过表达FOXF2对人宫颈癌SiHa细胞迁移及增殖影响机制探讨

目的 探讨过表达叉头框转录因子F2(FOXF2)调控HPV早期基因区6(early region,E6)和早期基因区7(early region,E7)抑制人宫颈癌SiHa细胞迁移、增殖的影响及其作用机制.方法 构建慢病毒转染SiHa细胞,实验分为对照组和实验组,qRT-PCR和蛋白质印迹法检测过表达慢病毒对照组及实验...     

miR-760 在宫颈鳞状细胞癌组织和细胞中的表达及其对SiHa 细胞恶性 生物学行为的作用

[摘要] 目的: 探讨微小RNA（miR）-760 在人宫颈鳞状细胞癌（CSCC）组织和细胞中的表达及其对SiHa 细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移、EMT影响的分子机制。方法: 选用2015 年4 月至2018 年8 月山东省聊城市妇幼保健院妇科手术切除、经病理确诊的80 例CSCC组织及相应的癌旁组织标本和40 例子宫肌瘤切除术获取的正常宫颈组织标本,应用qPCR检测CSCC组织、癌旁组织和正常宫颈组织、人CSCC细胞系SiHa、HCC94 和人宫颈鳞状上皮永生化细胞株H8 中miR-760 的表达水平,分析miR-760 表达与CSCC患者临床病理特征的相关性。用脂质体转染法,将miR-760 mimics 和NC-mimics 质粒分别转染至SiHa 细胞,用qPCR检测SiHa 细胞中miR-760 的表达,用CCK-8 实验和流式细胞术分别检测SiHa 细胞增殖能力和凋亡水平,用Transwell 实验检测SiHa 细胞的侵袭和迁移能力,WB检测SiHa 细胞EMT相关蛋白上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）和神经型钙黏蛋白（N-cadherin）的表达变化。用生物学信息法预测FOXA1 与miR-760 的靶向关系,用双荧光素酶报告基因验证miR-760 对FOXA1的直接靶向调控作用。结果：CSCC组织中miR-760 表达明显低于癌旁组织及正常宫颈组织（均P<0.01）,miR-760 表达与患者淋巴结转移和临床分期密切相关（均P<0.01）。SiHa、HCC94 细胞中miR-760 的表达明显低于H8 细胞（均P<0.01）。通过转染miR-760 mimics 上调miR-760 表达,能够显著抑制SiHa 细胞的增殖能力和侵袭、迁移能力（均P<0.01）、促进其凋亡（P<0.01）,并上调Ecadherin的表达（P<0.01）、下调vimentin 和N-cadherin 的表达（均P<0.01）。FOXA1 是miR-760 的直接靶基因（P<0.01）,上调miR-760 表达显著抑制SiHa 细胞中FOXA1 mRNA和蛋白的表达（均P<0.05）。结论：在CSCC组织和细胞中miR-760 低表达,其通过靶向作用FOXA1 基因调控SiHa细胞的增殖、侵袭、迁移并促进凋亡,同时影响癌细胞的EMT进程。     

干扰MAP2基因表达对胶质瘤细胞生物学特性的影响

目的:通过RNA干扰降低胶质瘤细胞中MAP2表达后观察其对胶质瘤细胞生物学特性的影响。方法:RT-qPCR和Western blot测定胶质瘤细胞Hs683、U251中MAP2的基因和蛋白表达。构建shRNA MAP2质粒,转染胶质瘤细胞,筛选出MAP2低表达的胶质瘤细胞,并经Western blot验证。对转染后胶质瘤细胞行MTT检测细胞活性、PI-FACS检测细胞周期、Annexin V-APC单染法行细胞周期检测、Transwell实验检测细胞的迁移能力,并使用Western blot测定转染后胶质瘤细胞中α-管蛋白和乙酰化α-管蛋白的含量。结果:转染shRNA MAP2后胶质瘤细胞中MAP2的蛋白表达显著降低。分子生物学实验显示转染shRNA MAP2后胶质瘤细胞的活性降低、凋亡增加、细胞迁移能力下降、细胞周期有所变化但无特异性,代表微管稳固性的乙酰化α-管蛋白含量基本不变。结论:RNA干扰降低胶质瘤细胞Hs683、U251中MAP2表达后,能降低细胞活性、增加凋亡、降低细胞迁移能力,但这些变化似与微管的稳固性无关。     

过表达巨噬细胞移动抑制因子对子宫颈癌SiHa细胞上皮间质转化的影响

目的 探讨过表达巨噬细胞移动抑制因子（MIF）对子宫颈癌SiHa细胞发生上皮间质转化 （EMT）的影响.方法 应用基因转染方法将重组质粒pEGFP-N1-MIF转入SiHa细胞,构建过表达MIF的SiHa细胞;用实时荧光聚合酶链反应（RT-PCR）及免疫细胞化学方法分别检测各组细胞中E-cadherin、vimentin mRNA及蛋白的表达水平.结果 RT-PCR检测结果显示,转染pEGFP-N1-MIF的细胞中MIF mRNA相对表达量升高（F=2950.278,P＜ 0.01）;转染pEGFP-NI-MIF的细胞中vimentin的mRNA高于各对照组,而E-cadherin的mRNA低于各对照组（F值分别为2 135.048,1 893.563,均P＜0.01）;转染pEGFP-N 1-MIF的细胞中vimentin的蛋白表达水平高于各对照组,而E-cadherin的蛋白表达水平低于各对照组（F值分别为2 348.021,1 789.421,均P＜ 0.01）.结论 过表达MIF促进SiHa细胞中vimentin表达,抑制E-cadherin表达,说明过表达MIF促进子宫颈癌SiHa细胞发生上皮间质转化.     

丹皮酚协同顺铂抗人宫颈鳞癌SiHa细胞及其机制

[目的]探讨丹皮酚（paeonol,Pae）和顺铂（CDDP）联合用药对人宫颈癌SiHa细胞的增殖抑制、凋亡诱导作用。[方法]应用MTT法检测不同浓度的Pae或CDDP单独及联合用药对宫颈癌SiHa细胞增殖的抑制作用,同时观察Pae与CDDP的协同抗肿瘤作用。流式细胞仪测定Pae联合CDDP用药对SiHa细胞凋亡的诱导作用。[结果]各浓度Pae（9.375～300mg/L）和CDDP（0.625～10mg/L）对人宫颈癌SiHa细胞均有明显增殖抑制作用,且呈时间—剂量依赖效应关系。18.75、37.5、75mg/LPae分别与2.5、5、75mg/LCDDP联用时具有协同作用,且以75mg/LPae与5mg/LCDDP联用时协同作用最显著（CDI=0.544）。75mg/LPae组细胞凋亡率为8.26%±1.12%,5mg/LCDDP组细胞凋亡率为29.62%±2.48%,与75mg/LPae联合5mg/LCDDP组细胞凋亡率（52.49%±4.39%）比较均有显著性差异（P〈0.01）。[结论]Pae与CDDP联合应用具有显著的协同抗人宫颈癌SiHa细胞增殖作用,其机制可能与两者协同诱导SiHa细胞凋亡有关。     

过表达FOXK2 对卵巢癌SK-OV-3 细胞恶性生物学行为的影响

目的：探讨过表达叉头框转录因子FOXK2 对人卵巢癌SK-OV-3 细胞增殖、迁移、侵袭、黏附等的影响及相关分子机制。方法：将FOXK2 基因编码序列克隆到慢病毒表达载体,在HEK293T细胞中包装慢病毒并感染人卵巢癌SK-OV-3 细胞,用qPCR和Western blotting 检测过表达效果,用CCK-8 法、细胞划痕愈合、Transwell 和细胞黏附实验分别检测细胞的增殖、迁移、侵袭和黏附能力,用qPCR 检测细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）标志物表达水平。结果：成功构建了FOXK2 基因过表达载体并包装成慢病毒,将该慢病毒成功感染了SK-OV-3 细胞并使FOXK2 的表达水平显著上调（P<0.01）。过表达FOXK2 后,SK-OV-3 细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著降低、黏附能力显著升高（P<0.05 或P<0.01）,E-cadherin 和β-catenin表达水平显著升高而vimentin 和fibronection 表达水平显著降低（均P<0.01）。结论：过表达FOXK2 基因导致卵巢癌SK-OV-3 细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著降低、黏附能力显著升高,其分子机制可能是阻止肿瘤细胞的EMT进程,FOXK2 可能是卵巢癌诊疗的一个潜在靶标。     

GBX2过表达促进人宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移及侵袭

[摘要] 目的：探讨GBX2 基因在人宫颈癌SiHa 细胞增殖和侵袭转移中的作用及其机制。方法：应用质粒转染技术,分别将过表达GBX2 基因重组质粒pCMV6-entry-GBX2（实验组）及空载体质粒pCMV6-entry（阴性对照组）转染到宫颈癌SiHa 细胞中,用WST-1 法、集落形成实验、流式细胞术分别检测转染细胞的增殖、集落形成和细胞周期,用划痕愈合实验、Transwell 实验检测细胞的迁移、侵袭能力,用ELISA 法检测细胞培养上清中IL-6 的表达水平,用WB检测EMT相关蛋白的表达变化并探讨其可能的作用机制。结果：与SiHa/pCMV6 组相比,上调GBX2 表达后：（1）SiHa/GBX2 组细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力明显增强（均P<0.01）,G0/G1 期的细胞比例减少、S期与G2/M期的细胞比例增加（均P<0.01）;（2）SiHa/GBX2 组细胞EMT相关蛋白上皮钙黏蛋白表达水平下降,神经钙黏蛋白、波形蛋白和snail 表达水平上调（均P<0.01）;（3）SiHa/GBX2 组细胞培养上清中IL-6 的表达水平明显增高（P<0.01）;（4）SiHa/GBX2 组细胞STAT3 磷酸化水平增强,并能被STAT3 抑制剂S31-201 抑制（P<0.01）。结论：GBX2可能通过IL-6/STAT3 通路诱导宫颈癌SiHa 细胞EMT,从而促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。     

MicroRNA-375表达对大肠癌细胞生物学特性的影响

目的:研究构建miRNA-375慢病毒表达载体并转染结直肠癌细胞,探讨其对结直肠癌细胞生物学特性的影响.方法:采用qRT-PCR法检测结直肠癌细胞株中miRNA-375表达水平.构建FUA-ZMCS-EF1-EGFP-miR-375/inhibitor慢病毒表达载体,建立稳定过表达miRNA-375及其抑制剂的HCT-116亚细胞系,体外观察细胞生长速度并绘制生长曲线,流式细胞仪检测细胞凋亡率,划痕实验检测miRNA-375对HCT-116细胞迁移能力的影响,Western blot法检测miRNA-375对细胞内ERK磷酸化水平的影响.结果:结直肠癌细胞株中miRNA-375低表达不但能促进细胞生长、抑制细胞凋亡,而且能促进细胞内ERK磷酸化水平、增加细胞迁移力和侵袭力.结论:结直肠癌miRNA-375发挥抑癌基因的作用,为miRNA-375在结直肠癌基因诊断及治疗中的应用提供了实验依据.     

过表达间隙连接蛋白43表达对宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响

目的探讨过表达间隙连接蛋白43(Cx43)对宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响。方法选取2015年1月至2017年12月间深圳市龙岗区第三人民医院收治的31例宫颈癌患者,手术切除的经病理诊断明确为宫颈癌的组织及配对癌旁组织,采用RT-qPCR法检测宫颈癌组织及癌旁组织中Cx43的表达水平。设计过表达Cx43的慢病毒载体及阴性对照,采用RT-qPCR法检测宫颈癌细胞中Cx43的表达水平,CCK-8实验检测细胞在不同时间点的增殖能力,划痕实验检测细胞的迁移能力,Transwell实验检测细胞的侵袭能力,Caspase-3检测细胞的凋亡。结果 RT-qPCR显示,与癌旁组织相比,Cx43在宫颈癌中表达降低,差异有统计学意义(P <0. 01)。宫颈癌细胞过表达组的Cx43表达均增加,差异均有统计学意义(均P <0. 01)。Cx43表达上调后,宫颈癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力明显下降,细胞凋亡增加,差异均有统计学意义(均P <0. 01)。结论相较于癌旁组织,Cx43在宫颈癌组织中低表达。Cx43在宫颈癌中起到抑癌作用,可作为宫颈癌的治疗靶点。     

四乙胺对宫颈癌SiHa细胞增殖及电压门控钾通道的抑制效应

背景与目的:多种钾通道涉及恶性肿瘤细胞增殖的调控,为了探讨电压门控钾通道对宫颈癌细胞增殖的影响,本研究以人宫颈癌细胞SiHa为研究对象,观察电压门控钾通道阻滞剂四乙胺(tetraethylammonium,TEA)对肿瘤细胞增殖和钾离子电流的作用。方法:以TEA作用于体外培养的SiHa细胞,通过MTT法、Hoechst33258染色、流式细胞术及全细胞膜片钳技术,分别检测TEA对肿瘤细胞的增殖、细胞凋亡、细胞周期及细胞膜电压门控钾通道的影响。结果:TEA对SiHa细胞的增殖抑制效应具有时间依赖与剂量依赖的特点,并能诱导细胞凋亡、使细胞周期阻滞于G0/G1期,10mmol/LTEA可将峰值外向钾离子电流显著降低[(260±12)pAvs.(58±6)pA,P<0.01]。结论:电压门控钾通道对SiHa细胞增殖的调控具有重要作用,阻断电压门控钾通道可抑制SiHa细胞增殖。     

番茄红素对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究番茄红素(Lycopene,LP)对人肝癌HepG2细胞生长的影响并初探其机制。方法取对数生长期HepG2细胞设空白对照组、LP(5 μg/mL)组、LP(10 μg/mL)组、LP(20 μg/mL)组和顺铂(40 μg/mL)组,每组设10个复孔;各组分别给药干预48 h后,噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖抑制率,流式细胞术(FCM)检测细胞周期和细胞凋亡状况,RT-PCR法检测Bax mRNA和Bcl-2 mRNA表达,Western blot法检测Caspase-3蛋白表达。结果 与空白对照组比较,经LP(10 μg/mL、20 μg/mL)或顺铂40 μg/mL干预48 h能够显著提高HepG2细胞增殖抑制率,延长细胞周期中G₀/G₁期而缩短G₂/M期,提高细胞凋亡率,上调促凋亡Bax mRNA表达并下调抑凋亡Bcl-2 mRNA表达,提高Bax/Bcl-2比值,上调Caspase-3蛋白表达,LP上述作用具有一定的剂量依赖性。结论 LP具有抑制人肝癌HepG2细胞增殖并促进其凋亡的作用,其机制可能与LP干预细胞周期分布和调节凋亡相关基因蛋白表达有关。     

Claudin-2蛋白在食管鳞癌组织中的表达及其对KYSE450细胞恶性生物学行为的影响

目的:分析Claudin-2蛋白在食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)组织中的表达及其与患者临床病理特征、5年生存率的关系,探索其对ESCC细胞KYSE450的增殖、迁移和侵袭的影响.方法:选取河南省肿瘤医院2010至2013年间初治的ESCC患者手术切除肿瘤组织5...     

RNA干扰Nrf2表达对食管癌生物学行为的影响

目的 探讨RNA干扰核因子E2相关因子2（Nrf2） 对食管癌细胞生物学行为的影响。方法 建立RNA干扰下调Nrf2 表达的Eca-109食管癌细胞（Si-Nrf2）,并构建阴性对照组细胞（Si-control）。MTT法、平板克隆形成实验、流式细胞术、Transwell小室实验及Western blotting法检测下调Nrf2表达对食管癌细胞增殖、凋亡及侵袭转移、细胞放射敏感性及相关蛋白表达的影响。结果 转染48h 后,Si-Nrf2细胞中Nrf2蛋白相对表达量为0.209±0.013,Si-control细胞中则为0.852±0.077,两者差异具有统计学意义（P＜0.05）。与Si-control细胞比较,下调Nrf2 表达水平后的Si-Nrf2细胞的增殖能力明显减弱、细胞凋亡增多、侵袭转移能力降低,放疗敏感性增高,血红素加氧酶（HO-1）、抗凋亡蛋白Bcl-2、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）蛋白的表达量明显下调（P＜0.05）。结论 Nrf2可能通过调控HO-1、Bcl-2及MMP-9蛋白表达参与食管癌细胞增殖、凋亡、侵袭转移及放疗敏感性这一生物学过程。     

ER和PR在子宫颈的分布及其与宫颈鳞癌的关系

目的 :检测雌激素受体 (ER)、孕激素受体 (PR)在正常子宫颈的分布 ,并探讨ER和PR的表达状态与宫颈鳞癌的发生发展及预后的关系。方法 :采用SP免疫组化方法对 2 1例正常宫颈 ,40例宫颈上皮内瘤变 (CIN)及 71例浸润性宫颈鳞癌进行ER、PR检测。结果 :正常宫颈ER、PR主要在鳞状上皮、腺上皮及间质细胞核表达 ,且三者表达状态基本一致 ,CIN鳞状上皮及浸润性宫颈鳞癌ER、PR核表达率明显降低。结论 :ER、PR核表达下调或缺失可能是宫颈鳞癌发生的一重要机制。     

miR-21与舌鳞癌SCC9细胞干细胞样特性及顺铂敏感性的实验研究

目的 观察舌鳞癌SCC9细胞干细胞样特性、顺铂敏感性以及miR-21表达对其影响。方法 选取人舌鳞癌SCC9细胞分别通过贴壁、悬浮培养法培养获得SCC9a和SCC9f细胞;体外转染法将miR-21 mimics、miR-21 inhibitor分别转染至SCC9f细胞,设为SCC9m和SCC9i细胞。实时荧光定量PCR（QPCR）法检测干细胞相关转录因子（Oct3／4、Sox2、Nanog）及miR-21表达水平,ALDEFLOR kit检测ALDH阳性细胞的比例。MTT法、Annexin V／PI双染法分别检测顺铂对舌鳞癌细胞增殖及凋亡的影响。结果 SCC9f细胞中Oct3／4、Sox2和Nanog表达以及ALDH阳性比例高于SCC9a细胞（P＜0.05）。顺铂对SCC9f细胞的增殖抑制率、凋亡率均低于SCC9a细胞。miR-21表达在SCC9f细胞中高于SCC9a细胞（P＜0.05）,而在SCC9m、SCC9i细胞中表达分别较SCC9f细胞明显升高与降低（均P＜0.05）。Oct3／4、Sox2和Nanog在SCC9m细胞中表达高于SCC9f细胞,其中Oct3／4上调差异具有统计学意义（P＜0.001）;而Oct3／4、Sox2和Nanog在SCC9i细胞中表达均较SCC9f细胞呈显著下调（P＜0.05）。SCC9a、SCC9m和SCC9i细胞中ALDH阳性率分别与SCC9f细胞中ALDH阳性率比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）。SCC9m、SCC9i细胞的凋亡率分别较SCC9f减低与增高（均P＜0.05）。结论 舌鳞癌SCC9细胞采用悬浮培养法培养获得的SCC9f细胞具有干细胞特性,对顺铂更为耐受;抑制miR-21表达可增强SCC9细胞对顺铂的敏感性,可能与miR-21调节其肿瘤干细胞相关转录因子表达有关。     

斯钙素2对口腔鳞癌细胞的作用及机制研究

背景与目的：口腔颌面部恶性肿瘤中约80%以上为口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC),虽过去的几十年诊断及治疗技术不断改进,其存活率却没有得到明显改善,5年生存率仍小于50%。该研究旨在探讨斯钙素2(stanniocalcin 2,STC2)对口腔鳞癌细胞KB的增殖、凋亡及侵袭迁移的影响。方法：构建STC2的RNA干扰载体,将其转染KB细胞使STC2基因沉默后,采用CCK8实验检测STC2对KB细胞增殖的影响,通过APC Annexin V/7-AAD染色、流式细胞术检测细胞凋亡情况,分析STC2对细胞凋亡的影响。细胞划痕和细胞小室(Transwell)试验分析比较STC2基因沉默后对口腔鳞癌细胞侵袭和迁移的差异。最后用蛋白[质]印迹法(Western blot)检测凋亡、转移相关蛋白。结果：成功构建KB细胞STC2敲除细胞系,CCK8增殖实验结果显示,STC2沉默后,细胞增殖被明显抑制,其生长速度低于对照组(P<0.001)。在顺铂诱导细胞凋亡过程中,STC2沉默后KB细胞凋亡一定程度被促进。与KB细胞相比,STC2沉默后的细胞迁移和侵袭性明显减弱。Western blot检测发现,沉默STC2后Bcl-2、促细胞迁移和侵袭蛋白Caveolin-1和β-catenin表达下调,bax表达上升。结论：STC2可能参与调控口腔鳞癌细胞KB的增殖凋亡,促进KB细胞的侵袭转移能力,同时一定程度上减弱KB对化疗药物顺铂的敏感性。