刚地弓形虫主要抗原B细胞表位的筛选及鉴定

目的筛选刚地弓形虫主要抗原B细胞表位并在原核表达载体中表达,对纯化的表位重组蛋白进行免疫反应性鉴定。方法用计算机软件BioSun、DNAstar综合分析6个弓形虫主要抗原的亲水性、可及性、柔韧性、二级结构、极性参数等,每一抗原分子预测2个最佳表位,设计合成24条共12对寡核苷酸,两端分别引入NocI、XhoI酶切位点,退火形成的双链定向克隆至原核表达载体pET-32c中,EcoRI单酶切鉴定重组质粒Epitope/pET-32c。将含有Epitope/pET-32c的BL21单菌落接种至LB肉汤培养基中培养,导入表达。表达产物用Ni2 螯合柱亲和纯化,免疫印迹试验(Westernblot)分析重组表位蛋白与弓形虫抗原免疫血清的免疫反应性。结果成功构建了12个原核表达质粒Epitope/pET-32c,并经测序证实,在E.coliBL21有11个表位基因能有效表达重组融合蛋白;纯化的表位蛋白大小均在20.0kDa左右;Westernblot结果显示表位蛋白SAG2-A、SAG3-B能被弓形虫抗原免疫血清识别,且反应较强,SAG2-B为弱阳性,其余的则不能被识别。结论成功筛选到3个弓形虫B细胞表位基因,为进一步构建弓形虫复合表位抗原诊断弓形虫病奠定了基础。     

利用噬菌体展示技术筛选日本血吸虫模拟抗原表位

目的　从噬菌体肽库筛选日本血吸虫抗原模拟抗原表位。方法　制备亲和纯化的日本血吸虫病人血清抗体 Ig G,用此 Ig G包被酶标板对 12肽库进行反复淘选 ,对获得的目的噬菌体进行鉴定及免疫原性分析。结果　获得一批阳性噬菌体克隆 ,其中一部分与血吸虫病人血清反应产生较高的吸光值 ,Western blotting分析表明这些噬菌体能被血吸虫病人血清所识别 ,具有类似于血吸虫抗原的免疫原性。结论　获得一批具有模拟日本血吸虫抗原表位的噬菌体克隆 ,为今后进一步研究它们在血吸虫病诊断及疫苗研究中的作用奠定了基础。     

多房棘球蚴亮氨酸氨基肽酶优势抗原表位的鉴定

目的 根据预测多房棘球蚴亮氨酸氨基肽酶(Leucine aminopeptidase,LAP)抗原表位的结果,进一步鉴定其优势的T细胞和B细胞抗原表位.方法 构建重组质粒pCzn1-LAP后进行蛋白原核表达与纯化,将纯化的LAP蛋白进行动物免疫后,利用脾脏淋巴细胞增殖、流式细胞术、ELISA pot、ELISA等方法鉴...     

抗原优势表位的筛选方法

疫苗的出现有效降低了人类感染性疾病的发病率和死亡率。随着科学的进步和发展,发现原始的疫苗已经不能满足当今社会的需要。现代保护性免疫理论认为,有效的保护性免疫来源于一组表位的合理组合与搭配。近年来兴起的表位研制技术,是用抗原表位制备疫苗,它在感染性疾病和恶性肿瘤中有着自身独特的优势。因此如何在众多的表位中确定优势表位,已经成为研究的新方向。本文详细阐述了优势表位的筛选办法,对其最新的研究进展进行了综述。     

利用噬菌体展示肽库筛选和鉴定沙门氏菌O9抗原的模拟表位

目的　用生物素标记沙门氏菌O9单克隆抗体 (3- 4 7-O)作为分子探针 ,从两个九肽噬菌体展示文库中筛选鉴定该抗体所识别的抗原模拟表位 ,从而为模拟多糖的多肽疫苗或编码该模拟表位的DNA疫苗研制奠定基础。方法与结果　经过三轮的亲和筛选 ,得到了两个能与O9单抗反应的强阳性单克隆扩增物gm6 2和 gm6 8,其序列分别为SHHVRGGGG和YQKWYLPKS。竞争ELISA实验表明 ,10 10转导单位噬菌体 gm6 8对肠炎沙门氏菌与 3- 4 7-O结合的抑制率达到 6 5 % ,而噬菌体 gm6 2的抑制率仅为 2 0 % ,且 gm6 8可以诱导产生针对沙门氏菌O9的抗体 ,而gm6 2则不能。 结论　实验结果显示九肽YQKWYLPKS是具有免疫原性的O9抗原模拟表位。     

人工合成多表位抗原的研究进展

通过表位作图、表面展示及计箅机预测等技术确定抗原表位的序列,再通过基因工程技术将多个表位串联起来形成多表位抗原.目前,有关多表位抗原的研究已取得长足进步,该文对特异性表位的选择和鉴定、多表位抗原基因的分子设计和合成等方面的研究进展进行了综述.     

鼠疫菌抗原CTL表位预测方法的建立

目的 建市鼠疫菌抗原CTL表位的预测方法 ,为鼠疫菌表位组学研究提供行之有效的研究平台.方法 采用nHLAPred,BIMAS和SYFPEITHI网络预测法对IJcrV抗原的CTL表位进行预测.结果 预测得到了LcrV的特异性CTL优势表位:V8～16 NPQHFIEDL,V311～319 KYDSVMQRL和V258～264SYNKDNNEL.结论 结合小同预测方法 进行工细胞表位的预测,可得到鼠疫菌LcrV抗原的CTL表位,具有较高的准确率,可为表位网谱的绘制提供参考依据.     

Dhori病毒核蛋白抗原表位的筛选及鉴定

目的 研究鉴定DHOV核蛋白(NP)的最小线性B细胞表位(BCEs),为DHOV的疫苗研制和预防奠定基础。方法 本研究针对DHOV-GRT169毒株NP蛋白进行生物信息学分析,采用改良生物合成肽法鉴定其BCEs。首先将DHOV NP蛋白截短为4个片段并鉴定其抗原性,将阳性片段继续截短成相互重叠8个氨基酸的16肽,将16肽序列分别克隆至原核表达载体pXXGST-3中表达,兔抗融合蛋白NP蛋白多克隆抗体作为一抗,用Western blotting检测16肽的抗原性,将检测出的阳性16肽都截短成相互重叠7个氨基酸的8肽,用同样的方法诱导表达及检测。最后用生物信息学方法分析每个BCEs在NP蛋白三维结构中的位置。结果 从NP蛋白中最终鉴定出9个BCEs,分别为Enp1(³NPTPKR⁸)、Enp2(⁷KRAEPGD¹³)、Enp3(⁸³YUFFFL⁸⁸)、Enp4(¹¹¹NQTLTDE¹¹⁷)、Enp5(²²⁴QSQKAMLK²³¹)、Enp6(²²⁷KAMLKQIF²³⁴)、Enp7(⁴¹⁸LNAEFEEY⁴²⁵)、Enp8(⁴²¹EFEEYSKL⁴²⁸)、Enp9(⁴³²GTGAFYER⁴³⁹),均位于NP蛋白表面。结论 这些鉴定的表位将提高对DHOV表位分布和致病机制的认识,为DHOV多表位检测抗原的开发提供基础,也可为 DHOV感染与免疫机制研究提供理论依据。     

弓形虫多表位基因的构建及其在大肠杆菌系统中的表达鉴定

目的　构建弓形虫和破伤风毒素多个表位的编码基因 ,将其在大肠杆菌系统进行表达 ,评价重组抗原的特异反应性。方法　从弓形虫保护性抗原及通用免疫增强佐剂破伤风毒素中选取含有T和 (或 )B细胞表位的抗原片段 ,通过软件分析在各片段之间插入适当数目、起间隔作用的氨基酸 ,以保持个片段的空间构象独立性 ,从而确定氨基酸顺序。根据氨基酸序列选取适当的密码子构成弓形虫多表位基因。将该基因合成并鉴定后 ,亚克隆入原核表达载体 ,在大肠杆菌中表达并分析表达产物的表达形式和抗原活性。结果　成功构建了长度为 36 0bp的弓形虫多表位基因。该基因在原核表达系统中经诱导 ,得到了 14 4kDa的包涵体形式的表达产物。免疫印迹实验表明该产物具有强特异性抗原活性。结论　弓形虫多表位基因在原核中的表达产物在弓形虫病疫苗及诊断中有潜在的应用价值     

胃癌患者胃液中特异性荧光物质的初步确定

目的 从胃癌患者胃液中发现特异性荧光物质，并以此来获得肿瘤标志物。方法 收集10例胃癌患得与10例非胃癌患者的胃液，浓缩后行高效液相分析。并收集高效液相荧光光谱中保留时间为11.5-12.5min的荧光物质；再经质谱鉴定，所得结果与L-色氨酸的质谱比较，最终确定这种荧光物质的主要组分。结果 在高效液相的荧光光谱保留时间为11.5-12.5min时，胃癌患者胃液中的特异性荧光物质，其含量较其他胃内良性病变患者明显增多。经质谱鉴定后显示，胃癌患者胃液中质荷比为205的物质与L-色氨酸的三级质谱完全一致，证实该物质为L-色氨酸。结论 L-色氨酸是胃癌患者胃液中特异性荧光物质的主要组分。     

应用SELDI-TOF-MS技术建立肝癌筛选血清蛋白质指纹图谱模型

目的:建立肝癌筛选血清蛋白质指纹图谱模型．方法:用表面加强激光解析电离飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)及WCX2蛋白芯片获得新发肝癌、肝硬化患者和正常人血清的蛋白质指纹图谱,用计算机软件进行比较分析,建立肝癌的筛选模型．结果:肝癌患者与健康对照组血清蛋白质指纹图谱之间有5个标志蛋白(4477,8943,5181, 8617,13 761 Da)在肝癌患者血清中高表达,肝癌患者与肝硬化患者血清蛋白质指纹图谱之间2个标志蛋白(4477,13 761 Da)在肝癌患者血清中高表达,1个标志蛋白(4097 Da)在肝癌患者血清中低表达．SELDI-TOF-MS技术的特异性(60／60,100％);敏感度(18／20,90％)．分析系统筛选出4477,8943,13 761,4097 Da标志蛋白建立的肝癌诊断模型．结论:建立的血清蛋白质指纹图谱模型能够区分肝癌与非肝癌患者,SELDI-TOF-MS在肝癌的诊断及肿瘤特异性蛋白质生物标志分子的筛选等方面具有一定价值．     

液相串联质谱法定量检测高密度脂蛋白中脂质类化合物

目的本文旨在建立一种快速提取高密度脂蛋白(HDL)中脂质并结合液相串联质谱定性及快速定量检测的方法。方法采用酸化甲醇沉淀结合超声萃取的方法抽提脂质,高速离心去除蛋白颗粒,取上清液,直接采用液相串联质谱在多反应监测模式下进行定量分析。结果该分离提取脂质的方法简单迅速,采用多反应监测模式可同时定量监测30多种具有标准品的脂质成份,包括鞘氨醇类、鞘磷脂、神经酰胺和氧化型的卵磷脂。结论酸化甲醇超声抽提离心法可简便迅速地获得HDL中的脂质成份,结合液相串联质谱可对HDL中的多种脂质进行定量检测,该方法具有高效、重现性好等优点,适用于大量液体生物样本的分析。     

MALDI-TOF-MS技术应用于肝细胞癌蛋白质组学的研究进展

蛋白质组学（proteomics）是从整体水平对蛋白质进行研究的一门重要学科。蛋白质组学技术为开展HCC研究建立了新的技术平台并已经做了大量工作，筛选出有潜在价值的用于HCC诊断和预后的蛋白及发现新的治疗药物靶点，为HCC的诊断和治疗带来新的机遇。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱是蛋白质组学研究的核心技术之一。作者拟从MALDI—TOF-MS技术在肝细胞癌蛋白质组学研究中的应用方面作一综述。     

Quantitation of urinary methylmalonic acid by gas chromatography mass spectrometry and its clinical applications

Urine methylmalonic acid (MMA) concentrations were detected in 79 Chinese patients by gas chromatography mass spectrometry (GC/MS), using a selected ion monitoring program. 10 of the 79 patients were found to have cobalamin deficiency. Their urine MMA amounts were all elevated with a mean value 1376 ng/microliter (11.66 mmol/l), ranging from 40.46 to 3900 ng/microliter (0.34-33.05 mmol/l). The remaining 69 cases were found to be unrelated to cobalamin deficiency. Their mean urine MMA was 3.62 ng/microliter (30.0 mumol/l), ranging from 0-17.47 ng/microliter (0-148.0 mumol/l). In this study, we found that urine MMA detected by GC/MS was a simple, rapid, convenient, specific and sensitive method for the diagnosis of cobalamin deficiency. The urine MMA concentrations in cases not due to cobalamin deficiency would not exceed 20 ng/microliter (169.5 mumol/l), whereas in cobalamin deficiency the urine MMA levels always exceeded 20 ng/microliter, or were even much higher. No overlapping of the results of urine MMA between these 2 groups of patients could be seen in our study. Detection of urine MMA is useful in the demonstration or exclusion of cobalamin deficiency in any suspect patients.     

High pressure liquid chromatography and electrospray ionization mass spectrometry are advantageously integrated into a two‐levels approach to detection and identification of haemoglobin variants

Detecting and correctly identifying haemoglobin (Hb) variants is typically achieved by a two‐levels laboratory approach. We report our experience in dealing with 91 Hb variants, including a number of frequent and a few rare variants. Screening included akaline agarose gel electrophoresis (AGE), ion‐exchange automated high‐performance liquid chromatography (HPLC) and a test for deoxyhaemoglobin solubility. Identification was based on electrospray ionization–mass spectrometry (ESI–MS). Our results confirmed the advantages of HPLC over AGE for screening, because of the occurrence of some electrophoretically ‘silent’ variants. ESI–MS permitted the definitive identification of 90 of the 91 variants included in the study, in some cases (e.g. HbS) through the application of a simple protocol (direct injection of the sample), in other cases requiring the application of more demanding procedures (purification of the variant chain and peptide analysis after enzymatic or chemical cleavage). In an additional case (Hb J‐Oxford), ESI–MS assay did not lead to definitive identification, but gave indications for designing the appropriate primers to focus DNA sequence analysis on the specific region of the gene. Deoxyhaemoglobin solubility test was positive only in the presence of HbS. We conclude that HPLC and ESI–MS are advantageously integrated into a two‐level analytical system for the detection and confirmation of variant Hbs.     

黄绿青霉素的高效液相色谱法检测

目的摸索高效液相色谱(HPLC)检测粮食中黄绿青霉素(citreoviridin,CIT)的实用方法。方法以CIT标准品人工污染几种粮食,然后用二氯甲烷提取、过滤、自然干燥、流动相定容、上机。使用日本岛津SPD鄄10Avp液相色谱仪,紫外鄄可见检测器,Hypesil SiO2 色谱柱(4.6 mm ×150 mm,5 μm)。流动相是乙酸乙酯∶正已烷(7∶3)。流速和检测波长分设为0.5 ml/min和388 nm。结果最低检出量为10 ng/g。标准曲线小剂量R1 = 0.999,Se1 = 0.015 532;大剂量R2 = 0.999,Se2 = 0.030 24。回收率82.5%～96.1% 。日间与日内变异均< 2%。结论高效液相色谱检测法灵敏、简捷、经济,适用于地方病病区粮食黄绿青霉素污染水平的检测。     

染氟成骨细胞的双向电泳和质谱鉴定

目的探讨双向电泳和质谱鉴定技术在染氟成骨细胞蛋白表达变化中的意义,为探索氟骨症发病机制提供有效手段。方法采用小鼠乳鼠颅骨来源的成骨细胞进行培养,抽提染氟(2mg/L)72h组和对照组成骨细胞蛋白,用双向凝胶电泳进行分离及ImageMaster2DElite软件分析电泳图谱,基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪对两组间比较具有统计学意义的差异蛋白点进行鉴定。结果在对照组成骨细胞蛋白双向电泳图谱上可观察到671个蛋白点,而在染氟组双向电泳图谱上可见到837个蛋白点;在染氟成骨细胞表达有明显差异的蛋白点经质谱鉴定出12种(7种蛋白表达增多,5种降低),主要是与细胞代谢旺盛、蛋白质氧化折叠和氧化应激等相关的蛋白。结论实验所采用的双向电泳和质谱鉴定方法可有效分离和鉴定成骨细胞蛋白点,为氟骨症的发生机制提供了有价值的新线索,表明蛋白质组学技术较其他方法具有很大的优越性。     

A New α-Globin Variant with Increased Oxygen Affinity in a Swiss Family: Hb Frauenfeld [α138(H21)Ser→Phe,TCC>TTC (α 2)]

A new α-globin mutation [α138(H21)Ser→Phe] was found in a 55-year-old male proband with an erythrocytosis known since his youth. Cation exchange high performance liquid chromatography (HPLC) revealed an additional peak eluting slightly before Hb A indicating the presence of a variant. The peak area of the variant was approximately one-third that of Hb A suggesting an α-globin variant. Matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry analysis confirmed the mutation at the protein level. The variant is also detectable with isoelectric focusing and reversed phase HPLC. DNA analysis revealed a heterozygous sequence mutation at codon 138 of the α2 gene. A C>T transition at the second nucleotide of the codon indicated a Ser→Phe exchange. The variant showed increased oxygen affinity and was named Hb Frauenfeld.