著沉默XB1702细胞survivin基因,抑制细胞增殖,并增强XB1702细胞对吉非替尼的敏感度。     

紫杉醇顺铂对HCC1937人乳腺癌细胞MAPK信号通路影响

目的:研究紫杉醇、顺铂对BRCA1基因缺陷型三阴性乳腺癌细胞HCC1937的增殖抑制作用及与MAPK信号通路的关系。方法:采用CCK-8试剂盒检测紫杉醇、顺铂分别对HCC1937细胞、MCF-7细胞的50%抑制浓度(IC₅₀);采用流式细胞仪和Western blot分别检测两药作用HCC1937细胞48 h后的细胞周期和MAPK通路蛋白表达状况。结果:HCC1937细胞(IC₅₀ 6～9μg/mL)对顺铂敏感性显著高于MCF-7细胞(IC₅₀ 18～20μg/mL)（P<0.01）;而HCC1937细胞(IC₅₀ 3～4.6μg/mL)对紫杉醇的敏感性则明显低于MCF-7细胞(IC₅₀ 0.12～0.3μg/mL)（P<0.01）。紫杉醇使HCC1937细胞阻断在G₂～M期,呈剂量-效应趋势,顺铂使其阻断在G₀/G₁期;紫杉醇、顺铂作用HCC1937细胞48 h后,P-JNK和P-P38蛋白表达显著增加,顺铂组P-ERK蛋白表达较对照组明显降低。结论:1)三阴性乳腺癌细胞HCC1937对顺铂的敏感性明显优于紫杉醇;2)紫杉醇、顺铂皆可激活HCC1937细胞JNK/SAPK、P38通路,同时不同浓度的顺铂可以抑制ERK通路激活。     

小干扰RNA阻断周期蛋白依赖激酶4对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响

背景与目的：细胞周期蛋白依赖激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)是调控细胞周期进程的重要激酶之一,有实验报道其在子宫内膜癌中呈高表达,但是其在子宫内膜癌细胞中的生物学功能及其可能机制还不十分明确。本研究旨在通过小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默CDK4表达,并检测其对人子宫内膜癌HEC-1B细胞生物学行为的影响及其可能机制。方法：将化学合成的CDK4-siRNA转染至HEC-1B细胞;实时荧光定量PCR法检测转染前后细胞中CDK4的mRNA表达量变化;Western blot检测转染前后细胞CDK4、视母细胞瘤基因(retinoblastoma gene,Rb)及其下游p-Rb的蛋白表达量的变化;分别采用CCK-8法、流式细胞仪、Transwell肿瘤细胞侵袭实验检测细胞增殖、周期、凋亡以及侵袭能力的变化。结果：转染后HEC-1B细胞中CDK4 mRNA及蛋白表达均明显下降(P<0.01);抑制CDK4表达后,抑制HEC-1B细胞的增殖及侵袭,转染si-CDK4组细胞发生侵袭数为(117±21)个,而转染si-control组及未处理组分别为(269±39)个和(262±35)个,差异具有统计学意义(P<0.01);细胞转染后早期凋亡率为(21.7±3.5)%,较未处理组［(12.4±2.1)%］和si-control组［(11.8±1.9)%］明显增加(P<0.01);细胞周期分布发生变化,G₁期比例增加(P<0.01),S期细胞比例降低(P<0.01);进一步的Western blot结果显示,抑制CDK4表达后,细胞内p-Rb表达下降,但是总Rb表达无明显变化。结论：针对CDK4基因的特异性小RNA干扰片段能够下调CDK4基因在子宫内膜癌细胞中的表达,抑制肿瘤生物学进程。     

布洛芬抑制人肝癌细胞BEL-7402生长及机制的初步研究

背景与目的：近来发现,临床上常用的非甾体类抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)可以降低多种癌症的发病率。布洛芬(ibuprofen)作为一种常用的NSAIDs,对肝癌是否具有抑制作用,国内外鲜有报道。本研究初步探讨布洛芬抑制肝癌细胞BEL-7402的作用,并研究其相关机制。方法：肝癌细胞BEL-7402分为对照组和不同浓度布洛芬处理组,药物处理0、24、48和72 h后用MTT法检测各组细胞增殖抑制率;流式细胞术检测各组细胞的周期分布;细胞分析仪检测各组细胞活力及细胞凋亡;蛋白[质]印迹(Western blot)检测各组细胞增殖性核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白(Cyclin D1)、B细胞淋巴瘤/白血病-2 (Bcl-2)和环氧合酶-2(COX-2)蛋白的表达;ELISA法检测细胞培养上清液中前列腺素E₂(PGE₂)蛋白表达水平。结果：布洛芬组中BEL-7402细胞增殖受到抑制,且抑制作用呈时间和剂量依赖性(P<0.05)。2.0 mmol/L布洛芬组48 h细胞活力明显低于对照组［(47.87±5.23)% vs (88.93±5.49)%］,G₀/G₁期细胞比例明显高于对照组［(80.04±3.61)%vs (62.36±8.33)%］,细胞早期凋亡率明显高于对照组［(36.65±10.07)% vs (9.81±6.80)%］,差异有统计学意义(P<0.05)。布洛芬作用于细胞48 h后,PCNA、Cyclin D1、Bcl-2以及COX-2蛋白表达与对照组相比显著减少(P<0.05);细胞培养上清液中PGE₂蛋白表达量与对照组［(23.98±4.89) ng/L vs (68.70±9.43) ng/L］相比,显著降低(P<0.01)。结论：布洛芬能够抑制肝癌细胞BEL-7402增殖与活力,阻滞细胞周期,促进细胞凋亡,其作用机制可能与抑制COX-2及PGE₂表达有关。     

siRNA下调LSD1基因对卵巢癌OVCAR-3细胞增殖和周期的影响

目的应用小分子干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）抑制赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1（lysine specific demethylase 1,LSD1）基因的表达,探讨其对卵巢癌OVCAR-3细胞增殖和生长周期的影响。方法采用脂质体介导法将LSD1-siRNA转染卵巢癌OVCAR-3细胞;实时荧光定量PCR（RFQ-PCR）和Western blot法检测基因的表达;MTT法检测细胞增殖能力;FCM分析细胞周期。结果成功转染LSD1-siRNA后,OVCAR-3细胞中LSD1 mRNA和蛋白表达均明显下降;细胞增殖明显抑制;G₂/M期细胞比例增加。结论 LSD1-siRNA可显著下调LSD1基因在卵巢癌OVCAR-3细胞中的表达水平,在一定程度上抑制卵巢癌细胞的增殖,导致细胞周期阻滞。     

Bmi-1-siRNA抑制肺腺癌SPC-A1细胞的增殖及其机制

背景与目的：Bmi-1(B-cell specific moloneymurine leukemiavirus insertion site 1)基因是多梳基因家族的重要成员之一,主要通过调控INK4a/ARF位点来调节细胞的增殖和衰老。本研究旨在探讨Bmi-1-siRNA对具有INK4a/ARF位点的肺腺癌SPC-A1细胞生长和增殖的影响,并探讨其作用机制。方法：①本实验选用已确定有效的siRNA序列进行病毒包装,构建反转录病毒si-Bmi-1 pSUPERretro-neo,然后感染到SPC-A1细胞中,建立稳定表达Bmi-1-siRNA的肺癌细胞株。②利用RT-PCR和蛋白质印迹法(Western blot)技术分析Bmi-1基因在Bmi-1-siRNA转染后SPC-A1细胞中表达情况。③利用台盼蓝拒染法、MTT法、平板克隆形成实验和裸鼠实验,分析Bmi-1-siRNA对SPC-A1细胞体内外增殖能力的影响。④利用流式细胞术分析SPC-A1各组细胞的周期分布。⑤利用Western blot法分析增殖通路相关分子：p16^INK4a、p53、Cyclin D1、PTEN和Ser473p-Akt等蛋白表达情况。结果：反转录病毒介导的Bmi-1-siRNA被转染后,有效抑制了SPC-A1细胞中Bmi-1基因的转录和表达,抑制了SPC-A1细胞的体内外增殖能力(P<0.01),并使转染组细胞阻滞在G₁期［(64.6±1.2)%,P<0.05］。沉默Bmi-1基因后,与对照组细胞相比,p16^INK4a、p53和Akt蛋白表达水平无明显变化(P>0.05),Cyclin D1和Ser473p-Akt表达水平下降(P<0.01),PTEN表达水平上调(P<0.01)。用PTEN抑制剂处理转染组细胞后,Bmi-1和Ser473p-Akt蛋白表达得以重塑。结论：Bmi-1-siRNA通过将肺腺癌SPC-A1细胞周期阻滞于G₁期来抑制肿瘤细胞增殖,这种抑制作用可能不依赖于p16^INK4a来调控Cyclin D1的表达,进而参与调控肿瘤细胞增殖。     

lncRNA BCAR4在肝癌细胞系中的表达及对增殖、凋亡和迁移的影响

目的:观察肝癌细胞系中长链非编码RNA BCAR4（lncRNA BCAR4）的表达,及对肝癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响,并探讨其机制。方法:采用荧光定量PCR技术（qRT-PCR）检测肝癌细胞系Huh7、HepG2、SMMC-7721和正常肝细胞系L02中lncRNA BCAR4的表达。将Huh7细胞系分为BCAR4-siRNA组、NC-siRNA组和Blank组,BCAR4-siRNA组和NC-siRNA组经LipofectamineTM 2000分别转染BCAR4-siRNA序列和NC-siRNA序列,Blank组以PBST为阴性对照。CCK-8法和流式细胞数测定细胞增殖和凋亡,细胞划痕实验测定迁移能力。Western blot测定细胞周期相关蛋白（Cyclin D1）和凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达。结果:肝癌细胞系Huh7、HepG2、SMMC-7721中lncRNA BCAR4的表达显著高于正常肝细胞系L02(P<0.05)。转染BCAR4-siRNA后,Huh7的lncRNA BCAR4表达下调（P<0.01）。CCK-8示:转染72 h及96 h后,BCAR4-siRNA组 vs NC-siRNA组的OD450 nm值分别为0.71±0.07 vs 0.92±0.10（P<0.05）及0.93±0.08 vs 1.37±0.11（P<0.01）。BCAR4-siRNA组和NC-siRNA组细胞凋亡率分别为（17.52±3.21）%和（4.69±1.56）%（P<0.01）。BCAR4-siRNA组细胞划痕愈合率为（19.65±2.41）%,显著低于NC-siRNA组的（47.50±5.88)%(P<0.05)。与NC-siRNA组比较,BCAR4-siRNA组Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达下调,分别为0.27±0.03 vs 1.0±0.05(P<0.01)、0.48±0.04 vs 1.0±0.04(P<0.05),Bax蛋白表达上调,为2.83±0.19 vs 1.0±0.03(P<0.01)。结论:lncRNA BCAR4高表达于肝癌细胞系,敲低lncRNA BCAR4的表达可抑制肝癌细胞增殖、迁移,并促进凋亡,其机制可能与Cyclin D1和Bcl-2蛋白下调表达,Bax蛋白表达上调表达有关。     

3D Organoid modelling of hepatoblast-like and mesenchymal-like hepatocellular carcinoma cell lines

Aim: We wished to establish 3D organoid-like hepatocellular carcinoma (HCC) models from HCC cell lines. Methods: Hep3B, Huh7, HepG2, SNU398, SNU449, and SNU475 ...     

miR-26b通过调节Notch1信号通路参与原发性肝细胞肝癌侵袭的机制研究

目的:探讨miR-26b参与原发性肝细胞肝癌（HCC）侵袭的机制。方法:在细胞培养液中培养人肝细胞系HL-7702和HCC细胞各系Hepb-3、HuH-7、MHCC97-L、MHCC97-H。实时荧光定量PCR法（qRT-PCR）检测miR-26b的表达水平；用miR-26b mimics、miR-26b inhibitors和Notch1-siRNA分别转染HCC细胞；MTT实验检测转染后HCC细胞的活力；采用Western blot检测Notch1受体蛋白表达水平的变化；Transwell小室测定不同处理后的HCC细胞的侵袭能力。结果:人正常肝细胞系HL-7702和HCC细胞系Hepb-3、HuH-7、MHCC97-L、MHCC97-H中的miR-26b相对表达含量随其侵袭和迁移能力的升高而依次下降；抑制miR-26b的表达，Notch1受体蛋白表达明显增高，而此时HCC细胞的侵袭性显著增强；相反，上调miR-26b的表达，Notch1受体蛋白表达明显降低，而HCC细胞侵袭性显著下降；miR-26b可能通过调控Notch1信号通路调节HCC细胞侵袭性。结论:miR-26b通过负调控Notch1信号通路抑制HCC细胞侵袭能力，为HCC侵袭的机制奠定了理论基础，miR-26b可能成为HCC治疗的新靶点。     

siRNA干扰MTH1基因对肝癌HepG2细胞凋亡和迁移的影响

目的 应用siRNA干扰技术抑制人肝细胞癌系HepG2细胞MTH1基因表达,并研究MTH1基因干扰后对HepG2细胞凋亡和迁移能力的影响。方法 设计并化学合成3对特异性MTH1-siRNA,采用阳离子脂质体法瞬间转染肝癌HepG2细胞,离体培养肝癌HepG2细胞,并设正常对照组、阴性对照组及MTH1-siRNA1、MTH1-siRNA2、MTH1-siRNA3转染组。采用蛋白印迹（Western blot）法检测转染MTH1-siRNA后HepG2细胞MTH1蛋白水平表达的变化,并筛选干扰效果最佳序列。运用流式细胞技术和划痕实验检测转染siRNA-MTH1后HepG2细胞凋亡、体外迁移能力的变化。结果 MTH1-siRNA3转染组干扰效果与正常组和阴性对照组相比效果具有统计学意义（P=0.002, P=0.005）。MTH1-siRNA3转染组细胞凋亡率高于正常组及阴性对照组,差异有统计学意义（P=0.012, P=0.013）;MTH1-siRNA3转染组细胞的划痕24、36 h愈合率均低于正常组和阴性对照组,差异有统计学意义（P=0.001, P=0.000）。结论 MTH1在肝癌细胞的凋亡及迁移中起重要作用,干扰MTH1的表达能促进肝癌细胞凋亡并降低肝癌细胞的迁移能力。     

过表达miR-7对结肠癌HCT-116细胞生物学行为的影响

 目的 探讨上调microRNA-7（miR-7）表达对结肠癌HCT-116细胞生物学行为的影响及可能机制。方法 HCT-116转染后分成miR-7 mimics组、Scramble（阴性对照）组和空白对照组。实时荧光定量PCR（RT-Fq-PCR）检测转染48 h后各组细胞中miR-7表达水平，CCK-8法检测转染72 h后各组细胞的增殖抑制情况，Transwell实验观察转染24 h后细胞侵袭能力，流式细胞仪行细胞周期和细胞凋亡检测。Western blot检测PI3K（p110）、p-Akt及p-mTOR的蛋白表达。结果 miR-7 mimics组miR-7表达水平明显上调，与其余两组比较差异有统计学意义（P<0.05）；与阴性对照组和空白对照组相比，miR-7 mimics组细胞增殖抑制率升高，侵袭能力降低，细胞周期分析提示G₀/G₁期的细胞比例增高，S期细胞明显减少，细胞凋亡率明显增加， 且PI 3K、p-Akt及p-mTOR的蛋白水平明显降低（P<0.05）。结论 上调结肠癌HCT-116细胞中miR-7表达能抑制肿瘤细胞的增殖与侵袭，其机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路有关。     

沉默Toll样受体4表达对肺腺癌A549细胞凋亡及细胞周期的影响

目的 探讨Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）对肺腺癌A549细胞凋亡及细胞周期的影响。方法 体外化学合成针对TLR4的小干扰RNA（TLR4-siRNA）,通过脂质体介导转染人肺腺癌A549细胞。采用Real-time PCR和流式细胞仪检测分析干扰后A549细胞中TLR4 mRNA及蛋白的表达情况。另外,采用流式细胞仪检测分析干扰72 h后细胞凋亡率和细胞周期的变化。结果 与对照组比较,转染TLR4-siRNA后,A549细胞中TLR4 mRNA及蛋白的表达显著下降（P<0.05）,细胞的凋亡率明显增加[（1.73 ± 0.32）% vs.（7.40 ± 0.75）%（P<0.01）],细胞周期出现G0/G1期停滞[（48.21 ± 1.15）%vs.（66.26 ± 2.45）%（P<0.05）],同时S期细胞比例明显减少[（34.25 ± 1.46）% vs.（22.63 ± 3.39）%（P<0.05）]。结论 TLR4-siRNA能有效沉默A549细胞中TLR4的表达,在促进细胞凋亡的同时能够影响细胞周期分布从而抑制肿瘤细胞的生长,特异性干预TLR4基因的表达有望成为治疗肺癌的一种新手段。