人巨细胞病毒pp65抗体检测方法的建立

目的 建立检测人巨细胞病毒pp65IgG抗体(HCMV pp65 IgG)的间接酶联免疫吸附试验(ELISA).方法 通过棋盘滴定法选择包被抗原和酶标二抗的最适浓度;以商品抗HCMV pp65单抗为阳性模拟标本,建立检测抗HCMV pp65 IgG抗体,并对临床收集的各类血清标本进行检测和分析.结果 检测间接ELISAHCMV pp65 IgG的最佳包被抗原浓度为10 ng/孔,酶标二抗的工作浓度为1∶3000.当阳性吸光度(A)值为0.298时,87份不同组的血清标本(HCMV感染活动组、HCMV感染不活动组、HCMV未感染组)阳性检出率分别为51.6%(16/31)、12.1%(4/33)和0.0%(0/23).3组两两间差异均存在显著性(P＜0.01).结论 本研究建立了检测HCMV pp65抗体的方法,应用该方法能从相应人群中检出该抗体,检测不存在假阳性,并发现该抗体与抗HCMVIgM的检出有关.     

人巨细胞病毒gp52蛋白与pp65蛋白融合表达及初步应用

为提高HCMVIgM抗体检测试剂盒的敏感性及特异眭．本研究重组表达了HCMV糖蛋白gp52与磷蛋白DD65的嵌台抗原。从病毒及质粒中分别扩增gp52(氨基酸181～333,f1)及pp65(氨基酸261～373,f2)两个片段．以不同酶切位点插人到pTrcHi B载体上,筛选正确的重组质粒并在太肠杆菌中诱导表达融合蛋白rp52～65。SDE-PAGE结果显示表达蛋白占菌体总蛋白的30％,卧包涵体的形式存在,分子量为35000。以金属鳌合亲和屡析(IMAC)及分子筛方法纯化表达蛋白,纯度达到96％,回收率为252％。以间接法检测HCMV IgM阳性血清,敏感性达到904％(19／21),证明此融合蛋白具有良好的抗原性,可作为HCMV IgM抗体检测试剂盒的包被抗原。     

人巨细胞病毒低基质蛋白pp65亲水性片段的克隆与表达

目的 为建立人巨细胞病毒（HCMV）活动性感染检测方法，表达HCMV早期复制的标志物pp65蛋白，以制备相应的抗体。方法 将pp65全基因和其亲水性强、有抗原代表性的片段（pp65 hp）分别克隆到表达载体pET22b（＋）中诱导表达，并以免疫印迹考察重组蛋白的抗原性。结果 重组rpp65全蛋白表达量低于全菌体蛋白的5％，而rp65 hp蛋白获得高效表达，约为全菌体蛋白的40％，并与HCMV IgG抗体特异性结合。结论 亲水性pp65 hp片段有较好的抗原性，可以制备相应的抗体，来检测HCMV活动性感染。     

人巨细胞病毒pp65抗原血症检测方法的建立和初步临床应用

目的建立人巨细胞病毒抗原pp65(HCMVpp65)血症特异、灵敏和低成本的酶免组化和荧光免疫组化方法,以利于临床推广应用.方法以HCMV-AD169感染的人胚肺成纤维细胞(HELF)爬片作阳性对照,选择试剂和材料组建试剂盒,并与商品化的同类试剂盒作比较,建立人外周血多形核白细胞(PMNLs)中HCMVpp65抗原阳性细胞的检测方法,然后再用荧光定量PCR(FQ-PCR)方法做相应考评.结果我们建立的HCMVpp65抗原血症检测法能成功地检出PMNLs中的pp65阳性细胞.其可检测限分别为102 pfu/ml的AD169攻击24 h后的HELF细胞爬片和3～5个pp65阳性细胞/2×105 PMNLs;用高相对分子质量(500 000)的葡聚糖能快速、有效地分离PMNLs;用4%中性多聚甲醛固定的细胞片,于-20 °C或以下可长期保存(≥6个月),而且pp65抗原性稳定.结论自建的试剂盒与同类进口试剂盒相比,检测pp65的结果差异无显著性,并与FQ-PCR的检测结果相一致,其检测特异、灵敏、操作简单、费用低廉,适宜临床实验室推广应用.     

人巨细胞病毒pp65抗原血症检测方法的建立和初步临床应用

目的　建立人巨细胞病毒抗原 pp6 5 (HCMVpp6 5 )血症特异、灵敏和低成本的酶免组化和荧光免疫组化方法 ,以利于临床推广应用。方法　以HCMV AD16 9感染的人胚肺成纤维细胞 (HELF)爬片作阳性对照 ,选择试剂和材料组建试剂盒 ,并与商品化的同类试剂盒作比较 ,建立人外周血多形核白细胞 (PMNLs)中HCMVpp6 5抗原阳性细胞的检测方法 ,然后再用荧光定量PCR(FQ PCR)方法做相应考评。 结果　我们建立的HCMVpp6 5抗原血症检测法能成功地检出PMNLs中的 pp6 5阳性细胞。其可检测限分别为 10 2 pfu/ml的AD16 9攻击 2 4h后的HELF细胞爬片和 3～ 5个 pp6 5阳性细胞 / 2× 10 5PMNLs ;用高相对分子质量 (5 0 0 0 0 0 )的葡聚糖能快速、有效地分离PMNLs ;用 4 %中性多聚甲醛固定的细胞片 ,于 - 2 0°C或以下可长期保存 (≥ 6个月 ) ,而且 pp6 5抗原性稳定。 结论　自建的试剂盒与同类进口试剂盒相比 ,检测 pp6 5的结果差异无显著性 ,并与FQ PCR的检测结果相一致 ,其检测特异、灵敏、操作简单、费用低廉 ,适宜临床实验室推广应用。     

人巨细胞病毒pp65蛋白的研究进展

人巨细胞病毒（HCMV）pp65抗原血症的监测用于HCMV活动性感染的诊断已成为国际公认的相对“金标准”。此外,利用pp65蛋白能刺激、诱导病毒特异性CD8^＋T细胞活化与增殖特性,用于检测宿主对HCMV的特异性细胞免疫功能,已为疾病的治疗和预防开创新思路和新方法。本文就HCMVpp65蛋白的特性以及在HCMV感染的诊断、治疗和预防上的应用进行综述。     

胶体金免疫斑点法检测人巨细胞病毒pp150抗体

目的：建立一种简便、快速的检测血清中人巨细胞病毒（HCMV）抗pp150抗体的胶体金免疫斑点法。方法：采用Frens法制备胶体金颗粒，标记葡萄球菌A蛋白（SPA），将本所利用基因工程技术生产的pp150抗原固定于0．45μm孔径的硝酸纤维素膜上，制成免疫斑点检测装置。血清中抗pp150 IgG与硝酸纤维素膜上的抗原结合，然后滴加胶体金标记的SPA，在膜上可形成肉眼可见的红色斑点。结果：胶体金免疫斑点法与ELISA试剂盒对比检测了200份临床确诊血清标本中抗pp150 IgG抗体，胶体金法的特异性和敏感性分别为92％和90％。结论：胶体金免疫斑点法检测血清中的抗pp150抗体特异性、灵敏度较高，简便快速，不需要昂贵的仪器。     

巢式聚合酶链反应和pp65抗原检测早期诊断巨细胞病毒感染

目的 比较人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）巢式聚合酶链反应（ｎＰＣＲ）与抗原ｐｐ６５血症检测技术在活动性ＨＣＭＶ感染中的早期诊断价值。方法 以１８例器官移植病人为研究对象,收集术后２～１２周抗凝血标本,分别采用ｎＰＣＲ和血ｐｐ６５抗原检测技术,观察两者的敏感性、相符率以及在早期诊断活动性ＨＣＭＶ感染中的作用。结果 １８例移植病人的１１４份系列血标本,ｎＰＣＲ检测阳性９７份,ｐｐ６５抗原检测阳性８７份,两者均阳性７６份,ｎＰＣＲ比血ｐｐ６５抗原检测更敏感,两者相符率为６６％。结论 ｎＰＣＲ和血ｐｐ６５抗原检测技术均能作为器官移植病人活动性ＨＣＭＶ感染早期诊断的有效手段,两者同时使用能更有效地提高诊断水平,监控疾病的发生发展。     

巨细胞病毒定量PCR与pp65抗原测定监测异基因造血干细胞移植巨细胞病毒感染的比较

本研究比较巨细胞病毒（CMV）定量PCR检测和CMV—pp65抗原检测在异基因造血干细胞移植CMV感染中的诊断价值。以84例异基因造血干细胞移植患者为研究对象,自预处理开始每周对患者EDTA抗凝外周血血标本进行CMV—pp65抗原及cMV定量PCR动态检测,直至出院,比较观察两者在诊断CMV感染中的作用。结果表明：84例移植患者的732份系列血标本中,26例移植后检出CMV定量PCR阳性,检出率30．95％,其中9例为cMV血症,13例为cMV病,检出中位时间为37．1（7—105）天;22例CMVpp65抗原检测阳性,检出率26．19％,检出中位时间为46．6（10—128）天;所有CMV—pp65抗原检测阳性患者CMV定量PCR均为阳性,4例CMV定量PCR阳性但CMV—pp65抗原检测阴性患者均未发展为CMV病。CMV病多出现于CMV定量PCR中等至高拷贝数或中等至高水平病毒血症（CMV—pp65抗原）病例中。治疗后CMV定量PCR转阴中位时间为17．5（11—28）天。CMV—pp65抗原转阴中位时间为10．0（7—21）天。结论：CMV定量PCR和CMV—pv65抗原检测均能作为异基因造血干细胞移植CMV感染早期诊断的有效手段,CMV定量PCR更敏感,CMV—pp65抗原检测更特异,两者同时使用能更有效地提高CMV感染诊断水平,监控其发生发展。     

荧光定量PCR与PP65抗原检测在诊断儿童巨细胞病毒活动性感染的比较

目的用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和pp65抗原检测儿童人巨细胞病毒(HCMV)感染,并对其诊断HCMV活动性感染进行比较评估。方法分析924例HCMV血清学检测阳性的儿童的全血HCMV-DNA荧光定量PCR及HCMV-pp65抗原检测结果,与临床诊断的符合程度进行比较。结果全血HCMV-DNA荧光定量PCR和pp65抗原检测的一致率为81.17%,其标准误为0.39,Kappa值为0.60;PCR检测HCMV感染的灵敏度为98.4%,特异度为97.3%,Youden指数为0.957,PVP和PVN分别为0.961和0.989;pp65抗原检测用于检测HC-MV感染的灵敏度为59.2%,特异度为100%,Youden指数为0.592,PVP和PVN分别为1.00和0.782。结论全血HCMV-DNA荧光定量PCR和pp65抗原检测的结果有较好的一致性,诊断HCMV感染PCR检测的灵敏度较pp65抗原检测的灵敏度要高,而后者的特异度较前者高。二种方法都可用于CMV活动性感染的诊断。     

载脂蛋白M单克隆抗体的制备及其初步应用

目的 制备亲和力高、纯度好的载脂蛋白M(apoM)单克隆抗体,并用以检测apoM在组织细胞及不同人群中的分布.方法 用重组apoM蛋白免疫Balb/c小鼠,经细胞融合、筛选及克隆化,得到生长良好、分泌稳定的杂交瘤细胞株;注射Balb/c小鼠腹腔,收取腹腔积液,纯化后得到apoM单克隆抗体,并用本实验制备的单克隆抗体检测健康对照组及冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)患者稳定型心绞痛(sA)组和急性冠状动脉综合征(ACS)组血清中的apoM蛋白浓度.结果 得到了3株单克隆抗体,经亚型鉴定、阻断试验和WB确定为apoM单克隆抗体;并通过该抗体在人细胞和组织中检测到了apoM蛋白.冠心病SA组的apoM浓度为(11.02±1.96)×10-3 g/L,ACS组apoM浓度为(10.76±1.32)×10-3g /L,对照组为(12.83±2.28)×10-3 g/L,3组间差异有统计学意义(F=11.544,P＜0.05).比较冠心病sA组和ACS组与健康对照组血浆apoM浓度,显示两组冠心病患者血浆apoM浓度均低于健康对照组(t=2.962、3.967,P＜0.05),两组冠心病组之间血浆apoM浓度差异无统计学意义(t=1.033,P＞0.05).结论 成功制备了3株apoM的单克隆抗体,可与人组织细胞中的apoM蛋白特异结合,为进一步研究apoM在脂代谢中的作用打下了基础.     

应用间接免疫荧光技术检测人巨细胞病毒-PP65抗原的临床意义

目的：探讨人巨细胞病毒（HCMV）-PP65抗原检测的临床意义。方法：利用间接免疫荧光技术对本院56例住院患者外周血HCMV-PP65抗原进行检测,其中器官移植组35例（肾移植患者13例,肝移植患者14例,骨髓移植患者8例）,其他疾病组21例。设本院健康体检者20例为正常对照组。结果：56例标本中有25例检出HCMV-PP65抗原阳性,阳性率为45%。25例抗原阳性患者中,有临床症状的患者外周血中的HCMV-PP65抗原阳性细胞数明显高于无临床症状的HCMV-PP65抗原阳性的患者,两者比较差异有显著性（P〈0.01）。正常对照组无一例阳性。结论：HCMV-PP65抗原检测具有简便、敏感的特点,其结果与患者的临床症状相关,可以作为监测HCMV活动性感染的指标,为临床提供诊治依据。     

T7噬菌体表达巨细胞病毒PP65蛋白抗原的初步研究

目的利用噬菌体展示技术构建巨细胞病毒基质蛋白PP65的抗原,初步评价其抗原性。方法PP65的基因片段经酶切后,与T7噬菌体的基因组相应酶切位点结合．借助包装蛋白组裴成为完整的噬菌体。PP65目的蛋白以融合蛋白的形式表达在T7噬菌体的头蛋白部位,每个噬菌体颗粒表面可表达5～15个拷贝。噬菌体可以在宿主细胞中快速繁殖,并且能够迅速裂解宿主细胞,使目的蛋白的富集达到很高的效率。人巨细胞病毒基质蛋白PP65可以激发机体强烈的免疫反应,运用T7噬菌体载体展示系统表达PP65的部分肽段,扩增噬菌体,以SDS—PAGE电泳和western—blot鉴定所表达的抗原特性。结果获得了重组T7-PP65噬菌体,通过鉴定,噬菌体表达在其头蛋白上的PP65抗原可以被天然PP65的单克隆抗体所识别。结论噬菌体展示技术可以有效地进行病毒蛋白抗原的表达,为抗原筛选和疫苗的研制提供科学依据。将PP65表达在T7噬菌体表面,可以研究其免疫原性及评估其作为疫苗的可能性。     

人纤溶酶原激活物抑制物1基因克隆表达和单克隆抗体的制备及其初步应用

目的克隆人纤溶酶原激活物抑制物1（PAI1）基因，制备和鉴定针对人PAI1的单克隆抗体，以检测PAI1在乳腺癌中的表达。方法利用逆转录（RT）-PCR方法从人乳腺癌细胞株MDA231总RNA中扩增克隆PAI1基因，构建其原核表达质粒，并表达MS2-PAI1融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫BALB／C小鼠，常规细胞融合和选择性培养，亚克隆筛选出单克隆细胞株，纯化单克隆抗体。利用蛋白印迹（Wb）、免疫组织化学法检测分析PAI1在乳腺癌中的表达水平。结果克隆了1209bp的PAI1基因全长片段。经ELISA双筛，获得2株能稳定分泌抗PAI1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其分泌抗体亚类均为IgG1，且均能特异识别PAI1，并与其他蛋白无交叉反应。Wb结果显示，该抗PAI1单抗与MS2-PAI1融合蛋白以及细胞中的天然蛋白均能结合。免疫组织化学染色结果显示，该单抗与人乳腺癌细胞株MDA231和乳腺癌组织结合后，呈阳性反应。结论克隆了人PAI1基因，通过原核表达产物制备并纯化了针对PAI1的单克隆抗体。初步检测PAI1能在乳腺癌细胞和乳腺癌组织中表达，这为深入研究PAI1基因功能和检测临床肿瘤组织及体液中的PAI1奠定了可靠基础。     

Comparison between pp65 antigenemia assay and quantitative real-time polymerase chain reaction for detection of active cytomegalovirus infection in routine diagnostics

Real-time polymerase chain reaction (PCR) and pp65 antigenemia assay for the detection of active cytomegalovirus infection in immunocompromised patients experiencing neutropenia after bone marrow or kidney transplantation have been compared with a special focus on evaluability and embedment in daily routine diagnostics. Investigating 334 specimens from 97 patients, real-time PCR was shown to be the superior assay with regard to the parameters focused on.     

外周血白细胞中人巨细胞病毒pp65抗原的定位及意义

目的明确人巨细胞病毒（HCMV）磷酸基质蛋白65（pp65）抗原在阳性细胞中的定位并初探其定位与病毒活动间的关系，为指导临床病毒抗原血症的监测提供依据。方法利用4，6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI）荧光染料能与细胞双链DNA结合的特点，在激光共聚焦显微镜下对HCMV pp65单抗阳染细胞进行抗原定位；同时通过外周血白细胞与病毒共培养技术，检测分析其定位与病毒活动的关系。结果临床标本检测的HCM-Vpp65抗原阳染细胞的表现形式有3种，即细胞浆型、细胞核型和细胞浆核混合型，其中细胞核中的HCMV pp65抗原聚集于细胞核的内部，而非仅仅附着于核表面。进一步的白细胞与病毒共培养结果显示，只有野生型病毒株感染的人胚肺成纤维细胞（HELF）与外周血白细胞共培养，才能检出HCMV pp65抗原阳性的白细胞，而且表现为仪初期（培养1h内）可检出细胞浆阳染型，随着时间延长，约80％～90％的抗原阳染白细胞表现为细胞核型，偶见细胞浆核混合型。结论HCMV pp65抗原血症时阳染的外周血白细胞的表现形式有3种，即细胞核型、细胞浆型以及细胞浆核混合型，其中细胞核型属细胞核内部型，并非细胞核表面附着型。结合共培养结果认为，细胞核型阳染细胞的检出更能提示病毒的活动。     

载10-羟基喜树碱靶向脂质微泡的制备及体外寻靶能力实验研究

目的 制备携人肝癌单抗Hab18载10-羟基喜树碱的脂质微泡,并观察其体外寻靶能力.方法 制备生物素化抗人肝癌Hab18单克隆抗体,检测其生物素化程度;用机械振荡法制备载药脂质微泡,以生物素-亲和素桥连方式构建携人肝癌单抗Hab18载10-羟基喜树碱的脂质超声微泡,检测其一般特性、包封率和载药量,以免疫荧光法检测微泡与抗体的连接情况,在光镜下观察靶向载药微泡的寻靶能力,并与载药非靶向微泡进行比较.结果 每个单抗分子平均可与13个生物素分子结合.载药靶向脂质超声微泡分布均匀,平均粒径为1.52 μm,包封率为76.32%,载药量为21.81%.免疫荧光法显示微泡表面可见明亮的红色环状荧光,体外寻靶实验显示该载药靶向微泡可与人肝癌7721细胞牢固结合.结论 携人肝癌单抗Hab18载10-羟基喜树碱的脂质超声载药靶向微泡可成功制备,其包封率和载药量较高,具有较强的体外寻靶能力.     

HCMVpp65抗原和IgM抗体检测诊断儿童HCMV活动性感染的比较

目的：比较人巨细胞病毒(HCMV)pp65抗原(以下简称pp65)检测和血清HCMV-IgM抗体(以下简称IgM抗体)检测两种方法对儿童HCMV活动性感染的诊断实用意义。方法：采集临床疑似HCMV活动性感染儿童血标本(共251份)，分离血浆和多形核白细胞，分别用于IgM抗体检测和pp65检测。同时进行荧光定量PCR检测HCMVDNA，与pp65抗原作平行比较。结果：pp65抗原检测的结果与IgM抗体检测的符合率为73.3％。与HCMV DNA检测相比pp65抗原检测法的符合率、特异度和敏感度分别为85．5％，85．2％和86．2％。而且高pp65抗原血症与患者的临床症状密切相关。结论：pp65抗原血症反映该病毒活动状况，可监测HCMV活动性感染。由于儿童患者还存在原发感染的可能性，所以．联合HCMV-IgM的监测来提高临床的诊断率。     

抗胰蛋白酶原激活肽单克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备抗胰蛋白酶原激活肽（TAP）单克隆抗体（TAP McAb），并进行初步鉴定。方法 将人工合成的TAP与血蓝蛋白（KLH）交联作为免疫原，免疫Balb／c小鼠，经细胞融合，有限稀释法筛选出能稳定分泌TAP McAb的杂交瘤细胞株，并对单克隆抗体进行鉴定。结果 细胞融合率85．03％，经4次克隆化后获得10株能稳定分泌TAP McAb的杂交瘤细胞株，经免疫球蛋白亚类鉴定，除1株为IgG1外，其余9株均为IgM类；染色体数目为92～101条；酶联免疫吸附测定（ELISA）检测杂交瘤细胞培养上清效价为1：20～1：160，腹水效价为1：3200～1：25600；特异性试验表明，抗TAP单克隆抗体与牛血清白蛋白（BSA）、人白蛋白、胰蛋白酶、淀粉酶均无交叉反应；中和抑制试验表明，培养上清及腹水中的抗体能明显被合成多肽TAP及为急性胰腺炎患者尿液所中和；对其中5株细胞株进行相对亲和力分析结果表明，2C3〉8C6〉6H7〉6F7〉8810。结论 成功制备了抗TAP单克隆抗体，为建立敏感、特异的TAP免疫检测方法奠定了基础。     

抗人胰腺癌单克隆抗体的制备及其鉴定

目的：制备抗人胰腺癌单克隆抗体,并对其特异性进行鉴定。方法：以人分化胰腺癌细胞株8988为抗原,免疫BALB/c小鼠,常规融合,运用ELISA方法筛选;流式细胞仪及免疫组化鉴定其组织特异性,West blot检测其特异性结合抗原的相对分子量。结果：得到一株高效价的稳定分泌IgG1抗人胰腺癌的单克隆抗体的细胞株,命名为SZ121,腹水效价为2×10^-5。运用ELISA方法及流式细胞仪方法检测证实SZ121特异地识别胰腺癌细胞。West blot检测显示SZ121特异性结合的抗原相对分子量为66 000左右。结论：实验证实SZ121是特异结合胰腺癌细胞的单克隆抗体。