改良小鼠肝星状细胞的分离、培养及性质鉴定

目的改进BALB/c小鼠肝星状细胞的分离、培养方法,提高其分离质量。方法采用胶原酶经下腔静脉手工逆灌注肝脏、optiprep密度梯度离心法分离小鼠肝星状细胞,含血清-DMEM培养星状细胞,台盼蓝拒染实验鉴定细胞活力;desmin、α-SMA免疫细胞化学检测进行星状细胞性质鉴定。结果肝星状细胞的得率稳定在2×105个/鼠以上,纯度为93%～97%左右,肝星状细胞存活率为95%～97%。结论改良小鼠肝星状细胞的分离、培养方法,有利于原代小鼠肝星状细胞的生物学研究。     

自骨密质中分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞

目的介绍一种自Wistar大鼠骨密质中分离培养间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)的方法。方法应用骨髓密度梯度离心、酶消化骨密质两种方法分离、培养Wistar大鼠MSC,比较其形态学、体外增殖能力差异;并用碱性磷酸酶染色和油红O染色分别鉴定MSC的成骨和成脂分化潜能。结果采用密度梯度离心骨髓或用酶消化后的骨密质,经贴壁培养后均能够成功分离和培养大鼠的MSC,两者在形态学和体外增殖能力方面无明显差异;且两种方法培养的MSC经特异性诱导剂诱导后,均可向脂肪及成骨细胞分化,油红O染色及碱性磷酸酶染色均阳性。结论自骨髓和骨密质中均能够分离培养出较为纯化的大鼠MSC,两种方法培养的MSC体外生物学性能无明显差异。     

长期高脂饮食诱导大鼠胰腺急慢性损伤的机制研究

目的 探究长期高脂饮食诱导胰腺急慢性损伤的发病机制.方法 建立2,4,6,10,18周高脂饮食大鼠模型,HE和天狼猩红饱和苦味酸染色法观察胰腺组织病理学改变,测定血清甘油三酯(TG)水平,检测胰腺组织中超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、丙二醛(Malondial-dehyde,MDA)及游离脂肪酸(Free fatty acid,FFA)含量,免疫组化法检测胰腺组织中α-平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,α-SMA),结蛋白(desmin),转化生长因子β1(TGF-β1)和血小板衍生性生长冈子受体β(PDGFR-β)的表达.结果 长期高脂饮食导致大鼠胰腺早期发生急性炎症反应,最终导致局部腺泡萎缩,胰腺纤维化.胰腺组织中FFA和MDA含量增加,TGF-β1和PDGFR-β表达增加,并且胰腺星状细胞(pancreatic stellate cell,PSC))数量增加,纤维化区域α-SMA阳性染色的星状细胞数量增加.结论 胰腺组织中游离脂肪酸和脂质过氧化产物浓度增高在长期高脂饮食诱导的胰腺急性损伤和慢性纤维化过程中发挥重要作用.     

大鼠肝星状细胞的原代分离、培养与鉴定

目的:介绍一种合理、实用、便捷的肝星状细胞(HSCs)原代培养方法.方法:对SD大鼠进行肝脏原位灌注、酶消化,并进行间质细胞密度梯度离心.使用20%、35%和50%三层Percoll密度梯度分离纯化HSCs,分析其纯度、活力,并根据原代和传代HSCs的特征进行鉴定.结果:每只鼠肝HSCs原代培养得率为(1.5~2)×107个细胞,纯度为(97±2)%,细胞活力为(98±0.6)%.原代和传代HSCs都表达Desmin,只有传代7 d的HSCs表达α-SMA.电镜见细胞浆内大量脂滴.结论:本方法简单、实用、方便,所得结果优于其他方法.     

动力性三维细胞培养系统建立大鼠胰腺导管来源干细胞系的研究

目的 利用动力性三维细胞培养技术建立大鼠胰腺导管来源干细胞( PDSC)系.方法 以大鼠胰腺组织为材料,采用V型胶原酶原位消化分离大鼠胰腺组织,通过不连续密度梯度离心使胰腺导管细胞与胰岛细胞初步分离,采用动力性三维培养技术进行培养,获得原代PDSC,并进行扩增培养、连续传代和纯化,建立PDSC系.对原代分离的PDSC进行鉴定,包括形态学的鉴定及表达特性的鉴定.结果 通过胶原酶消化、不连续密度梯度离心、动力性三维细胞培养,可分离培养出大鼠PDSC,并经过动力性三维培养,可以建立大鼠PDSC系.形态学方面,PDSC呈单个核;生长行为方面,PDSC在三维载体上沿纤维贴壁生长;表达特性方面,通过流式细胞仪分选结果显示,PDSC高表达CD29、CD73,CD90、CD105,不表达CD14、CD19、CD34、CD45,证实P DSC为间充质干细胞.结论 通过采用原位胶原酶消化法、不连续密度梯度离心、动力性三维细胞培养系统,可分离培养出大鼠PDSC,成功建立PDSC细胞系.     

大鼠脂肪干细胞体外诱导成平滑肌样细胞的研究

目的:研究大鼠脂肪干细胞(ADSCs)体外单层培养条件下诱导分化为平滑肌样细胞的可行性。方法:从SD大鼠的腹股沟脂肪垫分离获取脂肪干细胞,测定其生长曲线。取第4代细胞用成脂诱导液诱导分化,并用油红O染色鉴定。取第4代细胞用成骨诱导液诱导分化,并用Von Kossa染色鉴定。取第4代细胞用含有β-巯基乙醇的成平滑肌诱导液诱导,并用免疫组化的方法检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。结果:脂肪干细胞成梭形和多角形,体外生长迅速,生长曲线表明传代2 d后细胞进入对数生长期。第4代细胞成脂诱导后,油红O染色证实细胞内存在脂滴;成骨诱导后,Von Kossa染色证实有矿化结节。脂肪干细胞诱导平滑肌样细胞免疫组化结果,β-巯基乙醇诱导组和未诱导组细胞α-SMA的表达阳性率分别为(29.80±6.89)%、(2.89±1.24)%。诱导组细胞α-SMA的表达阳性率高于未诱导组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:脂肪干细胞经诱导后出现明显的平滑肌细胞特征,可成为平滑肌相关疾病在组织工程研究上新的种子细胞来源。     

大鼠胰腺导管上皮细胞体外分离与定向分化

目的分离和纯化大鼠的胰腺导管上皮细胞，在体外培养并诱导其向胰岛细胞定向分化。方法采用胶原酶逆行灌注法消化、密度梯度离心结合不同细胞贴壁差异性分离和纯化胰腺导管上皮细胞；以角蛋白-19（CK-19）免疫细胞化学染色进行鉴定；用RMPI1640＋含体积分数为10％的胎牛血清（FBS）培养基培养促进胰导管上皮细胞增殖，1周后，更换无血清培养基DMEM／F12并加入角朊细胞生长因子等进一步促进其增殖，细胞达80％汇合时传代，加入高糖及尼克酰胺促进胰导管上皮细胞向胰岛细胞定向分化；对胰岛样结构行双硫腙染色。结果CK-19染色结果证实所获细胞绝大多为导管上皮细胞。体外培养中导管上皮细胞24h开始贴壁，14-21d达80％融合并形成细胞克隆，第28d胰岛细胞样结构形成，且被双硫腙染成猩红色。结论采用密度梯度离心结合差异贴壁法可获得纯化的大鼠胰腺导管上皮细胞，在体外培养与诱导分化条件下可生成胰岛样结构。     

雨蛙素腹腔注射致小鼠慢性胰腺纤维化病理组织学观察

目的：采用雨蛙素反复腹腔注射诱导小鼠慢性胰腺炎,评估胰腺发生纤维化的程度及病变特点。方法：健康雄性C57BL/6小鼠20只,随机分为两组,模型组反复腹腔注射雨蛙素,对照组腹腔注射与模型组等体积的生理盐水,于第7周第1d留取胰腺组织,光镜下进行胰腺腺泡细胞萎缩、炎性细胞浸润、间质纤维组织增生评分;另一部分行苦味酸-天狼星红染色,偏振光显微镜下观察胰腺间质胶原增生情况;第三部分行免疫组织化学染色,观察α-SMA表达情况。结果：模型组小鼠胰腺HE染色显示明显腺泡细胞萎缩、炎性细胞浸润及纤维化;苦味酸-天狼星红染色显示显著胰腺间质胶原增生,评分明显升高;免疫组织化学染色显示星状细胞活化标志物α-SMA表达明显增强。结论：雨蛙素反复多次腹腔注射可诱导小鼠产生明显的胰腺纤维化病变,纤维化发生机制可能与胰腺星状细胞活化分泌过多细胞外间质有关。     

一种改良方法构建大鼠脊髓损伤体外细胞模型

目的 探讨大鼠脊髓神经细胞原代培养、鉴定的方法并构建大鼠脊髓损伤体外细胞模型.方法 取孕15dSD大鼠胚胎,分离脊髓组织并采用改良的胰酶消化联合机械分离法进行脊髓神经细胞的原代培养;采用免疫荧光三标染色鉴定脊髓神经细胞;应用H2O2干预构建大鼠脊髓损伤体外细胞模型.结果 取孕15d大鼠胚胎采用改良的胰酶消化联合机械分离...     

不同方法分离的大鼠骨髓间充质干细胞增殖活性和成脂分化能力的比较

目的：通过比较密度梯度离心和贴壁筛选两种方法所获MSCs的增殖活性和成脂分化能力，探索MSCs体外分离和纯化的较好方法。方法：应用密度梯度离心和贴壁筛选两种方法分离纯化骨髓MSCs，并通过MTT法检测其增殖活性，用第三代MSCs进行成脂诱导，以观察两种方法所获MSCs的成脂分化能力。结果：密度梯度离心法所获MSCs纯度高，呈纺缍形或小三角形，增殖快，约7～10天融合；贴壁筛选法分离的原代细胞中红细胞。破骨细胞等杂质细胞较多，增殖速度相对较慢，且经数次传代仍有较多杂质细胞存在，经成脂诱导后，两种方法所获MSCs表现出相似的成脂能力，油红O染色细胞计数值与光密度值比较两组无显著差异（P值〉0．05）。结论：密度梯度离心法是体外分离和纯化MSCs较好的方法，所获细胞增殖活性高，与贴壁筛选法所获MSCs具有相似的成脂分化能力。     

人卵巢颗粒细胞体外分离培养后连续传代的观察

目的 观察两种方法分离的人卵巢颗粒细胞(GCs)体外培养后的连续传代情况.方法 选取行辅助生殖技术治疗的不孕患者,收集促排卵后穿刺取卵获得的卵泡液(FF),分别用密度梯度离心法和红细胞裂解法分离人GCs,进行体外培养、扩增及连续传代,并用免疫荧光法对原代及传代后GCs进行鉴定.结果 红细胞裂解法获得的GCs数量较密度梯...     

小鼠肝星状细胞分离纯化和体外培养模型的建立

目的 建立小鼠肝星状细胞(m-HSCs)分离纯化的高效稳定方案,并通过原代和传代培养观察其生物学特性.方法 依次应用预灌注液、0.1% Pronase E、0.075% Collagenase NB4G对在体肝脏原位灌注消化.肝脏离体后,在0.02%DNaseI液中磁力搅拌消化10 min,低速离心(25g,5 min)去除残余肝实质细胞,进一步用Optiprep密度梯度液获得纯化的m-HSCs.采用锥虫蓝染色法评估细胞产量及活力;采用自发荧光及油红O染色鉴定细胞纯度;采用光镜、电镜以及Desmin/α-SMA免疫荧光双染色观察细胞形态和生物学特征.结果 分离得到的原代m-HSCs数量为(1.4±0.3)×106/g肝脏,细胞活率＞95%;原代培养24 b后,细胞纯度＞90%,传1代后细胞纯度接近100%.静止期和不同活化阶段的m-HSCs在亚显微结构以及α-SMA表达强度等方面存在差异.结论 建立的m-HSCs分离和纯化方法及体外细胞培养模型具有稳定性和高纯度性及高活率性.

Abstract：

Objective To establish a high-performance and stable model for isolation and purification of mouse hepatic stellate cells, and investigate their biological phenotypes by primary culture and subculture. Methods The liver was digested by in situ perfusion of pre-perfusion solution, 0.1% pronase E and 0.075% collagenase NB4G in turn. The liver was continued to digest using 0.02% DNase Ⅰ liquid with magnetic stirring for 10 min in vitro. After low-speed centrifugation used to remove residual hepatocytes, cells were treated with Optiprep density gradient solution to obtain the purified m-HSCs. Trypan blue staining method was used to calculate cell production and viability. The cell purity was identified by mHSCs autofluorescence and oil red O staining. Light microscopy, electronic transmission microscopy and double immunofluorescence staining of Desmin and α-SMA were done to observe morphological characteristics and biological phenotypes of m-HSCs. Results The yeild rate of m-HSCs was (1.4±0.3)×106/g of liver tissue, the cell viability was more than 95%, the cell purity was more than 90% after 24 h of primary cluture and close to 100% after the first cell passage. The activated m-HSCs had different characteristics of submicroscopic structures and expression level of α-SMA. Conclusion This study established a stable model for isolation, purification and culture of m-HSCs, which obtained the high purity and high-living rate of m-HSCs.     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及表型鉴定

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞分离及培养的方法,探讨体外培养骨髓间充质干细胞的生物学特性.方法 采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增,测定生长曲线,镜下连续观察细胞的形态变化.流式细胞仪鉴定其表面抗原 CD29、CD34、CD44和CD45的表达情况.结果 原代骨髓间充质干细胞呈集落状生长,细胞呈梭形、纺锤形,呈放射状生长,传代后呈均一的成纤维细胞样.骨髓间充质干细胞生长性状相对稳定,1、3、5代细胞生长曲线基本一致.流式细胞仪鉴定表明,骨髓间充质干细胞CD44、CD29表达呈阳性,CD45、CD38表达呈阴性.结论 采用密度梯度离心法结合贴壁培养法能获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,并且在体外培养条件下可大量增生,形成形态均一的细胞集落,可以作为组织工程中种子细胞的来源.     

不同年龄段人前列腺外周带基质细胞表型特征的研究

目的:探讨体外培养的不同年龄段人前列腺外周带基质细胞的表型特征和生长特性差异,分析前列腺基质细胞微环境对老年男性前列腺癌促发的可能原因。方法:原代培养不同年龄段前列腺外周带基质细胞,利用免疫细胞化学技术分析细胞表型特征、透射电镜观察细胞超微结构、琥珀酸脱氢酶法观察细胞体外增殖以及流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果:不同年龄段前列腺基质细胞均表达成纤维细胞标记物prolyl-4-hydroxy-lase,而平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、肌间线蛋白(desmin)的表达随年龄逐渐增加,即α-SMA的阳性表达:年轻组vs老年组=(2.56±1.81)%vs(38.89±11.22)%,(P<0.01);而desmin阳性表达:年轻组vs老年组=(0.89±0.93)%vs(14.89±5.97)%,(P<0.01)。并且α-SMA和/或desmin阳性细胞形态相对宽大、扁平、多形性。超微结构观察发现,前列腺基质细胞内蛋白合成有关的细胞器随着年龄的增加不断增多,主要为粗面内质网和高尔基复合体。老年组前列腺基质细胞的增殖率低于年轻组(P<0.01);而两组基质细胞凋亡率均在1%～3%之间,组间差异无统计学意义。结论:前列腺外周带基质细胞中具有活性的肌成纤维细胞随年龄不断增加可能是老年男性前列腺癌高发和恶性进展的原因之一。     

人类脑动脉瘤血管平滑肌细胞表型蛋白与雌激素受体表达

目的 探讨正常人体动脉血管和脑动脉瘤的血管平滑肌(VSMC)雌激素受体(ERs)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和结蛋白(Desmin)表达变化的关系.方法 临床取材8例非动脉瘤患者手术区头部动脉血管和脑动脉瘤切除标本18例.采用免疫组织化学和形态学分析方法 检测正常动脉血管和脑动脉瘤ERs、α-SMA和Desmin的表达.结果 脑动脉瘤VSMC的ERα和ERβ表达水平均高于对照动脉血管表达水平,差异有统计学意义(P<0.01).脑动脉瘤VSMC的α-SMA和Desmin的表达水平均低于对照动脉血管表达水平,差异有统计学意义(P<0.01).脑动脉瘤VSMCERs的表达与α-SMA和Desmin的表达水平明显相关.结论 人类脑动脉瘤VSMC的ERs表达水平普遍升高,其VSMC表型蛋白表达水平普遍降低,两者之间呈负相关,这可能与脑动脉瘤的形成有关.     

成人间充质干细胞体外诱导分化为成骨细胞的研究

目的 研究成人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)体外培养定向诱导分化为成骨细胞,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性和应用价值.方法 抽取健康成年骨髓,Ficoll密度梯度离心结合贴壁培养法经连续传代后改用含10 nmol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C的条件培养基培养,在相差显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞仪细胞表面分子标志鉴定,免疫组化和RT-PCR检测Ⅰ型胶原蛋门的表达,同时测定细胞内碱件磷酸酶的含量.结果 BMSCs原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力,诱导培养后细胞形态向成骨细胞转化,经RT-PCR、流式细胞仪、细胞碱性磷酸酶活性、糖原染色鉴定为成骨细胞.结论 BMSCs经合理的体外诱导培养后符合成骨细胞的形态特征和生物学特性,有望成为理想的骨组织工程种子细胞来源.     

HGF拮抗TGF-β1诱导腱鞘成纤维细胞α-SMA及细胞外基质合成

目的 研究HGF能否阻抑TGF-β1诱导的腱鞘成纤维细胞α-SMA及细胞外基质过度合成.方法 选取成年新西兰大白兔7只,体重3.75～4.00 kg,无菌切取前肢中趾趾深屈肌腱,进行腱鞘成纤维细胞的分离和培养,待细胞生长成单层后,以胰蛋白酶消化传代.取第3代成纤维细胞用于实验,当细胞达到70%融合时,培养液中加入TGF-β1(5 ng/ml)及HGF(10～40 ng/ml).培养72 h后,利用Westernblot检测α-SMA表达;ELISA测定细胞Ⅰ型胶原及纤维结合素的表达.结果 TGF-β1能显著诱导α-SMA表达,半定量分析提示,TGF-β1作用后的成纤维细胞α-SMA表达量是对照组的1.8倍.随HGF的同时加入,α-SMA的表达则明显受抑制(P＜0.05),且随HGF浓度的升高其阻抑作用呈逐渐增强趋势.TGF-β1同样能诱导Ⅰ型胶原及纤维结合素的表达(P＜0.01),而HGF则可以有效地阻抑其表达,其效应呈剂量依赖性(P＜0.05).结论 HGF可以有效阻抑TGF-β1诱导的腱鞘成纤维细胞α-SMA、Ⅰ型胶原及纤维结合素的表达,这为利用HGF预防和治疗屈指肌腱损伤后粘连及瘢痕在细胞和分子水平提供了依据.     

从膀胱癌患者分离并培养人膀胱平滑肌细胞

目的：建立从膀胱癌患者的分离并培养膀胱平滑肌细胞的实验技术.方法：取一小块无明显肿瘤生长的膀胱组织,分离并培养膀胱平滑肌细胞;动态观察细胞形态变化、生长增殖情况以及平滑肌肌动蛋白（SMA）、结蛋白（Desmin）和广谱细胞角蛋白（AE1/AE3）的表达.结果：接种24 h后即有长梭形细胞贴壁生长,10天后长至80%融合,呈典型的＂峰谷＂样形态;传代后1天为潜伏期,2～6天为指数生长期,然后进入融合平台期,需再次传代.第2代细胞的SMA和Desmin表达阳性率分别高达（99.0±0.8）%和（97.0±2.1）%,不表达AE1/AE3.随着传代次数的增加,细胞去分化,细胞形态变成短梭状或椭圆形;SMA和Desmin的表达开始下降,传至第5代时,SMA和Desmin阳性率分别降至（78.0±3.3）%和（74.0±2.6）%;至第7代时,SMA和Desmin阳性率降至（51.0±3.0）%和（49.0±2.6）%.第7代细胞经血清饥饿培养48 h后,细胞又能再分化,形态转变成长梭状,SMA和Desmin阳性率可分别升至（90.0±3.5）%和（88.0±2.5）%,具有显著性差异.结论：本研究所培养的人膀胱平滑肌细胞具有较高的纯度,血清饥饿能促进去分化的细胞再分化,能为构建组织工程膀胱提供种子细胞.     

兔骨髓基质干细胞体外分离培养及生物学特性研究

目的：研究兔骨髓基质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSC）体外分离、诱导培养及增殖特点,探讨其生物学特性。方法：抽取兔骨髓,密度梯度离心结合贴壁培养法分离BMSC,诱导培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化。倒置显微镜下观察细胞生长及增殖情况,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,免疫组织化学观察Ⅰ型胶原表达,并检测碱性磷酸酶活性及细胞矿化作用。结果：体外培养的兔BMSC贴壁生长,10～14天后形成克隆。细胞形态为均一的长梭形并呈漩涡状排列,流式细胞仪检测CD34,CD45阴性,CD44阳性。免疫组化可检测到Ⅰ型胶原表达,碱性磷酸酶活性明显增高,并且出现矿化结节。结论：密度梯度离心结合贴壁培养BMSC,操作简单,细胞易于成活,诱导条件下成骨能力肯定,适合作为骨组织工程的种子细胞。