SM-PCR技术检测血浆ctDNA在晚期肺腺癌患者治疗中的应用

  目的  探讨单分子PCR（single molecule-PCR，SM-PCR）技术检测血浆ctDNA在晚期肺腺癌患者治疗中的应用。  方法  分析2017年6月至2018年5月就诊于天津医科大学肿瘤医院的晚期肺腺癌患者30例，使用SM-PCR技术富集血液样本目标基因（EGFR、KRAS、BRAF、ALK、HER2、TP53）区域的ctDNA片段，构建测序文库，进行高通量测序；使用基于扩增阻滞突变系统（amplication refractory mutation system，ARMS）实时荧光PCR法进行肿瘤组织样本EGFR检测，比较血浆与组织表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变检测结果的一致性。  结果  SM-PCR与ARMS-PCR两种方法检测结果一致性较好（Kappa= 0.867，P < 0.001）；McNemar检验亦提示检测结果差异无统计学意义（P=0.500）。  结论  SM-PCR技术可用于血浆EGFR突变检测，其目标检测位点更全面，且可同时检测多种突变，分析结果更为精细，可实现绝对定量。      

晚期非小细胞肺癌EGFR突变与18F-FDG PET/CT代谢参数的相关性及其对预后评估的影响

  目的  探讨晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者18F-FDG PET/CT代谢参数及临床资料与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突变状态的相关性。同时探究EGFR基因突变状态对PET/CT代谢参数评估晚期NSCLC患者预后的影响。  方法  回顾性分析2017年1月至2018年12月在重庆医科大学附属第一医院接受18F-FDG PET/CT检查并有EGFR基因突变检测  结果  的109例晚期NSCLC患者。根据患者EGFR基因检测  结果  分为EGFR突变型组（n=48）与EGFR野生型组（n=61）,比较两组间PET/CT代谢参数及临床信息的差异并分析其与EGFR突变状态的关系。随访患者的无进展生存（progression free survival,PFS）状态,分析EGFR突变状态对PET/CT代谢参数评估PFS的影响。  结果  多因素Logistic分析发现,女性（OR=12.154,P < 0.001）、腺癌（OR=4.822,P=0.019）、低最大标准摄取值（maximum standardized uptake value,SUVmax）（≤9.58,OR=4.347,P=0.005）是EGFR突变的独立预测因子。ROC生存曲线分析肿瘤代谢体积（metabolic tumor volume,MTV）（AUC= 0.749,P=0.000 2）,糖酵解总量（total lesion glycolysis,TLG）（AUC=0.747,P=0.000 3）对患者的PFS状态具有预测价值。Cox回归分析发现,在EGFR基因突变型组中,MTV>14.85的患者疾病进展风险更高（HR=2.724,P=0.004）;EGFR野生型组中,MTV>12.48的患者疾病进展风险更高（HR=3.195,P=0.002）。  结论  对于晚期NSCLC患者,EGFR突变与更低的FDG摄取相关,体积代谢参数具有重要的预后预测价值,但对于EGFR基因突变不同状态,可以考虑不同的标准。      

Super-ARMS法检测肺腺癌患者血浆循环肿瘤DNA表皮生长因子受体T790M基因突变的临床研究

  目的  探讨真实世界中Super-ARMS法检测肺腺癌患者外周血标本循环肿瘤脱氧核糖核酸（circulating tumor DNA,ctDNA）中表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）T790M基因突变的临床应用价值。  方法  收集2019年1月至2020年6月在首都医科大学附属北京胸科医院确诊的肺腺癌患者307例,突变扩增系统（amplification refractory mutation system, ARMS）检测组织中EGFR基因突变情况,Super-ARMS法检测血浆中EGFR的基因突变情况。通过生存分析比较不同标本检测EGFR T790M基因突变患者的无进展生存时间（progression-free survival,PFS）。  结果  153例患者疾病进展接受再活检。74例进行组织再活检,其中34例（45.9%）检测到EGFR T790M基因突变。141例患者进行液体再活检,其中51例（36.2%）EGFR T790M基因突变。Kaplan-Meier生存分析显示,组织和外周血EGFR T790M突变阳性患者接受第三代EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs）的中位PFS比较差异无统计学差异（16.3个月 vs. 11.4个月,x2=1.138,P>0.05）。组织和外周血EGFR T790M突变阴性患者未接受第三代EGFR-TKIs治疗的中位PFS比较差异无统计学意义（7.0个月 vs. 7.0个月,x2=0.470,P>0.05）。  结论  真实世界中Super-ARMS法检测外周血标本有望应用于检测EGFR T790M 基因突变情况,外周血标本可一定程度上补充组织标本检测EGFR T790M基因突变结果,预测患者对第三代EGFR-TKIs治疗的疗效。      

肺腺癌患者中EGFR突变与肺结核的相关性研究

  目的  研究肺腺癌患者中表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突变与肺结核在肺腺癌中的相关性。  方法  采用PCR扩增及基因测序方法检测506例肺腺癌患者EGFR基因突变情况,分析其与肺结核之间的关系,进一步使用Kaplan-Meier法进行生存分析并行Log-rank检验。  结果  506例肺腺癌患者中有218例患者存在EGFR突变,其中25例患者有感染肺结核病史。在肺腺癌患者中,有肺结核病史的患者EGFR基因突变率,尤其是外显子21缺失显著高于单纯肺腺癌者（P= 0.047,P=0.002）。肺腺癌与结核灶在同一肺叶或同侧肺的患者EGFR基因突变率明显高于二者在不同侧肺,尤其是外显子21突变（P=0.020,P=0.030）。有肺结核病史患者的2年生存率明显高于单纯肺腺癌患者（P=0.039）,且在未经EGFR-TKIs治疗的具有肺结核史的患者中,EGFR突变组与野生型组相比,2年生存率无统计学差异（P=0.948）,经过EGFR-TKIs治疗的患者2年生存率亦差异无统计学意义（P=0.425）。  结论  肺腺癌患者中,有肺结核病史的患者EGFR基因突变发生率明显增高,且EGFR基因突变与其预后无关。      

靶向高通量测序在非小细胞肺癌中的临床应用

  目的  对8种与非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）个性化治疗高度相关的驱动基因进行检测,分析基因变异与临床病理特征的关系。  方法  收集天津医科大学肿瘤医院2016年6月至2017年8月212例NSCLC患者样本,对EGFR、KRAS、BRAF、ALK、MET、ERBB2、ROS1、RET 8种基因进行高通量测序。  结果  8种基因中EGFR基因变异率高达52.8%,其次为KRAS（8.5%）、ALK（8.0%）、ERBB2（6.1%）、MET（3.8%）、BRAF（1.4%）、RET（0.9%）、ROS1（0.9%）,75%样本检出至少1个驱动基因变异,驱动基因变异间呈现强烈互斥。最常见的EGFR突变为19外显子缺失和L858R突变,EGFR T790M突变与前面两个突变位点伴随出现。19外显子缺失患者携带非EGFR T790M突变比例低于L858R突变患者携带非EGFR T790M突变比例（P=0.04）。15.2%EGFR突变伴EGFR扩增,携带EGFR扩增且EGFR突变率 > 40%患者比例高于无EGFR扩增且EGFR突变率 > 40%患者（P < 0.01）。女性、不吸烟、腺癌患者易发生EGFR特别是EGFR敏感突变（P < 0.01）。肺腺癌（P=0.013）、临床分期晚（P=0.048）、淋巴结转移（P=0.027）患者携带EGFR扩增比例高。男性（P=0.009）、左侧肺癌（P=0.048）,吸烟患者（P=0.037）KRAS突变发生率较高。携带非KRAS突变、ALK融合的患者更年轻（P=0.005,P=0.031）,而携带KRAS突变患者年龄较高（P=0.055）。  结论  高通量测序可同时高效检测NSCLC患者中8种与靶向治疗相关驱动基因的变异谱,为临床医生的个体化诊疗提供参考,以多基因为基础的高通量测序为NSCLC诊疗提供更多的可能性。      

非小细胞肺癌原发灶与淋巴结转移灶中KRAS和EGFR基因状态的比较及其临床意义

  目的  比较表皮生长因子受体(EGFR)基因和KRAS基因在非小细胞肺癌原发灶及其淋巴结转移灶之间突变状态的差异, 并分析其与吉非替尼治疗非小细胞肺癌(NSCLC)疗效之间的关系。   方法  收集天津医科大学附属肿瘤医院2010年5月至2010年11月间手术切除的80例NSCLC病例标本, 利用直接测序和实时荧光定量PCR的方法分别检测原发灶和相应淋巴结转移灶中EGFR基因第18、19、20、21外显子及KRAS基因第12、13密码子的突变情况; 其中5例在淋巴结转移灶中检出EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)敏感型基因突变的患者接受了吉非替尼的新辅助靶向治疗。   结果  80例患者中, 检出原发灶携带KRAS和EGFR基因突变分别为1例和21例, 检出转移灶携带KRAS和EGFR基因突变分别为7例和26例; 分别有6例(7.50%)和7例(8.75%)患者其KRAS和EGFR基因状态在原发灶和转移灶之间不一致。直接测序法和实时荧光定量PCR法的检测结果一致。在5例接受吉非替尼治疗的患者中仅1例原发病灶中未检出EGFR-TKI敏感型基因突变, 并表现为疾病进展。   结论  部分NSCLC患者中KRAS和EGFR的基因状态在肿瘤转移过程中会发生改变, 在给予患者靶向治疗时不应忽视这一现象的存在。实时荧光定量PCR法比直接测序法更适用于临床的快速检测工作。      

非小细胞肺癌PTEN基因突变的临床特征

  目的  了解非小细胞肺癌中PTEN基因突变的分布状况及其临床特征。  方法  选取2003年9月至2009年12月间182例在广东省人民医院收治的非小细胞肺癌患者的手术或穿刺标本,抽提RNA后,逆转录成cDNA,再进行PCR扩增PTEN 1~9外显子及EGFR 18~21外显子,用直接测序法检测基因突变。  结果  182例标本中,PTEN基因的突变率为9.9%（18/182）,PTEN基因的突变率女性为6.5%,男性为11.0%（P=0.549）;吸烟者为13.0%,非吸烟者为6.7%（P=0.15）;腺癌为7.8%,鳞癌为9.9%（P=0.628）,差别均无统计学意义。常见的突变类型有点突变、插入突变及缺失突变,共11例,主要分布在第8外显子,也可见于第4、5、9外显子;其中10例为男性吸烟者,1例为男性非吸烟者;8例为鳞癌,1例腺癌,2例大细胞癌;此外,发现7例大片段缺失突变,缺失片段位于第1~7外显子,约250~539 bp碱基丢失,突变率为3.8%（7/182）,除了1例为大细胞癌外,其余6例均为腺癌;PTEN基因突变率与性别、吸烟状态分布无统计学相关性;其中4例大片段缺失伴随EGFR基因敏感突变。  结论  具有不同PTEN基因突变类型的NSCLC可能是两种不同的疾病类型,不同突变类型的PTEN基因在NSCLC中的作用机制不同。PTEN基因的大片段缺失可能是突变型EGFR对TKI原发耐药的原因之一      

血清癌胚抗原与非小细胞肺癌患者EGFR突变的关系及其对预后的影响

  目的  探讨血清癌胚抗原（CEA）水平与非小细胞肺癌患者EGFR基因突变的关系及预测价值,分析CEA水平对肺癌患者术后生存期的影响。  方法  选取2009年3月至2011年3月于天津医科大学肿瘤医院肺部肿瘤科行外科手术治疗的患者387例,术前行CEA等肿瘤标志物检测,术后常规行EGFR基因突变检测,分析CEA等肿瘤标志物与EGFR突变关系及其与患者预后的关系。  结果  全组患者中出现EGFR基因突变的患者共168例,突变阳性率43.4%,EGFR突变在女性、非吸烟、腺癌以及年龄 < 60岁的患者中更加常见（P < 0.05）,另发现EGFR突变情况与肿瘤标志物及化疗敏感性指标相关,EGFR野生型患者的Cyfra21-1、SCC升高、ERCC1阳性表达更常见（P < 0.05）,而EGFR基因突变患者的CEA升高则更常见（P=0.015）,并且随着CEA水平的升高,EGFR基因突变阳性率更高（血清CEA水平 < 5 μg/L、5~20 μg/L及>20 μg/L 3组的阳性率分别为40.1%、47.5%和66.6%,P=0.003）。Logistic回归分析发现CEA水平是预测EGFR基因突变的独立因素,并且血清CEA水平也是影响非小细胞肺癌患者预后的独立因素（CEA水平升高组与正常组2年生存率分别为75.9%和88.4%,P < 0.01）。  结论  血清CEA水平高低可以预测手术切除的非小细胞肺癌患者的预后,并且与非小细胞患者EGFR突变相关,可以初步指导EGFR突变情况。      

肿瘤标志物预测NSCLC患者EGFR突变概率数学模型的建立与评价

目的:利用血清肿瘤标志物建立预测非小细胞肺癌（NSCLC）患者表皮生长因子受体（EGFR）基因突变概率的数学模型，并评价其临床应用价值。方法:回顾性分析我院经病理学确诊的NSCLC患者107例，对组织标本采用扩增阻滞突变系统实时荧光定量PCR（ARMS-PCR）技术检测EGFR基因突变，采集外周静脉血用化学发光法检测血清肿瘤标志物水平。多因素回归分析筛选出EGFR突变的独立预测因子，建立Logistic回归模型。绘制受试者工作特征曲线（ROC）并计算曲线下面积（AUC），以评价模型准确性和临床价值。结果:107例NSCLC患者中43.9%为EGFR突变型，56.1%为EGFR野生型。Logistic回归分析显示吸烟史、CEA、CA199和CYFRA21-1在EGFR突变型和野生型组间差异有统计学意义，是EGFR突变的独立预测因子。由此建立预测模型:P=ex/(1+ex)，X=-3.664+（3.246×吸烟史）+（2.441×CEA）+（1.866×CA199）-（1.918×CYFRA21-1），e为自然对数；当截点P为0.478时，模型的敏感度为85.1%，特异性为65.0%。该模型的AUC为0.734（95%CI:0.637～0.830）。结论:非吸烟、CEA和CA199高表达及CYFRA21-1低表达是NSCLC患者EGFR基因突变的独立预测因子。由此建立的数学预测模型准确度较高，可为EGFR基因突变的预测提供有利帮助。     

非小细胞肺癌ROS1突变与EGFR突变及临床病理特征的关系

目的 探讨非小细胞肺癌（NSCLC）中ROS1融合突变与表皮生长因子受体（EGFR）突变及临床病理特征的关系。方法 采用实时荧光定量PCR（QPCR）检测2014年12月至2017年12月收治的3487例中国西北地区NSCLC患者ROS1基因的突变情况，同时采用ARMS法检测ROS1基因突变患者的EGFR基因突变情况，分析ROS1和EGFR共突变患者的临床病理特征。结果 3487例NSCLC患者中，ROS1基因突变54例（1.5％）。ROS1基因突变与年龄、性别、吸烟史、病理类型和临床分期有关（P＜0.05）。54例ROS1融合基因突变患者中有3例（5.6％）同时存在EGFR基因突变，其中19外显子缺失突变（19-del）2例，L858R突变1例。3例ROS1突变均为突变体2型（R2）。结论 中国西北地区NSCLC患者ROS1融合基因突变率为1.5％，与EGFR基因突变可以共存。     

免疫检查点抑制剂治疗EGFR-TKI耐药晚期非小细胞肺癌的疗效及不良反应

目的:探讨免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor,ICI)治疗表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)耐药晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的疗效及不良反应。方法:收集2015年1月至2019年3月在解放军总医院接受ICI治疗的EGFR-TKI耐药晚期NSCLC患者临床资料,采用统计学方法分析EGFR-TKI耐药晚期NSCLC患者免疫治疗疗效及不良反应,阐明临床特征与免疫治疗疗效和患者预后的关系。结果:联合治疗较单药治疗者肿瘤客观缓解率(objective response rate,ORR)显著提高(28.6%vs.7.1%,P<0.01)。肿瘤分化差、联合治疗及年龄>60岁者分别较肿瘤分化好(5.1个月vs.2.8个月,P=0.030)、单药治疗(6.8个月vs.2.3个月,P<0.001)及年龄≤60岁者(7.1个月vs.4.7个月,P=0.020)无进展生存期(progression free survival,PFS)延长。联合治疗、肿瘤治疗缓解者分别较单药治疗(26.9个月vs.7.1个月)、肿瘤稳定者和进展者(30.8个月vs.18.7个月vs.12.8个月)总生存期(overall survival,OS)延长(P<0.001)。多因素分析显示年龄>60岁和联合治疗是PFS独立保护性因素(P<0.001)。联合治疗组的总体不良反应发生率较单药治疗组升高,但≥3级不良反应发生率两组间无显著性差异(P=0.28)。结论:ICI单药治疗EGFR-TKI耐药晚期NSCLC患者的疗效较差,而联合治疗能显著提高疗效,改善患者的预后。尽管联合治疗的总体不良反应发生率较高,但大体上不良反应可控。     

非小细胞肺癌EGFR基因突变的临床意义研究

  目的   探讨非小细胞肺癌EGFR基因外显子突变与其临床病理特征的关系。   方法   利用ADx-ARMS?EGFR基因突变检测试剂盒,检测214例未接受过Gefitinib治疗的非小细胞肺癌患者组织中EGFR基因外显子18、19、20和21突变。   结果   非小细胞肺癌组织中EGFR基因总突变率为45.8%（98/214）,外显子18、19、20和21的突变率分别为0.93%（2/214）、22.0%（47/214）、2.3%（5/ 214）和20.6%（44/214）。另有2例19和21外显子双重突变。EGFR基因在肺腺癌组织中的总突变率为50.3%（93/185）明显高于肺鳞状细胞癌17.2%（5/29）（P=0.001）。EGFR基因在女性患者中的突变率57.0%（57/100）高于男性36.0%（41/114）（P=0.002）,EGFR基因在NSCLC淋巴结转移患者中的突变率（66.7%）显著高于无淋巴结转移患者（39.5%）（P < 0.05）,但EGFR基因突变率与肺癌患者的年龄、肿瘤分级和临床分期均无显著性差异（P>0.05）。   结论   中国肺癌尤其是肺腺癌患者存在EGFR基因的较高突变率,EGFR外显子19、21突变结合肺癌的临床病理特征有望成为评估TKI治疗非小细胞肺癌疗效的分子标志。      

血浆游离DNA中RERG和ZNF671甲基化在鼻咽癌检测中的临床意义

  目的  探究血浆游离DNA（cell-free DNA,cfDNA）中RAS样雌激素调节生长抑制剂（RAS-like estrogen-regulated growth-inhibitor,RERG）、锌脂蛋白671（zinc finger protein 671,ZNF671）甲基化在鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）检测中的临床意义。  方法  选取2020年2月至2021年3月琼海市人民医院确诊且未治疗的NPC患者106例作为NPC组、同期150例健康志愿者作为正常对照组、100例确诊为鼻咽部慢性黏膜炎的患者作为良性对照组;分析组织和血浆cfDNA中RERG、ZNF671启动子甲基化状态,采用受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线分析血浆cfDNA RERG、ZNF671启动子甲基化状态对NPC早期诊断的价值。  结果  NPC组血浆cfDNA RERG、ZNF671启动子甲基化率及甲基化程度显著高于良性及正常对照组（P<0.05）。经Kappa一致性检验,NPC组患者组织与血浆cfDNA中RERG（45.28% vs. 38.68%,Kappa值为0.788,P<0.001）、ZNF671（55.66% vs. 48.11%,Kappa值为0.791,P<0.001）启动子甲基化率检验结果的Kappa值为0.6～0.85,认为一致性较好。经ROC曲线分析,血浆cfDNA RERG和ZNF671启动子甲基化程度联合诊断NPC的灵敏度和特异性分别为98.1%、特异度88.8%,曲线下面积为 0.981,甚至优于肿瘤标志物癌胚抗原的单独诊断。  结论  联合检测血浆cfDNA中RERG、ZNF671启动子甲基化状态对NPC患者诊断有良好的临床价值。      

胸部CT特征对克唑替尼治疗晚期非小细胞肺癌疗效及预后的预测价值

  目的  探究治疗前胸部CT特征对克唑替尼（crizotinib）治疗晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者疗效及预后的预测价值。  方法  分析2014年1月至2017年3月经克唑替尼治疗的晚期NSCLC患者47例的临床资料。对其临床资料及治疗前胸部CT图像进行分析，根据实体瘤疗效评价标准（RECIST）1.1对治疗效果进行随访评价，并记录无进展生存期（progression-free survival，PFS）。  结果  所有患者的中位PFS为10个月。胸部CT特征与克唑替尼疗效无相关性（P>0.05）。单因素生存分析显示，肿瘤较大（P=0.009）、中央型（P=0.002）、存在实变（P=0.002）、存在胸腔积液（P=0.001）或存在癌性淋巴管炎（P=0.019）提示患者PFS较短。Cox多因素回归分析显示，病变位置（HR=3.219，95%CI:1.517~6.833；P=0.002）为独立预后预测因素。  结论  晚期NSCLC治疗前胸部CT特征对预测克唑替尼治疗预后具有一定的价值。      

PCR-SSCP检测非小细胞肺癌EGFR基因突变的筛检试验评价

  目的  评价PCR-SSCP筛检非小细胞肺癌(NSCLC)ECFR基因突变的临床应用潜力。  方法  分别采用DNA测序法和PCR-SSCP分析对一定数量的NSCLC标本进行EGFR基因突变检测, 以DNA测序结果为金标准, 计算PCR-SSCP法的灵敏度、假阴性率、特异度、假阳性率、约登指数、粗符合率、预测值和似然比等指标; 同时随机抽取20%的样本, 重新进行PCR-SSCP分析, 计算两次结果的Kappa指数值。  结果  PCR-SSCP分析的灵敏度为97.2%, 假阴性率为2.8%, 特异度为94.3%, 假阳性率为5.7%, 约登指数为0.915, 粗符合率为94.8%, 阳性预测值为77.8%, 阴性预测值为99.4%, 阳性似然比为17.1, 阴性似然比为0.5, 前后两次PCR-SSCP分析的Kappa指数值为0.81(P < 0.05)。  结论  PCR-SSCP检测NSCLC EGFR基因突变具有较高的真实性、可靠性和实用性。