结直肠癌中KRAS基因突变及其检测方法概述

结直肠癌（Colorectal Cancer,CRC）是世界上发病率最高的恶性肿瘤之一.CRC的发生与细胞的跨膜信号转导系统功能异常有关,目前已经明确Ras/Raf/MAPK级联反应通路在其中起到很重要的作用.在CRC中,KRAS基因突变十分常见,KRAS基因的突变使信号转导通路下游各种基因的激活不再依赖于表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR）的启动,这对CRC的发生、发展、治疗与预后起着非常重要的作用.因此,在临床工作中,检测KRAS基因突变情况显得尤为重要,这也对检测技术及其准确性提出了更高的要求.本文对KRAS在CRC中的作用、机制及其突变的概率、检测方法做一简要综述.     

结直肠癌中KRAS基因突变与SETDB1表达的相关性及临床意义

  目的  探讨KRAS基因突变与SETDB1（set domain bifurcated 1）蛋白表达在结直肠癌中的临床意义及两者间的关系。  方法  收集2017年1月至2017年12月于西南医科大学附属医院住院接受诊治的122例结直肠癌患者的组织标本及病例资料,采用二代测序技术（NGS）检测KRAS基因突变情况,免疫组织化学染色检测SETDB1蛋白的表达情况。  结果  122例结直肠癌组织中KRAS基因突变率为41.8%,KRAS基因突变状态与肿瘤部位、术前血清CEA水平相关（P < 0.05）,与年龄、性别、分化程度、肿瘤大小、pT?NM分期、淋巴结转移等无关（P>0.05）。KRAS基因突变状态与SETDB1蛋白表达呈正相关（r=0.232,P=0.008）。SETDB1蛋白水平与肿瘤分化程度、大小及术前血清CEA水平相关（P < 0.05）,与年龄、性别、肿瘤部位、pTNM分期、淋巴结转移等无关（P>0.05）。  结论  SETDB1蛋白在KRAS突变型结直肠癌组织中呈现高表达,KRAS基因突变可能影响SETDB1蛋白表达。      

结直肠癌患者KRAS和BRAF基因突变检测及其临床意义

目的探讨结直肠癌患者组织中KRAS和BRAF基因突变情况,分析突变与临床病理特征的关系。方法应用荧光PCR-优化寡核苷酸探针法检测304例结直肠癌石蜡包埋标本中KRAS基因2号外显子的12和13密码子、BRAF基因的15号外显子的突变情况,分析KRAS和BRAF基因突变与临床病理特征的关系。结果 KRAS和BRAF基因在结直肠癌的突变率分别为38.8%(118/304)和4.3%(13/304)。KRAS基因突变阳性标本中12密码子的突变率为78.0%,其中p.G12D发生率最高,占总突变的45.3%;13密码子的突变率为22.0%。高年龄组(≥60岁)患者的KRAS基因突变率为47.2%(58/123),高于低年龄组(<60岁)的33.1%(60/181),差异有统计学意义(P<0.05)。转移性结直肠癌患者19例,其KRAS基因突变率为36.8%(7/19),与285例原发性结直肠癌患者的突变率(38.9%,111/285)差异无统计学意义(P>0.05)。BRAF基因在结肠、低分化、黏液腺癌患者中的突变率明显高于直肠、中或高分化和管状腺癌的患者。结论结直肠癌患者中KRAS基因突变的发生率较高,与年龄相关,而与性别、部位、病理类型和分化程度不相关。BRAF基因突变与肿瘤部位、病理类型和分化程度有关。原发性与转移性结直肠癌患者KRAS基因突变率无明显差异。     

结直肠癌微卫星不稳定性的临床意义

目的微卫星是存在于人体基因组中的小片段核苷酸序列的串联式重复序列,有许多报道表明在遗传性结直肠癌中出现微卫星不稳定性.为了了解其在散发性结直肠癌发生发展中的作用,我们检测了50例散发性结直肠癌组织的微卫星不稳定性情况.方法每例癌组织及邻近正常粘膜取出后进行DNA提取,选取BAT26微卫星位点设计引物进行PCR扩增,扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶(含7M尿素)上电泳,根据正常粘膜及癌组织的电泳条带有无差异判定有无微卫星不稳定性.结果在BAT26位点有13例(26%)出现异常,近端42.11%(8/19)高于远端16.13%(5/31)(P＜0.05);分化程度好、中、差分别为8.33%、19.23%、58.33%,有明显相关性(P＜0.01).结论散发性结直肠癌中微卫星不稳定性发生率较高,且与肿瘤部位及分化程度有明显相关性.     

KRAS 基因突变与结直肠癌转移模式相关性的研究简

目的：研究结直肠癌患者KRAS基因突变与根治后转移的相关性。方法：检测132例结直肠癌根治术患者石蜡组织中的KRAS基因,回顾性分析患者根治术后3年内转移、复发情况,采用单因素及多因素分析KRAS突变与转移的相关性。结果：各转移组KRAS基因突变率分别为：肺（63．2％）、脑（66．7％）、肝（30．4％）及无转移组（34．7％）。单因素分析提示肺、脑转移组KRAS基因突变率显著高于肝转移组及无转移组（P〈0．05）。纳入年龄和性别校正后采用Logistic回归分析提示KRAS突变显著增加肺转移及脑转移风险（P〈0．05）,而肝转移风险无显著升高（P〉0．05）。结论：结直肠癌转移模式与KRAS突变有关,检测KRAS突变状态有助于更加有效地制定复发监视策略。     

中国人群结直肠癌中PIK3CA基因突变分析

目的:PIK3CA基因编码ⅠA型磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3Ks)的p110催化亚基,致癌性的PIK3CA突变可通过激活P13K通路参与结直肠癌的发生发展。PIK3CA在西方结直肠癌患者中有较高的突变频率,但其在中国人结直肠癌中的突变情况尚不明确。本研究旨在探讨中国人结直肠癌中PIK3CA基因的突变频率、分布特点及其与结直肠癌的关系。方法:采用PCR产物直接测序法,对79例中国结直肠癌患者肿瘤标本中PIK3CA基因外显子9和外显子20中的突变进行检测分析。结果:在79例肿瘤标本中检出PIK3CA基因突变率为8.9%(7/79),其中外显子9突变率为6.3%(5/79),外显子20突变率为2.5%(2/79),其突变热点分布与既往文献报道基本相符。结论:中国人结直肠癌中存在一个PIK3CA基因突变的亚群,其E542K、E545K和H1047R突变,与以往报道的该基因的致癌性突变相一致,可能是这部分结直肠癌中PI3K信号通路激活的原因。     

COLD-PCR-HRM 检测结直肠癌患者外周血KRAS基因突变

目的  评价COLD-PCR-HRM 检测结直肠癌患者外周血KRAS 基因突变的临床应用价值。方法  将已知突变型 KRAS 组织DNA 与野生型DNA 做系列稀释,突变DNA 所占比例分别为50%、25%、10%、5%、3%、2% 和 1%。分别应 用常规PCR-HRM 法和COLD-PCR-HRM 法对不同比例KRAS 突变DNA 样本进行检测,验证两种检测方法的灵敏度;同 时应用 COLD-PCR-HRM 法对 62 例外周血和肿瘤组织配对样本进行一致性验证。结果  PCR-HRM 法最低检测浓度为 3%; COLD-PCR-HRM 法最低检测浓度为1%,两种方法的检测灵敏度均明显高于直接测序法（P ＜ 0.05）。应用COLD-PCRHRM 法检测两种样本中KRAS 基因突变状态,其中血清样本中检测出13 例突变（突变率21.0%,13/62）,组织中检测出 12 例突变（突变率 19.4%,12/62）,两种标本同时存在突变的有 9 例,以组织中检测的 KRAS 状态为准,两者突变一致性 为 75.0%（9/12）。KRAS 基因突变在组织与外周血中存在一致性（κ=0.649;P ＜ 0.001）。结论  COLD-PCR 结合 HRM 明 显提高了 KRAS 突变检测灵敏度,为其应用于低丰度突变样本检测提供了有利条件。     

逆转录聚合酶链反应检测结直肠癌淋巴结微转移的临床意义

背景与目的:结直肠癌淋巴结微转移灶是否有预测预后价值目前尚有争议,本文对结直肠癌患者淋巴结微转移情况进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测,研究微转移对临床分期和预后的影响。方法:用RT-PCR技术检测56例结直肠癌患者肠旁及系膜淋巴结中细胞角质蛋白CK20mRNA,揭示微转移灶的存在,并与常规病理苏木精伊红(HE)染色和免疫组化染色结果进行比较;分析HE染色和RT-PCR检测结果对判定临床病理分期和统计生存率的影响。结果:共检测432个淋巴结,HE染色、免疫组化染色和RT-PCR法淋巴结转移检出率分别为57.2%、62.3%和73.1%。HE染色和免疫组化的检出率无显著性差异(P>0.05),而HE染色和RT-PCR法检测结果有显著性差异(P<0.05)。56例患者中,按HE染色结果确定的PN0、PN1和PN2期,其5年无复发转移生存率分别为80%、60%和50%;通过RT-PCR技术检测,升级后的PN0、PN1和PN2期5年无复发转移生存率分别为100%、61.9%和55.6%,两种方法分析的结果有显著性差异(P<0.05)。结论:HE染色未确切指出淋巴结微转移癌;RT-PCR法检测CK20mRNA可以推断淋巴结微转移癌的存在,从而有助于确定结直肠癌临床分期和预测预后。     

结直肠癌患者血浆纤维蛋白原的检测及其临床意义

目的 检测结直肠癌患者血浆中纤维蛋白原（FIB）含量,研究结直肠癌患者血浆FIB水平与结直肠癌临床分期、浸润程度和转移的关系,探讨其对于结直肠癌辅助诊断及判断预后的临床意义。方法 使用ACL200血凝分析仪检测229例初诊结直肠癌患者和31例结直肠良性疾病患者血浆中FIB含量,应用全自动电化学发光免疫分析仪对其中98例结直肠癌患者进行肿瘤标志物的检测,包括癌胚抗原（CEA）、糖抗原19-9（CA19-9）和糖抗原72-4（CA72-4）的检测;以酶联免疫分析检测糖抗原242（CA242）和组织多肽特异抗原（TPS）。结果 结直肠癌患者血浆中FIB水平明显高于结直肠良性疾病患者。结直肠癌患者的FIB水平随临床分期和浸润程度增高而升高;有淋巴结转移和远处转移者明显高于无转移者,并且远处转移者高于仅有淋巴结转移者;FIB水平与CEA、CA242和TPS水平呈正相关,而与CA19-9和CA72-4未见明显的相关性。结论 结直肠癌患者存在FIB异常,重度结直肠癌患者（高临床分期、高浸润程度、远处转移等）血浆中FIB升高。     

结直肠癌前哨淋巴结体外定位检测的临床研究

目的:探讨用体外亚甲蓝作为染色剂寻找前哨淋巴结(sentinellymph node,SLN)的方法在结直肠癌SLN定位中的可行性及临床价值。方法:将行标准根治性切除的结直肠癌标本离体后,在肿块四周黏膜下注射亚甲蓝后追踪辨认。蓝染的淋巴结视为SLN,未蓝染的淋巴结被视为NSLN。SLN中无癌细胞转移者常规行细胞角蛋白(CK、AE1/AE3)免疫组化检查,CK阳性者视为有微转移病例。结果:82例患者成功标记SLN(96.47%),准确度为90.24%。通过CK检测,16例SLN阴性患者发现微转移,总转移率提升了18.30%,TNM分期得以提升的患者达18.82%。HE染色下SLN的假阴性率为23.17%,结直肠癌的假阴性率分别为6.38%和45.71%,有统计学意义（P=0.001）。结论:前哨淋巴结活检（SLNB）对结肠癌区域淋巴结转移情况的判断更有临床价值,但在直肠癌方面的应用值得进一步探讨。     

Role of NRAS mutations as prognostic and predictive markers in metastatic colorectal cancer

NRAS mutations occur in 3–5% of colorectal cancer. Differently from KRAS and BRAF mutations, the role of NRAS mutations as prognostic and predictive markers in metastatic colorectal cancer (mCRC) has been investigated to a lesser extent. A retrospective series suggested the role of NRAS mutations as predictors of resistance to anti‐EGFR monoclonal antibodies (MoAbs) in chemo‐refractory patients with mCRC. In our study, KRAS codons 12, 13, 61 and BRAF codon 600 mutational status were evaluated in mCRCs referred to our Institution from 2009 to 2012. NRAS codons 12, 13 and 61 mutational status was analyzed in KRAS/BRAF wt patients. We collected pathological and clinical features in the overall population and outcome data in a subset of NRAS mutated chemo‐refractory patients treated with anti‐EGFR MoAbs in advanced lines. NRAS was mutated in 47/786 (6%) mCRCs. NRAS and KRAS mutated tumors did not show significant differences in terms of clinical and pathological characteristics, except for a lower prevalence of mucinous histology (p = 0.012) and lung metastases (p = 0.012) among NRAS mutated tumors. In the uni‐ and multivariate model, NRAS mutations were associated with shorter overall survival (OS) compared to all wt patients (median OS 25.6 vs 42.7 months; univ: HR = 1.91, 95% CI 1.39–3.86, p = 0.0013; multiv: HR = 1.75, 95% CI 1.1.3–2.72, p = 0.013). None of the chemo‐refractory NRAS mutated patients evaluable for response to anti‐EGFRs achieved response. In conclusion, NRAS mutations have a relevant incidence in patients with mCRC and showed an association with specific clinical and pathological features. NRAS mutations affect mCRC patients' prognosis and predict lack of response to anti‐EGFRs.     

转移性结直肠癌维持治疗研究进展

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一。近年来,奥沙利铂、5-FU类制剂、伊立替康、VEGF抗体、EGFR抑制剂等药物的使用延长了晚期结直肠癌患者的5年生存率,显著改善患者的生活质量。维持治疗是指对一线治疗后获益的患者,停用某些毒副反应较大的药物,保留低毒性药物继续治疗的一种治疗模式。因此,一些临床研究评估了上述药物在转移性结直肠癌患者一线治疗获益后的维持治疗的疗效及安全性。本文就转移性结直肠癌维持治疗方案的临床研究作一综述,全面地了解转移性结直肠癌维持治疗的相关进展。     

Influence of KRAS mutation status in metachronous and synchronous metastatic colorectal adenocarcinoma

BACKGROUND:

Mutations in the v‐Ki‐ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog (KRAS) are present in approximately 30% to 40% of colorectal adenocarcinomas. Wild‐type (WT) KRAS mutation status is predictive of tumor response with epidermal growth factor receptor‐directed therapies, but the results from studies evaluating the prognostic value of KRAS status in localized disease have been contradictory. The prognostic value of KRAS in metastatic disease, specifically according to whether patients have synchronous or metachronous disease at presentation, is less understood.

METHODS:

One‐hundred ten consecutive patients with metastatic colorectal adenocarcinoma underwent testing for KRAS exon 2 mutations by polymerase chain reaction amplification and direct nucleotide sequencing. The clinical characteristics, treatments, and outcomes of these patients were then analyzed retrospectively, stratified according to whether patients presented with synchronous or metachronous metastasis and according to KRAS mutation status (WT or mutated).

RESULTS:

For the entire cohort, the median overall survival from the date of diagnosis of metastatic disease was 34.3 months (95% confidence interval, 28.3‐49.4 months) for patients with WT KRAS (n = 70). The median overall survival for patients with mutated KRAS (n = 40) was 40.3 months (95% confidence interval, 27.9‐51.1 months; log‐rank P = .91). Kaplan‐Meier survival analysis indicated that 3‐year overall survival and 5‐year overall survival were not statistically different. Within the subgroups of patients with synchronous and metachronous metastatic disease, no significant differences were observed in median overall survival, 3‐year overall survival, or 5‐year overall survival between the WT KRAS and mutated KRAS groups.

CONCLUSIONS:

In this study, KRAS mutation status did not influence overall survival in either synchronous or metachronous metastatic colorectal adenocarcinoma and, as such, had no prognostic role in this disease setting. Cancer 2012. © 2012 American Cancer Society.     

非小细胞肺癌患者细胞学标本EGFR基因突变检测及其临床病理意义

目的: 探讨细胞学标本在非小细胞肺癌(NSCLC)的诊断及个体化治疗中的临床应用价值。方法: 收集352例新鲜细胞学标本制片后,行常规HE染色;同时选择TTF-1、NapsinA、CK7、CEA、CD56、Syn、P63、CK5/6、WT-1、E-cadherin等抗体对来源不明的肿瘤细胞进行免疫细胞化学标记,并对明确诊断为NSCLC的病例,采用突变扩增阻滞系统(ARMS)检测表皮生长因子受体(EGFR)基因突变情况。结果: 352例患者中,345例有癌细胞。经临床及免疫细胞化学证实345例恶性细胞中,NSCLC有335例,且NSCLC细胞学标本中有302例DNA提取成功,占90.15%(302/335)。EGFR 基因检测结果显示,EGFR 共突变123例,总突变率为40.73%(123/302)。其中,第18、19、20、21外显子的突变率分别为0.99%(3/302)、19.21%(58/302)、0.66%(2/302)和19.87% (60/302); EGFR 18、19、21外显子突变占EGFR 突变总数的98.37%(121/123)显著高于EGFR 20外显子突变(P<0.05)。302例患者中,女性患者EGFR 突变率为54.35% (75/138),明显高于男性患者29.27%(48/164)(P<0.05);非吸烟患者EGFR 的突变率为51.49% (104/202),显著高于吸烟者19%(19/100)(P<0.05)。276例腺癌中EGFR 突变率44.20%(122/276);非腺癌EGFR 突变率4.34%(1/23);腺癌EGFR 突变率明显高于其他类型(P<0.05)。结论: 利用新鲜细胞学标本,结合免疫细胞化学标记和ARMS分子病理技术有助于晚期非小细胞肺癌的诊断,并为表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)个体化治疗提供可靠依据。     

Cetuximab in metastatic colorectal cancer

Management of metastatic colorectal cancer has evolved in the last 10 years, with the availability of targeted therapies resulting in improvement in quality of life and overall survival. Cetuximab is a chimeric monoclonal antibody that binds to the EGF receptor, and the net effects are inhibition of tumor growth, invasion, angiogenesis and metastasis. Cetuximab binding to the EGF receptor is also known to augment the effects of chemotherapy and radiotherapy. Only tumors expressing wild-type KRAS respond to cetuximab and improvements in progression-free survival and overall survival are seen, whereas patients with mutant KRAS are considered to be resistant. Cetuximab is currently available worldwide for use as monotherapy or in combination with chemotherapy in first-, second- or third-line settings in metastatic colorectal cancer patients with wild-type KRAS.     

具核梭杆菌与结直肠癌的关系及其临床意义

结直肠癌是常见的消化道肿瘤,是由多种因素共同影响的过程。肠道微生态的失衡可引起多种肠道疾病。随着分子生物学及宏基因组学的深入研究,发现肠道微生态与结直肠癌的发生、发展关系密切。许多研究发现具核梭杆菌参与了结直肠癌发生、发展的过程。本文通过总结现有的文献,就具核梭杆菌与结直肠癌的关系进行概括,为未来结直肠癌的治疗提供新方向。     

hsacirc0006867在结直肠癌组织中的表达及其临床意义北大核心

目的:探讨环状RNA hsa_circ_0006867在结直肠癌中的表达及其与临床病理因素的关系。方法:全转录组测序筛选结直肠癌中特异circRNAs表达谱,挑选出差异表达显著的hsa_circ_0006867,qRT-PCR检测54例结直肠癌组织及癌旁组织中hsa_circ_0006867表达情况,分析其表达水平与结直肠癌临床病理特征的相关性,ROC曲线分析hsa_circ_0006867在结直肠癌中的诊断价值。结果:测序获得circRNAs在结直肠癌中的差异表达谱,qRT-PCR验证hsa_circ_0006867在结直肠癌中表达下调(P<0.05)。其表达水平与肿瘤分化程度和远处转移有关(P<0.05)。ROC曲线显示hsa_circ_0006867诊断结直肠癌AUC为0.851(95%CI:0.775~0.927),当截断值为0.0146时,敏感度为88.46%(95%CI:0.770~0.946),特异度为73.08%(95%CI:0.598~0.832),差异具有统计学意义(P<0.001)。结论:hsa_circ_0006867在结直肠癌中表达下调,与相关临床病理特征密切联系,可作为潜在结直肠癌临床诊断指标。     

循环肿瘤细胞评估转移性结直肠癌微波消融治疗的初步研究

目的:利用循环肿瘤细胞（circulating tumor cells,CTCs）评估转移性结直肠癌微波消融治疗及其预后的相关性。方法:研究分析了2015年1月至2018年4月在东南大学附属第二医院因转移性结直肠癌行肺部或肝脏病灶微波消融治疗的34例患者的临床资料。术前及术后均进行CTCs检测,并搜集患者临床特征。应用统计方法进一步分析研究。结果:微波消融术后,患者的CTCs测量值较术前升高,差异具有统计学意义(P=0.003)。对性别、年龄、微波治疗部位（同转移部位）、微波术前后CTCs变化状况、微波术后CTCs数目与随访截止时期患者生存状态进行分析后得出:女性患者在随访截止时期的生存状态优于男性,差异具有统计学意义（P=0.011）;微波术后CTCs数目＜7个/ml的患者生存状态优于术后CTCs数目≥7个/ml者,差异具有统计学意义（P=0.030）。而年龄（P=0.274）、微波治疗部位（同转移部位）（P=0.271）、微波术前后CTCs变化状况（P＝0.214）与随访截止时期患者的生存状态之间无统计学差异。结论:转移性结直肠癌的患者CTCs数目在微波消融术后会增加;女性患者在随访截止时期的生存状态优于男性;微波术后CTCs数目＜7个/ml的患者生存状态优于术后CTCs数目≥7个/ml者;年龄、微波治疗部位（同转移部位）、微波术前后CTCs变化状况与随访截止时期患者疾病状态不相关。     

Historical perspective: Two decades of progress in treating metastatic colorectal cancer

Colorectal cancer is the third most commonly diagnosed cancer in the United States. While screening methods strive to improve rates of early stage detection, 25% of patients have metastatic disease at the time of diagnosis, with the most common sites being the liver, lung, and peritoneum. While once perceived as hopeless, the last two decades have seen substantial strides in the medical, surgical, and regional therapies to treat metastatic disease offering significant improvements in survival.