慢性乙型肝炎患者肝组织乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的定量检测

目的 探讨肝组织乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(HBV CccDNA)水平与病毒复制、肝组织损伤的关系.方法 应用荧光定量聚合酶链反应(PCR)方法检测46例慢性乙型肝炎患者肝组织HBV CccDNA水平,同时检测肝组织和血清中HBV DNA、肝细胞乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎核心抗原(HBcAg)表达及肝功能.结果 将肝组织中HBVCccDNA定量水平分为低(＜104copies/mg)、中(104～106copies/mg)、高(＞106 copies/mg)3组,3组中HBsAg阳性表达差异无统计学意义,但105～106copies/mg和＞107copies/mg组HBcAg阳性表达高于＜104 copies/mg组,分别为105～106copies/mg组HBcAg表达14例(63.6%)和＞107copies/mg组7例(77.8%)vs＜104copies/mg组2例(13.3%)(P＜0.01);HBeAg阳性组肝组织中HBV CccDNA和肝组织总HBV DNA均显著高于HBeAg阴性组,分别为肝组织中HBV CccDNAHBeAg阳性组(8.72±1.94)log10 copies/mg vs HBeAg阴性组(6.54±1.56)log10 copies/mg;肝组织中HBV DNAHBeAg阳性组(7.45±1.82)1og10 copies/mg vs HBeAg阴性组(5.27±1.48)log10 copies/mg(均P＜0.01);肝组织中HBV CccDNA与肝组织总HBV DNA、血清HBV DNA呈正相关(均P＜0.05);而与肝组织炎症程度、肝纤维化程度、丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)无相关性.结论 肝组织中HBV CccDNA定量能准确反映病毒复制水平,但不能将其视为肝组织损伤的标志.     

实时定量PCR检测胃癌组织miR-20a及初步应用

目的建立检测人胃癌组织中miR-20a的实时荧光定量PCR方法。方法建立miR-20a标准曲线,评价该法检测的线性范围及灵敏度;对标准质粒扩增产物进行熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳检测以分析该法的特异性。取高、中、低3份不同浓度的标准质粒进行批内和日间变异系数(CV)的检测,分析该法的重复性。收集70例胃癌患者手术切除的癌组织和对应的癌旁组织,定量检测组织中miR-20a的表达水平。结果构建的实时荧光定量PCR法的灵敏度为101copies/μL,扩增的线性范围为101～109copies/μL;扩增产物的熔解曲线峰和电泳片段特异;3份不同浓度标准质粒定量检测的批内CV分别为6.33%、4.74%、5.89%,日间CV分别为9.45%、6.29%、7.48%。定量结果显示75.7%(53/70)胃癌组织中miR-20a的表达高于癌旁组织,差异有显著性(Z=-4.427,P<0.01)。结论建立的实时荧光定量PCR检测miR-20a的方法准确、快速、灵敏、特异,可用于胃癌组织中miR-20a的检测。     

鸭肝组织中DHBV cccDNA的实时荧光定量PCR方法的建立

目的 建立基于DHBV病毒正、负链缺口区设计引物、沉淀蛋白结合的DNA、酶切消化残留线性DNA的DHBVcccDNA荧光定量PCR方法.方法 根据DHBV cccDNA和rcDNA结构的不同,将引物设计在DHBV DNA负链缺口的两侧.采用十二烷基硫酸钾蛋白质沉淀法分离肝组织中cccDNA和rcDNA.并对提取的DNA进行紫外定量,按照每2UPSAD消化500ng cccDNA,计算PSAD的用量,酶切消化残存的线性DNA.以pBR322/2DHBV Core重组质粒为PCR标准品,通过优化反应体系和扩增条件,建立检测DHBV cccDNA的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,并进行方法学考察和实际应用.结果 优化的PCR扩增产物电泳后可见239 bp的DNA片段,与目标片段长度相同.标准曲线回归方程Y=-4.085 7X＋48.805,R2=-0.997 6.方法的灵敏度为103 copies/ml,线性范围可达103～108 copies/ml.方法特异性强,未检出DHV,HBV及E coli DNA.对已感染DHBV的鸭肝组织检测DHBV cccDNA,进行定量,含量从0.36～1733.08 copies/diploid genome.其中分布最广的是10～99 copies/dioploid genome.DHBV cccDNA占总DHBV DNA的比例平均仅为3.86％,范围从0.01％～13.3s％.结论 根据DHBV cccDNA与rcDNA的结构和理化性质的差异,设计能够特异性扩增DHBV cccDNA的荧光定量PCR方法,方法灵敏度高、特异度强,可广泛应用于DHBV和HBV抗病毒治疗策略的相关研究中.     

应用Pre-S1 Ag诊断HBV感染的可行性研究

目的 通过HBV Pre-S1抗原检测,结合乙肝HBsAg、HBeAg与HBV-DNA检测进行比较分析,研究Pre-S1抗原作为诊断乙肝患者的血清标志物的可能性.方法 用ELISA检测的HBsAg、HBeAg和HBV Pre-S1抗原,采用荧光定量PCR方法检测HBV核酸.结果 相对于其他模式,“大三阳”的HBV Pre-S1抗原的检出率较高(89.32％),乙肝病毒DNA的copies也较高;在90例在HBsAg(-)、HBeAg(-)患者中,检出3例HBV Pre-S1抗原(3.33％);恢复期的3091例患者中也检查出4例Pre-S1 Ag(+).结论 HBV Pre-S1抗原可作为一种HBV感染血清标志物,HBsAg(-)并不能作为无HBV感染的指标,Pre-S1检测对于乙肝患者的诊断具有重大的价值.     

慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA定量检测的临床意义

目的探讨慢性乙型肝炎患者病毒复制水平与HBV标志物(HBV-M)模式及肝损害程度的关系。方法180例慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA定量采用荧光标记定量PCR方法检测,HBV-M检测采用ELISA法。结果血清HBV DNA定量与HBV-M模式有关,血清HBeAg阳性组HBV DNA定量(106.35±1.84)显著高于HBeAg阴性组(104.73±1.88)(P<0.01),轻、中度乙肝患者HBV DNA定量(105.58±1.92,106.27±2.05)与重度患者HBV DNA定量(105.73±1.90)相比较差异无统计学意义,且不同HBV DNA水平患者的TB il、ALT、AST差异无统计学意义。结论血清HBeAg的存在影响HBV DNA的水平变化;肝损害程度与HBV DNA定量无显著关系;同时血清HBV DNA定量与TB il、ALT、AST水平无明显关系。     

核酸检测技术与酶联免疫检测技术在血液筛检中的初步应用比较

目的了解山东地区献血者的乙肝病毒感染状况并为今后开展常规核酸检测技术(NAT)检测提供实验依据。方法使用ELISA和NAT检测法筛选无偿献血者血液样本11334份,应用实时荧光定量PCR仪检测样本的HBV DNA含量。结果在11334份血液样本中发现HBsAg EIA和NAT同时阳性的样本237份,HBsAg EIA阴性但NAT阳性的样本7份和HBsAg EIA阳性但NAT阴性的样本23份。结论核酸检测能够提高HBV的检测灵敏度,荧光定量PCR仪可以应用于献血者的大规模筛选。     

实时荧光定量聚合酶链反应在HBV YMDD基因变异检测中的应用

目的以DNA测序法为标准,探讨实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测乙型肝炎(下称乙肝)病毒YMDD基因变异的敏感性和特异性。方法选取68例乙肝患者经拉米夫定治疗前及治疗9个月后其血清采用荧光定量PCR技术联合检测HBV DNA及YMDD变异,并随机选取10例(5例实时荧光定量PCR提示YMDD变异;5例提示未变异)慢性乙肝患者做DNA测序,分析二者的检测结果。结果拉米夫定治疗前HBVDNA的载量,两组相比差异无统计学意义(P>0.05),9个月后YMDD的变异率为14.7%(10/68);YMDD变异型组HBV DNA无l例阴转,YMDD野生型组HBV DNA阴转率为79.3%(46/58),差异有统计学意义(P<0.01);10例测序法所测结果与实时荧光定量PCR完全相符,总符合率为100.0%。结论实时荧光定量PCR技术联合检测HBV DNA及YMDD变异具有很好的临床应用前景。     

基于ddPCR技术分析EB病毒载量特征及与qPCR技术的比较研究

目的解决临床工作中应用实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测EB病毒(EBV)载量与临床诊断不符的问题,探讨微滴式数字PCR(ddPCR)和qPCR方法检测EBV载量的能力并为临床提供可能的解决方案。方法收集510例疑似EBV感染相关疾病患者血浆标本,采用ddPCR和qPCR两种方法测定同一血浆标本的EBV-DNA载量。结果 EBV感染人群中,EBV-DNA载量较其他地区低,载量中位数仅360copies/mL,其中初诊未治鼻咽癌患者中位病毒载量为4 590copies/mL,治疗后鼻咽癌患者中位病毒载量下降为430copies/mL,免疫力低下者中位病毒载量为130copies/mL,而淋巴瘤患者中位病毒载量为840copies/mL;qPCR检测EBV感染以400copies/mL为界值,高于400copies/mL时,ddPCR与qPCR的EBV-DNA测定水平值呈中度相关(r=0.533,P<0.05),低于400copies/mL时,ddPCR与qPCR的EBV-DNA测定水平值呈弱相关(r=0.299 5,P<0.05);以ddPCR为标准,qPCR检测EBV-DNA的灵敏度仅为0.317,以ddPCR检测结果为标准,构建qPCR的受试者工作特征曲线下面积为0.871,此时临界值(qPCR)为10copies/mL,灵敏度为0.824,特异度为0.780。结论采用ddPCR方法或优化qPCR的临界值去检测EBV-DNA载量更能为临床诊断EBV感染提供有利支持。     

乙肝患者尿沉渣细胞HBV DNA荧光PCR检测方法的建立

目的建立尿沉渣细胞内HBV DNA实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测方法,并研究其临床意义。方法采集10例慢性乙肝患者尿液,离心获得尿沉渣细胞,以患者自身单纯尿液作为对照,用细胞病毒裂解液分别提取沉渣细胞和单纯尿液HBV DNA,并用FQ-PCR分别检测HBV DNA含量。比较沉渣细胞和单纯尿液中HBV DNA含量。对1例乙肝肝癌并发尿毒症患者分析沉渣细胞的HBV DNA与血清HBV DNA含量变化分别与病情的相关关系。结果采用荧光PCR技术检测尿沉渣细胞HBV DNA,检测出低限值可达100 IU/10 ml尿液细胞,并且按稀释倍数呈理论梯度,相关系数为0.9。5次重复的CT值的CV值分别为5.2%、3.8%和4.6%,符合卫生部临床检验中心的偏差要求。尿沉渣细胞HBV DNA含量明显高于单纯尿液中的HBV DNA(P<0.05)。结论基于用荧光PCR的检测方法来测定尿沉渣细胞HBV DNA,操作简单,具有较好的敏感性和重复性,该指标对综合评价乙肝患者体内HBV DNA含量的变化具有一定的参考价值。     

HBeAg转阴前后慢性乙肝患者HBV cccDNA荧光定量检测的意义

目的探讨慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒(HBV)cccDNA检测的意义。方法检测乙型肝炎患者乙肝e抗原(HBeAg)转阴前后肝组织HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)、血清HBV DNA。用实时荧光定量PCR方法检测HBV DNA、cccDNA水平,通过质粒保护型的DNA酶对提取的DNA模板进行酶切处理,再分别进行HBV DNA和cccDNA的定量检测。结果HBeAg转阴前,慢性乙肝患者总HBV DNA水平和cccDNA水平呈正相关(r=0.911,P0.01);而HBeAg转阴后,血清HBV DNA水平和肝组织cccDNA水平的检测不一致。结论 HBV cccDNA可作为反映慢性乙肝患者抗病毒治疗预后的指标。     

Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction

Unlike quantitative polymerase chain reaction (qPCR), digital PCR (dPCR) achieves sensitive and accurate absolute quantitation of a DNA sample without the need for a standard curve. A single PCR reaction is divided into many separate reactions that each have a positive or negative signal. By applying Poisson statistics, the number of DNA molecules in the original sample is directly calculated from the number of positive and negative reactions. The recent availability of multiple commercial dPCR platforms has led to increased interest in clinical diagnostic applications, such as low viral load detection and low abundance mutant detection, where dPCR could be superior to traditional qPCR. Here we review current literature that demonstrates dPCR's potential utility in viral diagnostics, particularly through absolute quantification of target DNA sequences and rare mutant allele detection.     

PCR检测儿童微小残留白血病的研究进展

微小残留白血病（MRD）是指白血病经化疗缓解后在骨髓中仍存在形态上不能检测到的白血病细胞,是白血病复发的主要原因。儿童MRD的检测对判断儿童白血病的预后、制定白血病的治疗方案有重要意义。PCR方法在MRD检测中具有快速、特异、简便、经济和样本量少等特点。本文综述近年以多重PCR初筛白血病靶基因,以荧光定量PCR（FQ-PCR）追踪MRD方面所取得的进展。     

抗白色念珠菌抗体库构建中抗体基因的扩增和克隆

目的应用PCR方法从人血中克隆抗白色念珠菌抗体重链(VH)和轻链(VL,VK)可变区基因,重组到PGEM-llzf( )载体中,为构建抗白色念珠菌抗体库奠定基础。方法设计7条VHbank primer(5')和6条For primers(3')引物,9条VLbank primer(5')和2条For primers(3')引物,4条VKbank primer(5')和4条For primers(3')引物。从45名念珠菌病恢复期患者的外周血淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增人抗体重链(VH)和轻链(VL,VK)可变区基因。通过于linker链两端引入酶切位点,经T4DNA连接酶连接成完整的基因片段并重组到pgem-llzf( )载体中。结果经PCR方法扩增出了7条VH、9条VL和4条VK片断,经测序证实扩增片断全部为抗体可变区基因。经linker连接入pgem-llzf( )载体中,获得完整的重组基因。结论获得了全人源抗白色念珠菌单链抗体基因,为构建抗白色念珠菌抗体库奠定基础,也为研发有效治疗白色念珠菌和耐药性白色念珠菌的感染的药物提供了新的手段。     

人感染猪链球菌的病原学及分子生物学特征的研究

目的对人感染猪链球菌的病原学及其分子生物学特征进行研究。方法将疑似猪链球菌感染患者血液、脑脊液进行增菌培养，对所分离的病原菌进行染色形态观察、A P I Strep20生化鉴定，并合成引物检测人感染猪链球菌特异性16SrRNA基因片段、2型猪链球菌特异性夹膜多糖编码基因片段cps2J、溶菌酶释放相关蛋白编码基因片段mrp、细胞外蛋白因子编码基因片段cf、溶血素基因片段sly以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因片段gapdh。结果将患者脑脊液中分离的病原菌，经A P I20Strep生化鉴定编码为0640473，证实为猪链球菌2型。PER扩增结果也证实是猪链球菌2型，基因测序结果与Genebank中注册的猪链球菌2型序列同源性在96％以上。结论人感染猪链球菌的病原学及其分子生物学特征符合猪链球菌2型。     

长距离PCR检测重型血友病A病人凝血因子Ⅷ基因倒位

为了筛查山东省重型血友病A(hemophiliaA，HA)凝血因子Ⅶ基因倒位的患并检出携带，采用长距离DNA扩增(LD-PCR)方法，以0．6％琼脂糖凝胶电泳技术，检测临床上确诊的55例重型HA患及其家系成员中是否存在凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因倒位。电泳出现11kb带，示凝血因子Ⅷ基因倒位；12kb带，示非倒位；这两条带同时出现为凝血因子Ⅷ基因倒位携带。结果表明：55例无亲缘关系的重型HA患中，发现22例患(或家系成员)有凝血因子Ⅷ基因倒位，占重型HA患的40%；15个家系中查出基因倒位携带5名。结论：运用LD-PCR技术可以准确、简便、快速地检测重型血友病A患是否存在凝血因子Ⅷ基因倒位。     

类细菌样念珠菌变异株真菌保守基因检测

目的 揭示念珠菌类细菌样变异株的分子基础及其相应的生物学特性的分子基础.方法 采用常规PCR方法,对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、两株不同来源的白色念珠菌标准菌株及源自于这两株念珠菌标准菌株的类细菌样念珠菌变异株进行真菌最保守18S rRNA基因的检测.结果 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌无真菌基因表达;两株念珠菌标准菌株真菌基因为强表达;源自于念珠菌标准菌株的类细菌样念珠菌变异株真菌基因呈极弱表达.结论 念珠菌发生类细菌样变后,虽然生物学性状呈类细菌样改变,但仍部分表达真菌最保守基因.此结果也进一步证实了具有原核生物特性的类细菌样念珠菌变异株是源自于具有真核细胞特性的念珠菌.     

异基因造血干细胞移植患者FOXP3mRNA表达与移植物抗宿主病发生的关系

背景:转录因子FOXP3是调节性T细胞的特异性标志,对于造血干细胞移植后移植物抗宿主病的发生与FOXP3表达水平的关系目前仍存在争议.目的:观察异基因造血干细胞移植后患者外周血FOXP3 mRNA的表达,初步探讨利用FOXP3 mRNA表达水平的变化进行临床早期诊断移植物抗宿主病的可能性.设计:回顾性病例分析.对象:选取2001-03/2007-06在广东省人民医院血液科行异基因造血干细胞移植的白血病患者31例,男18例,女13例,平均年龄32岁.方法:所有患者均采用改良BU/CY联合FLU方案进行预处理,经深静脉输入单个核细胞数5.48(3.7～8.4)× 108/kg,CD34+细胞数10.45(3.6～28.0)×106/kg.移植后出现移植物抗宿主病的患者在治疗前、治疗好转或缓解时留取外周血标本,尚无移植物抗宿主病的患者复查时采集外周血标本.主要观察指标:采用实时定量PCR技术监测外周血样本FOXP3 mRNA表达及其与患者移植物抗宿丰病的发生情况.结果:31例患者行异基因造血干细胞移植后,9例末出现移植物抗宿主病,9例发生急性移植物抗宿毛病,13例出现慢性移植物抗宿主病.FOXP3表达水平的变化与急性移植物抗宿主病的临床演变相关,急性移植物抗宿丰病发生时FOXP3水平较临床无移植物抗宿主病时明显降低(P=0.009),好转后FOXP3水平又逐步升高或恢复到基础水平;慢性移植物抗宿主病患者FOXP3的表达水平与无移植物抗宿土病患者相比无明显差异(P=0.107).结论:急性移植物抗宿主病的发牛与FOXP3表达降低有关,动态检测FOXP3 mRNA表达水平的变化有可能为临床早期诊断急性移植物抗宿主病或预测其发生提供参考.实验数据末发现慢性移植物抗宿土病的发生与FOXP3表达有关.     

荧光定量PCR技术及其在临床上的应用

荧光定量PCR(FluorescenceQuantitivePolymeraseChainReactionFQ PCR)技术是在 90年代末期发展起来的一项全新技术。经过几年的实践及临床应用 ,已获得了较为稳定的检测效果。作为一种体外基因扩增技术 ,它能敏感地检测初始模板浓度及基因变异等情况。它的出现 ,克服了传统PCR技术普遍存在的假阳性及不能定量等问题 ,使得PCR技术更广泛地应用于临床 ,在监测患者病情、预后、指导用药等方面有着广阔的应用前景。本文概述了FQ PCR技术及其在临床上的应用 ,即常见病原体的检测[1,3 ] 及其在分子遗传学和法医学中的应用     

脆性组氨酸三联体(FHIT)基因外显子5,8纯合性缺失及突变与胃癌的关系

目的:探讨胃癌组织中抑癌基因FHIT外显子5.8纯合性缺失及突变情况。方法:采用外显子特异聚合酶链反应(PCR)及聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)-银染方法对30例胃癌和18例正常组织中FHIT基因外显子5,8的纯合性缺失和点突变显示检测和比较。结果:胃癌组织中FHIT基因外显子5、8总纯合性缺失率为23.3%,正常组织无一例缺失(P=0.011);外显子5、8纯合性缺失率分别为16.67%和13.33%(P>0.05);FHIT基因外显子5、8纯合性缺失与胃癌的分化程度、病理分期及淋巴结转移无显著性相关(P>0.05)。所有胃癌组织标本均未检测到外显子5,8的点突变。结论:提示FHIT基因外显子5、8纯合性缺失可能在胃癌的发生中起重要作用。而点突变不是FHIT基因失活的主要方式。     

异基因造血干细胞移植后慢性粒细胞白血病患者bcr-abl融合基因水平的动态变化

背景:bcr-abl融合基因不仅是慢性粒细胞白血病的诊断标准,其水平的变化也是判断病情或疗效的惟一指标,尤其是bcr-abl融合基因的动态变化对于异基因造血干细胞移植效果的评估和预后判断可能更为重要.目的:了解慢性粒细胞白血病患者异基因造血干细胞移植后bcr-abl融合基因水平的变化情况. 设计:回顾性病例分析.对象:2001-04/2007-01在广东省人民医院血液科收治的确诊1年内行异基因造血干细胞移植的慢性粒细胞白血病患者22例,中位年龄31.5岁,患者对治疗均签署知情同意书,治疗方案经医院医学伦理委员会批准.方法:所有同胞供者均采用粒细胞集落刺激因子行外周血干细胞动员.所有患者均采用改良BU/CY联合FLU预处理方案,供受者血型不相合者于移植前7 d、1 d行血浆置换以降低血型抗体滴度.患者经深静脉输入同胞供者平均单个核细胞数为5.48×108/kg,平均CD34 细胞数为10.45×106/kg.由于移植和随访时间不同,每例患者收集标本3～14份,共130份外周血标本.主要观察指标:通过实时荧光定量PCR法检测22例患者异基因造血干细胞移植后不同时间130份外周血标本中bcr-abl融合基因的水平.结果:移植后6个月内,bcr-abl融合基因总体水平逐渐降低,移植后1、3、6个月bcr-abl阴性患者的比例分别为33.33%、53.33%和84.62%,bcr-abl高水平阳性(bcr-abl/abl ≥ 0.02%)患者的比例分别为58.33%、33.33%和15.38%,低水平阳性(bcr-abl/abl < 0.02%)患者的比例分别为8.33%、13.33%和0.移植6个月后,多数患者连续多次检测不到bcr-abl融合基因,其中持续阴性者9例(69.23%),低水平波动者1例(7.69%),低水平持续阳性者1例(7.69%),复发2例(15.38%);复发的2例患者移植后6个月内连续检测bcr-abl融合基因水平均未降低至0,且3次检测结果中2次属于高水平阳性.结论:异基因造血干细胞移植后,慢性粒细胞白血病患者bcr-abl融合基因总体水平逐渐下降,但不同患者bcr-abl变化情况各异,通过实时定量PCR检测可明确其变化趋势.