小鼠角膜上皮创伤再上皮化过程基本特征的动力学研究

目的 研究小鼠角膜上皮机械性创伤再上皮化过程炎性细胞迁移、血小板聚集的动力学特征.方法 计算小鼠角膜2 mm上皮缺损创面改变;免疫荧光染色观察角膜基底细胞分裂和中性粒细胞、血小板、γδT细胞及巨噬细胞迁移特征;电子显微镜观察角膜上皮细胞形态学、基质PMNs和角膜缘血小板的变化.结果 创伤后24 h基本再上皮化,96 h基底细胞恢复正常;伤后18 h和30 h分裂细胞达峰值;PMNs迁移峰为12 h和30 h,血小板聚集峰于12 h;γδT细胞的两峰为6 h和24 h,MΦ两峰滞后为24 h和42 h.结论 角膜上皮创伤修复过程分3期.基底细胞分裂增生和PMNs、MΦ以及γδT细胞迁移呈双相式;早期PMNs迁移与血小板聚集同步.     

茄病镰刀菌对体外培养小鼠角膜基质细胞TLR4表达的影响

目的通过检测茄病镰刀菌刺激小鼠角膜基质细胞后Toll样受体4（TLR4）的表达分布,探讨TLR4在角膜真菌感染中的作用。方法体外培养小鼠角膜基质细胞,采用茄病镰刀菌液（孢子密度为1×10^6CFU／mL）来刺激传3代的小鼠角膜基质细胞,于刺激0h（即未刺激）以及3、6、12h后应用免疫细胞化学染色、RT—PCR法测定各组细胞TLR4蛋白及mRNA的表达,ELISA法测定各组细胞上清液中肿瘤坏死因子α（TNF—α）的分泌水平。结果培养的角膜基质细胞1周后融合,波形蛋白荧光染色阳性。TLR4蛋白及mRNA在未刺激角膜基质细胞呈微弱表达,3h较前明显升高,6h达到高峰,12h开始减弱,但与0h相比,差异均有统计学意义（蛋白：t3h=0．031,t6h=0．097,t12h=0．069,P〈0．05;mRNA：t3h=0．367,t6h=0．422,t12h=0．078,P〈0．05）。TNF-α分泌量随着刺激时间的延长呈上升趋势,6h达到高峰,然后逐渐下降,3、6、12h组与0h组比较差异均有统计学意义（t3h=21．152,t6h=40．854,t12h=27．713,P〈0．05）。TLR4 mRNA及蛋白的表达与TNF-α的分泌间均呈正相关（r=0．729,0．751,P〈0．05）。结论TLR4可能在角膜识别真菌感染、介导炎性防御反应过程中起到重要的作用。     

去除型人皮肤成纤维饲细胞系的建立及其重建角膜表层的研究

目的　探讨去除型人皮肤成纤维饲细胞系的建立及其重建角膜表层的相关研究。方法　将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）、端粒酶逆转录酶（hTERT）和单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）3种基因导入人皮肤成纤维细胞，建立荧光标记的永生化的可去除型TERT+TK-D人源饲细胞系。将创建的细胞系经丝裂霉素C处理后作为饲养细胞与人角膜缘干细胞共培养，并与3T3饲细胞的培养结果作比较。结果　TERT+TK-D细胞系在体外经过6个月的连续传代后仍然表达绿色荧光蛋白，保持旺盛的分裂能力，对更昔洛韦敏感。TERT+TK-D组的克隆形成率（colony forming efficiency,CFE）为（11.77±0.21)%，与3T3组CFE［（12.8±1.61)］%比较，差异无统计学意义（P=0.332）；经过共培养，两组都形成了4~5层复层上皮细胞片。角膜缘干细胞克隆和上皮细胞片的免疫荧光染色及Real-time PCR定量分析结果显示，TERT+TK-D组角蛋白K3表达低于3T3组；PCR结果证实TERT+TK-D饲细胞在更昔洛韦作用下凋亡、裂解，没有混入培养获得的角膜上皮细胞片中。结论　转基因荧光标记的永生化的去除型人皮肤成纤维饲细胞有望替代3T3细胞用于角膜再生医疗。     

血竭素高氯酸盐促进离体兔角膜基质细胞凋亡的作用

目的 观察天然药物血竭素高氯酸盐(Dp)对离体兔角膜基质细胞增生的抑制作用,探讨其对细胞凋亡的影响,为临床上角膜瘢痕的防治提供新思路.方法 新西兰白兔18只,采用组织块培养法,在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中培养兔角膜基质细胞,通过含有EDTA的胰蛋白酶消化进行传代.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测不同质量浓度Dp(10～80 μg/mL)对细胞生长的抑制率,电镜观察Dp作用后角膜细胞的凋亡情况,流式细胞术(FCM)检测Dp作用后细胞凋亡率.结果 第3代角膜基质细胞呈现对波形蛋白单克隆抗体阳性反应和对角蛋白12多克隆抗体的阴性反应.角膜上皮细胞对角蛋白12抗体呈现绿色的荧光反应.Dp作用24、48、72 h后,其IC50分别为47.721、41.40、32.01 μg/mL.MTT比色法显示Dp对角膜基质细胞的抑制率呈现明显的质量浓度依赖性;电镜可观察到角膜细胞的凋亡;FCM检测Dp作用24 h的细胞凋亡率呈剂量依赖性升高(P<0.01).在Dp作用后24、48、72 h,Dp质量浓度与抑制率呈正相关(r=0.984,P<0.01;r=0.947,P=0.007;r=0.920,P=0.03).结论 Dp对兔角膜基质细胞的增生具有显著的抑制作用,且呈量效关系促进角膜基质细胞发生凋亡.     

异种角膜基质异位植入后免疫病理学研究

目的 观察异种角膜基质异位植入后的免疫病理变化，评价其免疫相容性。方法将一定大小的新鲜的和甘油脱水的猪角膜基质植入到小鼠皮下组织内，同时以异种皮肤、假手术为阳性和阴性对照；术后1个月取材进行组织病理学观察，并通过免疫荧光细胞化学法检测植入材料内T淋巴细胞总数和亚群的变化。结果新鲜的和甘油脱水的猪角膜基质皮下植入后1个月，可见少量的淋巴细胞、巨噬细胞、CD3＋细胞、CD4＋细胞、CD8＋细胞浸润．且CD4＋细胞多于CD8＋细胞，但未达到阳性对照水平（P〈0．05）。结论异种角膜基质异位植入后早期局部未引发免疫排斥反应，免疫相容性好。     

甘草甜素对角膜上皮损伤愈合中炎症反应的抑制作用

目的　探讨甘草甜素对角膜上皮损伤愈合中炎症反应的抑制作用。方法　取SPF级健康8周龄的雄性C57BL/6J小鼠60只,随机分为治疗组和对照组,每组30只,两组小鼠右眼建立角膜上皮损伤模型,左眼不做处理。治疗组用甘草甜素溶液滴眼,对照组用PBS滴眼,连续滴眼3 d。造模后0 h、24 h、48 h、72 h,使用100 g·L"^-1荧光素钠溶液染色观察两组小鼠的角膜上皮缺损面积;通过HE染色观察两组角膜组织结构变化;采用免疫组织化学染色法检测角膜基质层中白细胞介素-1（interleukin-1,IL-1）β的表达以及中性粒细胞的浸润情况。结果　造模后24 h、48 h、72 h,治疗组角膜上皮缺损率分别为（78.75±5.81）%、（21.58±4.53）%、（0.83±0.72）%,明显低于对照组的（87.74±3.57）%、（32.21±4.02）%、（3.80±1.86）%,差异均有统计学意义（均为P<0.01）。造模后72 h,HE染色结果显示:治疗组角膜上皮生长2～3层,上皮细胞排列欠规则;对照组角膜上皮生长0～2层,上皮细胞排列紊乱。造模后72 h,免疫组织化学染色结果显示:两组角膜基质层中IL-1β的阳性表达均降低,治疗组角膜基质层中IL-1β的平均光密度值为0.21±0.03,明显低于对照组（0.31±0.03）,差异有统计学意义（P<0.01）。另外,造模后72 h,两组角膜基质层的中性粒细胞数量大幅度减少,治疗组为每200倍视野（10.66±5.13）个,较对照组［（40.00±6.08）个］明显减少,差异有统计学意义（P<0.01）。结论　角膜上皮损伤时,甘草甜素能有效降低角膜基质层中 IL-1β 的表达和中性粒细胞浸润,从而减轻炎症反应,促进角膜上皮愈合。     

中性粒细胞在不同品系正常小鼠角膜的分布及其与角膜创伤修复的关系

背景 以往人们通常认为角膜无血管、无髓系来源的免疫细胞存在.C57BL/6J小鼠、BALB/c小鼠和裸鼠是眼科免疫学基础研究的常用模型,这些小鼠的角膜是否存在天然免疫的关键细胞——中性粒细胞是值得关注的问题. 目的 研究实验室常用的C57BL/6J鼠、BALB/c鼠和裸鼠正常角膜的中性粒细胞分布特征及其与角膜创伤修复的关系,为相关研究提供依据. 方法 选取角膜正常、10 ～ 12周龄的SPF级雄性C57BL/6J鼠、BALB/c鼠和BALB/c背景的裸鼠各16只,取3种小鼠各8只制备成中央区相连的4瓣角膜铺片,并以角膜周边血管缘为界向内以3个同心圆分区.分别用Gr-1-FITC抗体和CD31/PECAM-1-PE抗体对角膜中性粒细胞和血管进行免疫荧光染色,用免疫荧光显微镜和AR软件测量角膜血管面积并计数中性粒细胞.选取3种小鼠各8只制备角膜创伤模型,用无菌手术刀片以角膜中央为中心做十字划痕,深度至角膜前弹力层.创伤后即刻（0 h）、12h、24 h用2 g/L荧光素钠点眼,荧光显微镜下以AR软件计算不同时间点的创伤面积.于划痕后24 h取小鼠角膜制备铺片,用Gr-1-FITC抗体和CD31/PECAM-1-PE抗体行荧光染色,比较3种创伤小鼠角膜的血管分布、中性粒细胞的数量和分布情况.实验动物的饲养与使用均遵循美国视觉与眼科研究协会制定的科研动物使用规范. 结果 正常C57BL/6J小鼠、BALB/c小鼠和裸鼠角膜中性粒细胞总数分别为（1 733±237）、（353±96）和（1 601 ±223）个/角膜,BALB/c小鼠角膜中性粒细胞数明显少于C57BL/6J小鼠和裸鼠,差异均有统计学意义（P＜0.01）.3种正常小鼠角膜缘均可见血管分布,BALB/c小鼠角膜缘血管面积明显小于C57BL/6J小鼠和裸鼠,C57BL/6J小鼠角膜缘血管面积明显大于裸鼠,差异均有统计学意义（P＜0.01）.3种正常小鼠中性粒细胞的数量与血管面积均呈明显正相关（C57BL/6J：r=0.936,P=0.001;BALB/c：r =0.939,P=0.001;     

白细胞介素17中和性抗体对角膜移植排斥反应的抑制作用

背景白细胞介素17（IL-17）是一种促炎性细胞因子,在多种器官移植免疫排斥反应和自身免疫性疾病中发挥致病作用。IL-17拮抗剂在器官移植排斥反应中的作用被广泛研究,但其对角膜移植后排斥反应防治作用的研究较少。目的探讨抗小鼠IL-17单克隆抗体对小鼠角膜移植排斥反应的抑制效果。方法选取8～10周龄C57BL／6小鼠25只和BALB／c小鼠50只,将直径2min的C57BL／6小鼠双眼中央角膜作为供体角膜移植到50只BALB／c小鼠右眼角膜植床上,11,0尼龙线间断缝合8针,建立小鼠角膜移植模型。将建立的40只角膜移植小鼠模型按随机数字表法随机分为2个组,术后腹腔内分别注射小鼠IL-17中和性抗体（IL-17中和性抗体组）或同型对照抗体（同型对照抗体组）,并于术后不同时间点根据Plskova等的标准对受体角膜植片的炎症反应情况进行评分,≥5分为发生排斥反应。应用免疫荧光组织化学法检测受体植片炎性细胞的浸润;用逆转录PCR法对植片中的炎性细胞进行定量;应用ELISA法分析两组受体小鼠Th1、Th2和Th17相关细胞因子在脾脏中的表达情况。结果与同型对照抗体组相比,IL-17中和性抗体可以提高角膜植片的存活率（P〈0．05）。IL-17中和性抗体组受体植片中性粒细胞、CD4＋T淋巴细胞和CD8＋T淋巴细胞mRNA含量分别为2．22±0．10、1．64±0．04、1．32±0．10,明显低于同型对照抗体组的3．61±0．08、2．69±0．06、2．17±0．04,差异均有统计学意义（P=0．000、0．000、0．000）。同型对照抗体组受体小鼠脾脏中γ-干扰素（IFN-γ）、IL-12p40和IL-17质量浓度分别为（741．48±10．51）、（1156．90±69．93）、（366．13±7．93）ng／L,明显高于IL-17中和性抗体组的（529．80±13．83）、（539．58±10．74）、（173．70±8．11）ng／L,差异均有统计学意义（P=0．000、0．001、0．000）。结论中和IL-17的生物学活性可以在一定程度上抑制同种异体角膜移植术后的免疫排斥反应。     

小鼠角膜基质细胞分泌的转化生长因子β2及前列腺素E2对树突状细胞成熟过程的抑制作用

背景研究表明,位于角膜中央区的树突状细胞（DCs）完全处于未成熟状态,而位于角膜周边区的DCs则大多处于成熟状态。角膜内的DCs广泛参与多种角膜相关疾病以及角膜移植免疫排斥反应,研究角膜内DEs的成熟状态具有重要意义。目的探讨小鼠角膜基质细胞（CSCs）是否通过分泌转化生长因子β2（TGF—β2）以及前列腺素E：（PGE2）抑制DCs的成熟。方法获取DCs、T细胞以及CSCs培养上清液。通过酶联免疫吸附实验（ELISA）测定CSCs培养上清液以及新鲜RPMI1640培养基内PGE2和TGF—β2的质量浓度。在DCs成熟过程中,应用TGF—β2中和抗体以及PGE：受体阻滞剂AH6809,并按照处理方式的不同分为对照组、CSCs培养上清液组、AH6809组、TGF—β2中和抗体组、AH6809＋TGF—β2中和抗体组。采用流式细胞技术检测DCs细胞表型CDllc、CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达情况,通过葡聚糖内吞实验检测抗原吞噬功能,并通过混合淋巴细胞反应检测刺激T细胞增生的能力。结果ELISA检测结果显示,与新鲜RPMI1640培养基相比,CSCs培养上清液内含有较高质量浓度的TGF—β2和PGE2。与CSCs培养上清液组比较,TGF—β2中和抗体组DCsCD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达均升高,差异均有统计学意义（P〈0．05）,葡聚糖的表达降低（P〈0．05）,刺激指数（SI）增大（P〈0．05）;AH6809组CD86和MHC-Ⅱ的表达均升高,葡聚糖的表达降低,SI增大,差异均有统计学意义（P〈0．05）;TGF—β2中和抗体＋AH6809组DCsMHC-Ⅱ的表达和SI提高,差异均有统计学意义（P〈0．05）。与对照组比较,TGF—β2中和抗体＋AH6809组DCsCD80、CD86的表达和SI均较低,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论体外培养的小鼠CSCs可以通过分泌TGF—β2及PGE2抑制DCs成熟,且这两种细胞因子可发挥叠加效应。     

氧化剂对准分子激光兔角膜切削术后细胞凋亡的影响

目的探讨氧自由基对准分子激光屈光性角膜切削术（PRK）后凋亡机制介导的角膜创伤愈合反应的作用，以及局部应用抗氧化剂维生素C（Vit C）、维生素E（Vit E）对术后角膜的影响。方法将28只兔分成3组，其中4只为正常对照；其余24只实验兔分成2组，每组12只，行双眼-5．0 DPRK。一组术后左眼每日结膜下注射VitC 0．1g，右眼为对照；另一组术后左眼每日结膜下注射VitE 25mg，右眼为对照。于术后1、3、7、14d测定角膜组织超氧化物歧酶（SOD）、丙二醛（MDA）及谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的变化，同时术后定期制作病理切片，检测角膜基质细胞数量，采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）检测角膜细胞凋亡，光镜观察凋亡细胞形态，定量统计比较凋亡水平差别。结果（1）PRK术后1、3d角膜SOD、GPx活性小于对照组（P〈0．05），MDA的水平高于对照组（P〈0．05）。局部应用抗氧化剂组其角膜SOD、GPx活性高于单纯激光组（P〈0．05），MDA水平低于单纯激光组（P〈0．05）。（2）角膜基质细胞凋亡在1～14d均与正常对照组有差别（P〈0．01），在应用抗氧化剂组角膜基质细胞凋亡较单纯激光组减少（P〈0．05）。（3）术后角膜基质细胞数增加，应用抗氧化剂组角膜基质细胞增生较单纯激光组减少（P〈0．05）。结论准分子激光屈光性角膜切削术后早期，角膜存在着脂质过氧化形式介导的自由基性的组织损伤破坏，促进角膜细胞的凋亡；局部应用抗氧化剂VitC、VitE能早期减轻PRK术后炎性反应，降低角膜过氧化损伤，阻止术后细胞凋亡，减轻角膜基质反应性过度增生，降低术后屈光回退和haze形成。     

小鼠B、T淋巴细胞衰减因子真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建小鼠B、T淋巴细胞衰减因子（BTLA）的真核表达载体,并分析其在人胚肾HEK293细胞中的表达,为单纯疱疹性角膜基质炎的免疫治疗奠定基础。方法应用PCR法获得小鼠BTLA胞外功能区的cDNA片段,将其插入真核表达载体pcDNA3.1中,获得重组表达质粒pBTLA,经酶切鉴定和测序正确后转染HEK293细胞,并利用间接免疫荧光法、实时定量PCR（real-time PCR）、Western blot技术检测BTLA在细胞中的表达。结果重组质粒pBTLA经酶切鉴定和测序,确认插入序列正确,与基因文库中提供的基因序列同源性达98%～100%。Real-time PCR检测可见转染了重组质粒pBTLA的HEK293细胞内BTLA mRNA表达增强（P=0.00）,3个组间HEK293细胞内BTLA mRNA表达差异有统计学意义（F=167.83,P=0.00）;Western blot结果显示,转染重组质粒pBTLA的HEK293细胞内BTLA蛋白表达明显增强,转染后24～48 h表达最强。间接免疫荧光结果显示BTLA蛋白主要表达在HEK293细胞的细胞膜和细胞质中。结论成功构建了BTLA的真核表达载体,该重组质粒在HEK293细胞中能够表达BTLA,为后续研究BTLA在抗病毒免疫中的作用奠定基础。     

骨髓间充质干细胞移植治疗眼表损害的初步实验研究

目的观察体外培养的人骨髓间充质干细胞（hMSCs）移植到碱烧伤的兔角膜表面后,干细胞的成活、迁移和分化情况。方法采用NaOH溶液制作兔角膜碱烧伤模型,1个月后将培养有hMSCs的羊膜缝合到碱烧伤的兔角膜表面,以羊膜作为对照组,在裂隙灯显微镜下观察角膜的临床改变。术后1个月,摘除眼球,石蜡切片,苏木素-伊红（HE）染色观察角膜组织结构的变化,并进行抗人核抗体和细胞角蛋白12（CK12）的免疫组化染色以观察hMSCs的分布和分化情况。结果兔眼碱烧伤1个月后,角膜表面和基质层均可见大量血管,角膜呈瓷白色混浊,表面粗糙干燥,出现大量杯状细胞。hMSCs移植1个月后,角膜表面粗糙程度减轻,新生血管略有减少,但是角膜混浊未见明显改善,角膜表面杯状细胞消失;角膜表面和基质浅层存在抗人核抗体染色阳性的细胞;角膜表面细胞CK12染色阳性,而基质层未见CK12阳性细胞。对照组在羊膜移植1个月后,角膜状况较移植前无明显改善,角膜表面仍可见杯状细胞,角膜各层均未见抗人核抗体和CK12染色阳性的细胞。结论hMSCs移植到碱烧伤兔角膜表面后,能够成活并向角膜基质迁移,未发生移植排斥反应。hMSCs由于所在部位不同,可以在周围组织的诱导下向不同方向发生分化,角膜表面的细胞向角膜上皮细胞分化。而基质层中的细胞未分化为角膜上皮细胞。移植后角膜表面结膜化程度有所减轻。     

角膜基质细胞Toll样受体4对茄病镰刀菌炎性反应的实验研究

目的 检测茄病镰刀菌刺激小鼠角膜基质细胞后Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)的表达分布状况,探讨TLR4与炎性因子分泌的关系.方法 对小鼠角膜基质细胞进行原代培养和鉴定;制备茄病镰刀菌液;MTT法观察菌液刺激对角膜基质细胞生长作用的影响;免疫组化、RT-PCR测定刺激后不同时间点角膜基质细胞TLR4的表达;ELISA检测封闭TLR4对菌液诱导的角膜基质细胞分泌TNF-α、IL-8的影响.结果 采用消化法1～2 d培养出小鼠角膜基质细胞,抗波形蛋白免疫荧光染色阳性;菌液刺激48h后,MTT法显示刺激组较对照组OD值明显下降;正常角膜基质细胞TLR4在蛋白及mRNA水平呈弱表达,刺激6h可达到高峰,12h开始逐渐降低;菌液可上调角膜基质细胞TNF-α、IL-8的释放,刺激3h、6h、12 h的TNF-α、IL-8的浓度与TLR4 mRNA的表达呈明显的正相关(P＜0.05);预先封闭TLR4,可明显降低TNF-αt、IL-8的释放.各时间组间的差异有统计学意义(P＜0.05).结论 角膜可能通过TLR4识别真菌感染,TLR4在角膜对真菌的免疫炎性防御反应中起到重要作用.     

姜黄素对角膜基质细胞纤维化的抑制作用

背景角膜的创伤或手术可导致角膜基质细胞纤维化,进而形成瘢痕。研究表明姜黄素可明显减轻组织的纤维化程度,但姜黄素是否会影响角膜基质细胞纤维化的研究尚少。目的观察不同质量浓度的姜黄素对小鼠角膜基质细胞向成纤维细胞转化过程的影响,探讨姜黄素抗角膜基质纤维化的作用。方法150只6～8周龄BALB／c小鼠,分离角膜基质细胞并在含质量分数10％胎牛血清（FBS）的DMEM中进行培养,以原代角膜基质细胞重悬于DMEM中并分为5组：（1）空白对照组（DMEM＋10％FBS,含质量分数1％。DMSO,CG组）。（2）低剂量组（CG＋7．5mg／L姜黄素组）。（3）中剂量组（CG＋10mg／L姜黄素组）。（4）高剂量组（CG＋12．5mg／L姜黄素组）。（5）无诱导剂组（DMEM,含1％oDMSO）。上述因素干预7d后,用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测各组中细胞表型keratocan、醛脱氢酶（ALDH）、CD90、decorin、fibronectin一1的表达。用MTS法检测姜黄素对角膜基质细胞增生的影响。制备小鼠角膜冰冻切片,采用免疫荧光技术检测角膜基质细胞内fibronectin-1的表达。结果原代培养的角膜基质细胞呈梭形,为细胞质丰富且核大的角膜基质成纤维细胞。随着姜黄素质量浓度的增加,角膜基质细胞中keratocanmRNA、ALDHmRNA的表达量增加,CD90mRNA和decorinmRNA的表达量减少,差异均有统计学意义（P〈O．05）,fibronectin-1mRNA的表达变化差异无统计学意义（P〉0．05）。MTS法检测发现,随着姜黄素质量浓度的增加,对角膜基质细胞增生的抑制率逐渐增加（F=956．00,P〈0．05）。免疫荧光技术检测发现角膜基质细胞中fibronectin-1的表达呈红色荧光。结论姜黄素对离体小鼠角膜基质细胞纤维化有明显的抑制作用,可减轻角膜基质创伤修复过程中的过度纤维化。     

高糖饮食对小鼠真菌性角膜炎的影响

目的　探究高糖饮食对小鼠真菌性角膜炎的影响。方法　选取健康无眼疾的雄性C57BL/6J小鼠78只，随机分为高糖饮食组和模型对照组，每组36只，模型对照组给予正常饮用水，高糖饮食组给予含体积分数10%果糖溶液，每2 d测量两组小鼠体质量及血糖，10 d后建立真菌性角膜炎模型。造模后24 h、36 h、48 h、72 h、96 h、120 h、168 h裂隙灯显微镜下对角膜进行临床评分并拍照。处死小鼠后，取角膜组织进行HE染色和PAS染色；测定角膜内中性粒细胞和巨噬细胞浸润体积。利用酶联免疫吸附实验对小鼠角膜内的白细胞介素-1β含量进行测定。结果　造模后 0~14 d，两组小鼠体质量与血糖差异均无统计学意义（均为P>0.05）。造模后24 h、36 h、48 h、120 h、168 h，高糖饮食组小鼠角膜临床评分均明显高于模型对照组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。高糖饮食组小鼠角膜穿孔率79.5%，高于模型对照组的40.9%，差异有统计学意义（P=0.000）。造模后各时间点，高糖饮食组中性粒细胞浸润体积均高于模型对照组，差异均有统计学意义（均为P=0.000）。造模后72 h、96 h、120 h、168 h，高糖饮食组巨噬细胞浸润体积均高于模型对照组（均为P=0.000）。角膜组织病理学检查结果示，高糖饮食组炎症反应更重，角膜组织破坏更早且更为严重。造模后24 h、48 h高糖饮食组白细胞介素-1β含量均明显高于模型对照组（均为P<0.05）。结论　高糖饮食加重了真菌性角膜炎感染的严重程度，增强了中性粒细胞、巨噬细胞的趋化，促进了IL-1β的分泌。     

共聚焦显微镜下LASIK术后角膜基质的变化

目的研究准分子激光原位角膜磨镶术（LASIK）术后角膜基质的改变。方法选择LASIK患者24例（48眼），于术后第1、10、30和90d进行角膜中央部位共聚焦显微镜检查。结果48眼（100％）角膜瓣基质有微皱褶，在瓣与基质床界面处可见高反光颗粒。界面上下可见激活细胞，激活细胞所在区域深度与角膜瓣厚度呈负相关性（r1=-0．554，P=0．047）；与削切深度呈正相关（r2=0．559，P=0．010），后基质细胞术后有所增加，1个月（P=0．000）时达到最高，3个月时又下降，但仍高于术前（P=0．000）。结论LASIK术后角膜基质可见微皱和高反光颗粒，基质细胞被激活，界面两侧基质中出现无细胞区。后基质细胞密度有所增加。     

鸵鸟去细胞异种角膜基质载体异位移植对BALB/c小鼠外周血T细胞亚群的影响

背景 鸵鸟去细胞角膜基质具有与人角膜基质相似的天然结构,有望成为直接应用或构建生物角膜理想的载体材料之一. 目的 用鸵鸟角膜制备去细胞基质载体,研究其免疫原性,为产业化开发早日用于临床提供实验基础.方法 收集新鲜鸵鸟和猪眼球各20个,采用低温冷冻联合酶消化及干燥剂脱水法制备鸵鸟及猪去细胞角膜基质载体,用Co^60照射法进行消毒.按随机数字表法将雄性BALB/c小鼠45只随机分为伪手术组、猪去细胞角膜基质组和鸵鸟去细胞角膜基质组,伪手术组小鼠仅制作囊袋,不植入异种角膜基质片,其余两组分别取干燥脱水法制备的猪、鸵鸟去细胞角膜基质载体（复水后每片湿质量为10 mg）异位植入BALB/c小鼠背部皮下,术后观察伤口愈合情况,并分别于术后7、14、28 d获取BALB/c小鼠外周血,进行免疫荧光标记及流式细胞仪分析,比较两种异种角膜基质对小鼠CD4^＋、CD8^＋、CD25^＋表型的动态影响.结果 猪、鸵鸟去细胞角膜基质载体小鼠植入处皮肤无红肿及渗出,伤口愈合良好.术后7、14和28 d,伪手术组、猪去细胞角膜基质组和鸵鸟去细胞角膜基质组外周血中CD4^＋细胞百分率的差异均无统计学意义（F=0.74,P=0.50;F=0.39,P=0.05;F=3.46,P=0.58）;外周血中CD8^＋细胞百分率的差异均无统计学意义（F=1.75,P=0.21;F=1.14,P=0.35;F=0.78,P=0.48）;外周血中CD25^＋细胞百分率差异亦均无统计学意义（F=0.52,P=0.61;F=3.53,P=0.62;F=2.42,P=0.13）.结论 鸵鸟去细胞角膜基质载体的免疫原性低,具有重要的开发价值.     

热休克蛋白B6中和性抗体对脉络膜血管内皮细胞管腔形成的影响及其机制

背景血管内皮细胞的增生和迁移是血管发生的主要环节。新近的研究发现,热休克蛋白B6（HspB6）可促进多种与血管新生相关因子的分泌,导致病理状态下新生血管的发生,研究HspB6中和性抗体对人脉络膜血管内皮细胞增生、迁移和管腔形成能力的影响对于脉络膜新生血管相关疾病的靶向治疗具有重要意义。目的探讨HspB6中和性抗体对人脉络膜血管内皮细胞管腔形成能力的影响及其机制。方法对人脉络膜血管内皮细胞株进行培养和传代,取对数生长期细胞用于实验。应用逆转录PCR（RT—PCR）和流式细胞术检测HspB6mRNA及其蛋白在人脉络膜血管内皮细胞中的表达。将基质胶铺于96孔板中,凝固后加入细胞悬液,细胞密度为2×10^4个／孔,将不同质量浓度（100μg／L、500μg／L）HspB6中和性抗体分别加入培养孔,未加入HspB6中和性抗体的细胞作为对照组（0μg／LHspB6中和性抗体组）,每组设3个复孔。细胞孵育12h后,采用体外三维成型法检测各组完整管腔形成的数量,以评价HspB6中和性抗体对人脉络膜血管内皮细胞的管腔形成能力。96孔板培养人脉络膜血管内皮细胞,培养液中加入不同质量浓度（0、50、100、500μg/L）HspB6中和性抗体孵育24h,然后采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测细胞的增生值。采用Transwell小室法检测HspB6中和性抗体作用24h后各组穿过小室膜的“贴壁”细胞数目,以评估人脉络膜内皮细胞的增生和迁移情况。收集HspB6中和性抗体干预后的人脉络膜血管内皮细胞,流式细胞术检测HspB6中和性抗体作用后各组人脉络膜血管内皮细胞的凋亡率。结果人脉络膜血管内皮细胞在基因和蛋白水平均可表达HspB6分子。0、100、500μg／LHspB6中和性抗体组管腔形成数目分别为（67．25±5．75）、（60．39±6．41）和（39．76±10．73）个／视野,总体比较差异有统计学意义（F=10．210,P=0．012）,其中500μg／LHspB6中和性抗体组管腔形成数目明显少于0μg／LHspB6中和性抗体组,差异有统计学意义（P=0．005）。随着HspB6中和性抗体质量浓度的增加和作用时间的延长,其对细胞增生和迁移的抑制率均明显增加,差异均有统计学意义（F质量浓度=7．485,P=0．002;F时间=16．684,P=0．001）。Transwell小室法检测显示,0、50、100、500μg／LHspB6中和性抗体组细胞迁移数目分别为（14．0±2．5）、（11．1±0．8）、（6．6±0．1）、（6．7±0．2）个,其中100μg／L、500μg／LHspB6中和性抗体干预24h后细胞迁移数目较0μg／LHspB6中和性抗体组明显减少,差异均有统计学意义（均P=0．000）。流式细胞术检测结果发现,HspB6中和性抗体组人脉络膜血管内皮细胞的凋亡率为（22．73±2．53）％,对照组为（13．33±2．08）％,差异有统计学意义（t=4．967,P=0．008）。结论HspB6中和性抗体对脉络膜血管内皮细胞的管腔形成有抑制作用,可能通过抑制血管内皮细胞的增生、迁移以及促进细胞的凋亡等途径发挥效应。     

RNA干扰对兔角膜基质细胞环氧化酶2与基质金属蛋白酶2表达的抑制作用研究

目的 探讨针对环氧化酶2(COX-2)的RNA干扰(RNAi)对兔角膜基质细胞中COX-2与基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达的影响.方法 实验研究.体外培养兔角膜基质细胞,测定阳离子脂质体介导的小干扰RNA(siRNA)在兔角膜基质细胞中的转染率,设计并合成3条针对兔COX-2基因的短发卡RNA(shRNA)1、2、3和1条阴性对照shRNA,利用阳离子脂质体介导转染正常与IL-lα刺激后的兔角膜基质细胞,在IL-lα刺激后6、12、24、48、72 h收集细胞,实时荧光定量聚合酶链反应检测兔角膜基质细胞中COX-2和MMP-2基因的表达变化,并与对照组进行比较.同一时间点各组间比较采用单因素方差分析,处理组两两比较采用q检验.结果 阳离子脂质体能够有效介导siRNA转染体外培养的兔角膜基质细胞,转染率可达70%～80%.IL-lα刺激后兔角膜基质细胞中COX-2与MMP-2 mRNA的表达较空白对照组显著升高;在不同时间点,生物合成的3条针对COX-2的靶向shRNA中shRNA-2能显著抑制IL-α刺激后的兔角膜基质细胞中COX-2、MMP-2 mRNA表达,抑制率最高可分别达83.04%、73.69%,与单纯IL-lα刺激组相比差异均有统计学意义(q=24.03,P=0.00;q=14.76,P=0.00);而shRNA-1、shRNA-3、阴性对照shRNA转染组与单纯IL-lα刺激组相比,COX-2 mRNA的表达差异无统计学意义(F=0.02,P=0.99),MMP-2 mRNA的表达差异也无统计学意义(F=0.02,P=0.98).结论 针对COX-2的RNAi能够有效抑制IL-lα诱导后的兔角膜基质细胞中COX-2与MMP-2的表达.     

房水对培养的角膜基质细胞的影响

目的观察房水对角膜基质细胞生长的作用。方法将新西兰大白兔的角膜去除后弹力层、内皮层和上皮层后,得到基质层,用组织块培养法体外培养角膜基质细胞。在实验组的培养基中加入10％房水,对照组使用常规培养基培养。通过CCK8实验测得角膜基质细胞的吸光度（A）值以分析细胞增生的情况。分别在培养基中加入2．5％、5％、10％、15％、20％的房水,用明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶（MMPs）的活性。结果倒置显微镜观察可见培养的角膜基质细胞呈多角形或树枝状,与对照组相比,实验组的细胞生长状态良好,培养的角膜基质细胞数量明显增加。明胶酶谱法显示实验组的条带比对照组清晰。实验第1～5天分别测角膜基质细胞的A值,实验组的检测条带明显强于对照组,〉10％的房水培养组检测的条带明显强于2．5％、5％房水培养组。CCK8检测表明,培养1～5d实验组的角膜基质细胞A值明显高于对照组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论房水作用于角膜基质细胞后,可促进角膜基质细胞的生长,10％房水对体外培养角膜细胞有促细胞增生的作用。