眼镜蛇毒粗纯蛋白的柱层析分离及其各馏分的抗肿瘤活性研究

目的:眼镜蛇毒粗纯蛋白的分离及其馏分抗癌活性研究。方法:应用离子交换层析法分离眼镜蛇毒粗纯蛋白,通过高效液相色谱行为分析、含量测定和抗肿瘤活性试验对各馏分进行了性质研究。结果:以Tris-HCl缓冲液(20 mmol.L-1,pH8.0)为洗脱体系,在DEAE-sephacel填料离子交换柱上对眼镜蛇毒粗纯蛋白以0～0.5 mol.L-1氯化钠的Tris-HCL溶液进行线性梯度洗脱,可得到4个洗脱峰。第1个洗脱峰馏分抗癌活性最强,含有两类疏水性、紫外吸收特性各异的蛋白混合物;另3个洗脱峰对应馏分蛋白成分较单一。结论:眼镜蛇毒粗纯蛋白分离馏分对体外培养的癌细胞株有一定的抑制作用。     

眼镜蛇毒细胞毒素CTX-d的分离纯化及抗肿瘤活性

目的 分离纯化眼镜蛇毒细胞毒素,测定其体内外抗癌作用.方法 应用柱层析及RP-HPLC,从眼镜蛇毒粗毒中分离纯化细胞素素(CTX).体内外抗癌作用利用噻唑兰(MTT)法及对荷瘤小鼠U14瘤的抑瘤作用.结果 分离纯化获得的CTX-d不混有PLA2,在体内外实验中显示明显的抗肿瘤作用.结论 结合阳离子交换层析和RP-HPLC可从眼镜蛇毒中高效分离获得不含PLA2的CTX.     

浙江眼镜蛇(Naja naja atra)蛇毒镇痛多肽的分离纯化及其性质的研究

研究浙江眼镜蛇(Naja naja natra)蛇毒的镇痛活性组分，为寻找镇痛效果好，而无成瘾性的新型镇痛药奠定基础。采用CM-Sephadex离子交换色谱和Sephadex G-50凝胶过滤色谱对浙江产眼镜蛇蛇毒中的镇痛活性组分进行分离纯化。采用PAGE IEF及HPLC上等实验方法对产物纯度进行鉴定。采用SDS-PAGE法和HPLC法测定产物的分子质量，用IEF法测定产物的等电点，用小鼠热板法与醋酸扭体法考察产物的镇痛活性。结果表明眼镜蛇毒经3次柱色谱后，产物AAP经鉴定为单一组分。AAP经SDS-PAGE法和HPLC法测定的分子质量分别是7．28Mr和7．25Mr，等电点是9．58。AAP的痛阈提高百分率和扭体抑制率分别为91．3％，77．2％。眼镜蛇毒经3次柱色谱后得到具有镇痛活性的单一组分。     

液相色谱分离纯化五步蛇毒凝血酶样酶

目的：改进分离工艺，找到液相色谱分离纯化五步蛇毒中凝血酶样酶的最佳方案。方法：五步蛇毒依次经SuperdexG75凝胶过滤、DEAE．SephroseF．F阴离子交换和SuperdexG30凝胶过滤，通过改变洗脱液pH值、流速、Tris浓度、盐浓度及上样量来考察对分离纯化五步蛇毒中凝血酶样酶的影响。结果：Superdex75凝胶过滤色谱分离纯化受洗脱液流速、Tris浓度、盐浓度、pH值、上样量的影响；DEAE—SephroseF．FN离子交换色谱受盐浓度的影响：SuperdexG30凝胶过滤色谱受上样量的影响。三步分离纯化后获得一种五步蛇毒凝血酶样酶，分子量约23kD。结论：依次经SuperdexG75、DEAE—SephroseF．F和SuperdexG30凝胶，通过改变洗脱液流速、Tris浓度、盐浓度、pH值、上样量等能得到最佳分离条件．最终可获得五步蛇毒凝血酶样酶的纯品。     

中华真地鳖抗肿瘤蛋白纯化、鉴定及活性研究

目的分离纯化中华真地鳖(Eupolyphaga sinensis Walker)中抗肿瘤活性成分并研究其活性。方法采用硫酸铵沉淀、超滤、CM-Sepharose FF、DEAE-Sepharose FF及Q-Sepharose HP离子交换、Butyl Sepharose HP疏水色谱以及Superdex 75凝胶过滤色谱等技术分离纯化抗肿瘤组分;SDS-PAGE及MALDI-TOF质谱进行鉴定;采用MTT法考察其抗肿瘤活性。结果分离纯化得到一分子质量约为72 kD的抗肿瘤蛋白(EPS72)。该蛋白对肝癌Bel-7402细胞、肺癌A549细胞等多种人癌细胞株表现出较强的增殖抑制作用,并呈浓度依赖性。结论纯化的蛋白具有潜在的抗肿瘤作用。     

舟山眼镜蛇毒神经毒素的分离纯化及镇痛作用研究

目的从舟山眼镜蛇毒中分离纯化神经毒素,并测定其部分理化性质及镇痛活性。方法应用SP-Sephadex C-50离子交换色谱法分离眼镜蛇毒粗毒,用Sephadex G-50凝胶过滤色谱、CM-Sephadex C-25离子交换色谱纯化神经毒素;SDS-PAGE(Tris-Tricine系统)鉴定纯度;用Meier方法测定毒性;用热板法观察神经毒素的镇痛作用。结果应用SP-Sephadex C-50离子交换柱层析,从舟山眼镜蛇毒中分离得到14个蛋白峰,其中6个组分(NNAV-Ⅶ ~Ⅻ)经鉴定为含有神经毒素组分,将神经毒活性最强的组分XI经Sephadex G-50、CM-Sephadex C-25纯化得神经毒素纯品NTⅪ。该纯品分子量12.3kD,小白鼠静脉注射和腹腔注射的LD50分别为1.9875、2.2217 mg·kg-1。NTXI能显著提高小鼠对热板刺激的痛阈。腹腔注射0.2mg·kg-1NTXI可使小鼠的热板痛阈提高84.35%。NTXI的镇痛作用具有时效性,给药后2h起效,4h作用达峰值。结论舟山眼镜蛇毒中分离得到一个神经毒素纯品NTⅪ,具有镇痛作用。     

眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶的纯化、性质鉴定及细胞毒性测定

目的从眼镜蛇蛇毒中分离L-氨基酸氧化酶（LAAO）,测定其理化性质及细胞毒性。方法采用Superdex75凝胶层析、Phenyl-SepharoseFF疏水层析、ResourceS离子交换层析分离纯化LAAO;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及C18反相色谱鉴定纯度并测定相对分子量;CCK8法测定细胞毒性。结果舟山眼镜蛇蛇毒经凝胶层析、疏水层析、离子交换层析及C18反相色谱后获得LAAO（暂定名NA-LAAO）,在非还原和还原条件下相对分子质量均为58kD左右;具有明显的抑制人胃癌MGC-803细胞增殖作用。结论从眼镜蛇毒中纯化得到LAAO,其具有明显的细胞毒性。     

蚯蚓纤溶酶的分离纯化研究

目的从赤子爱胜蚓(Eisenia Foelide)中分离纯化出一种相对分子质量(Mr)较小的纤维蛋白溶解组分———蚯蚓纤溶酶(EFE),为其注射剂的研制开发打下基础。方法采用盐析、透析、凝胶过滤色谱、离子交换色谱等方法分离纯化EFE,用SDS-PAGE对纯化的活性组分进行Mr测定,用酶谱分析方法初步探讨蚯蚓中存在的其它纤溶酶活性组分。结果分离纯化得到了EFE单一组分,经SDS-PAGE EFE呈单一条带,Mr约为25 000。经酶谱分析发现纤溶酶活性组分Mr分布在25 000~50 000之间。结论反复使用色谱技术可分离纯化EFE,并得到单一组分。     

眼镜蛇毒细胞毒素的分离、纯化及其抗癌活性

目的：研究眼镜蛇毒细胞毒素的抗癌活性。方法：应用Ｓｅｐｈａｄｅｘ　 Ｇ１００和 ＣＭ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ柱层析,从眼镜蛇毒中分离、纯化细胞毒素组分,用ＭＴＴ法测定该组分对体外培养的人癌细胞的细胞毒性作用。结果：眼镜蛇毒细胞毒素对人癌细胞ＳＧＣ－７９０１、Ｂｅｌ－７４０２、Ｋ５６２和Ｕ９３７的抑制作用呈良好的量效关系,半数抑制浓度分别为 ４．１０、 ２． ０８、 ０． ２９和 ０．１７ μｇ／ｍｌ。结论：眼镜蛇毒细胞毒素对体外培养的人癌细胞有很强的杀伤作用。     

广西五步蛇毒小肽的分离纯化及抗肿瘤作用

目的：从广西五步蛇毒分离出小分子活性组分，研究其对肿瘤细胞株的抑制作用。方法：经Sephadex G-75凝胶过滤、超滤和DEAE—Sepharose—CL-6B离子交换层析法从广西五步蛇毒中分离纯化获得一种小分子的肽类，采用MTT法检测其对多种体外培养的癌细胞株的生长抑制情况。结果：从广西五步蛇毒中分离纯化得到的单一的小肽，其对卵巢癌细胞株（A2780）、人胃癌细胞（SGC-7901）以及鼠乳腺癌细胞株（782）有抑制作用并呈明显的剂量依赖关系，作用24h的IC50分别为0．264、0．648、0．173μg／mL。结论：应用凝胶过滤和离子交换层析方法可以从广西五步蛇毒中分离出单一组分的小分子肽，其对多种肿瘤细胞的生长有抑制作用。     

一种水解血小板膜糖蛋白GPIb的眼镜蛇毒组分的分离纯化与鉴定

目的　建立从中华眼镜蛇毒中分离、纯化可水解血小板膜糖蛋白Ｉｂ（ｐｌａｔｅｌｅｔｍｅｍｂｒａｎｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎＩｂ,ＧＰＩｂ）组分的方法。方法　肝素亲和层析,分子筛层析,ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）。结果　经Ｈｅｐａｒｉｎ ＳｅｈｐａｒｏｓｅＣＬ ６Ｂ亲和层析及ＳｅｐｈａｄｅｘＧ １５０分子筛层析,从中华眼镜蛇毒纯化出可降解纤维蛋白原和ＧＰＩｂ的活性组分,回收率为０－８８％,ＳＤＳ ＰＡＧＥ证实此组分为相对分子量约４７１００的单肽链蛋白。结论　此方法成功地从中华眼镜蛇毒中纯化出了水解ＧＰＩｂ的组分,具有高效、简便的特点。     

舟山眼镜蛇毒心脏毒素-13的纯化、活性及尼群地平对其作用的影响

目的　从舟山眼镜蛇 (Najaatra)毒分离纯化心脏毒素并观察其心脏毒性作用和探讨作用机制。方法　用离子交换和凝胶过滤法从蛇毒中分离纯化心脏毒素 ,观察其对整体动物 ,离体器官和组织的作用及作用影响因素。结果　从舟山眼镜蛇毒中分离出 4个有心脏毒性组分 ,纯化其中 1个定名为心脏毒素 13(Cardiotoxin 13,CTX 13) ,它含有 6 0个氨基酸 ,分子质量 7 76 9ku。小鼠ivLD50 为 0 75 6mg·kg-1。对大鼠离体心脏CTX 13可使冠脉阻力增高 ,心脏收缩幅度减小 ,停于收缩期。尼群地平 (Nit)能取消CTX 13升高冠脉阻力作用 ,同时使CTX 13的负性肌力作用逆转为正性肌力作用。CTX 13可诱发猪离体冠脉环呈剂量依赖性收缩 ,其EC50 为 2 6 0mg·L-1,Nit 0 0 5 μmol·L-1使其量效曲线平行右移 ,EC50 提高到 36 0mg·L-1。但对于大鼠离体乳头肌Nit 0 83μmol·L-1对CTX 13所致心脏毒性无明显对抗作用。在整体实验中Ni0 3mg·kg-1可使大鼠ivCTX 13的最小致死量 (MLD)从 (44 4 7± 2 8 5 ) μg·kg-1提高到(5 41 2± 2 3 2 ) μg·kg-1。结论　CTX 13的心脏毒性作用除其直接心脏毒作用外 ,尚与其收缩冠脉作用有关     

广西眼镜蛇毒细胞毒素的分离及对人鼻咽癌等细胞抑制作用的研究

目的　探讨广西眼镜蛇毒细胞毒素对人鼻咽癌细胞(CNE)等多种癌细胞株的抑制作用。方法　经SephadexG 5 0 ,CM SepharoseCL 6B层析法从广西眼镜蛇毒中分离纯化获得细胞毒素 (CTX) ,采用MTT检测CTX对癌细胞株体外培养抑制作用 ,探索量效时效关系。结果　从广西眼镜蛇毒中分离到一种细胞毒素单一组分 (CTXCM 5 )对体外培养的人鼻咽癌细胞株 (CNE)、淋巴瘤细胞株 (YAC)、人宫颈癌细胞株 (HELA)和卵巢癌细胞株 (Ho8990 )的抑制有明显的剂量依赖关系 ,作用 48h的IC50 分别为 1 84,0 75 ,1 84和 2 5 9mg·L-1;随作用时间的延长 ,CTXCM 5对CNE细胞株作用最为明显 ,作用 3h和 2 4h的IC50 分别为 4 78和1 0 4mg·L-1。结论　CTXCM 5对体外培养的癌细胞株有较强的抑制作用。     

五步蛇毒纤溶组分FⅨcaⅠ的分离纯化和生物活性的测定

目的从五步蛇(安徽产)毒分离纯化一种具有纤溶活性的组分FⅨcaⅠ,并研究其理化性质和生物活性。方法应用DEAE-Sephadex A-50阴离子交换层析、Sephadex G-75凝胶层析、Chelating Sepharose Fast Flow金属离子螯合亲和层析和Sephadex G-50凝胶层析四步分离纯化目的组分FⅨcaⅠ;纤维蛋白平板法和SDS-PAGE测定FⅨcaⅠ的生物活性;通过小鼠皮下注射不同剂量的FⅨcaⅠ,测量皮下出血斑的面积并求出最小出血剂量。结果从五步蛇毒分离纯化的FⅨcaⅠ组分为单体蛋白,相对分子量23 ku,等电点为4.8。FⅨcaⅠ可降解纤维蛋白和纤维蛋白原,优先降解α链,呈时效、量效关系。蛇毒纤溶酶FⅨcaⅠ最小出血剂量为54.9μg,为非出血性蛇毒纤溶酶。结论从五步蛇(安徽产)毒分离纯化的FⅨcaⅠ是一种分子量较小,比较稳定,纤溶活性强,可直接降解纤维蛋白且非出血性的新蛇毒纤溶酶。     

蝰蛇(缅甸亚种)毒促凝—纤溶双相活性组分FⅥbb的分离纯化及生物活性

目的从蝰蛇(缅甸亚种)毒分离纯化一种促凝—纤溶双相活性组分FⅥbb,并研究其理化性质和生物活性。方法应用CM-Sephadex C-50阳离子交换层析Sephadex G-150(超细)凝胶过滤层析Chelating Sepharose Fast Flow金属离子螯合亲和层析分离纯化蛇毒,反相HPLC检测组分FⅥbb纯度,采用MALDI质谱测定法测定分子量,以发色底物法、纤维平板法和SDS-PAGE测定FⅥbb的酶学特征和生物活性。结果从蝰蛇(缅甸亚种)毒分离得到的促凝—纤溶双相活性组分FⅥbb为单体蛋白,相对分子质量为59 138,最适温度为40℃,最适pH为10.0,为金属蛋白酶。结论应用CM-Sephadex C-50阳离子交换层析和Chelating Sepha-rose Fast Flow金属离子螯合亲和层析等方法可以从蝰蛇(缅甸亚种)毒纯化出促凝—纤溶双相活性组分FⅥbb,具有促凝—纤溶双相活性。     

Fractionation of bulldog ant venom

The venom of an Australian Bulldog Ant, Myrmecia pyriformis, has been fractionated by means of low voltage starch gel electrophoresis and gel filtration on Sephadex G50 and G75 columns. The aims of the study were (a) to establish whether the biological activities which had previously been described resided in separate venom components, and (b) to isolate, in a purified form, the component possessing non-histamine smooth muscle stimulant activity. Starch gel electrophoresis demonstrated the presence of seven protein components. Sephadex gel filtration resulted in the separation of a fraction which appeared homogeneous on starch gel electrophoresis. This fraction, which was enzyme-free, possessed smooth muscle stimulant, red cell lysing and histamine-releasing activities and resembled the major peptide from bee venom, melittin.     

蜂毒素的纯化方法及体外抗肿瘤作用研究

目的从蜜蜂毒中分离纯化蜂毒素 ,观察其体外对多种肿瘤细胞的生长抑制作用。方法用SephadexG 2 5、SephadexG 5 0、SephadexG 75进行 3步色谱法从蜜蜂毒中分离纯化蜂毒素 ,以高效液相色谱法进行含量测定 ;溴化四唑蓝比色法观察蜂毒素对SMMC 772 1、BEL 74 0 2和Hep 3B等 3种肿瘤细胞的生长抑制作用。结果高效液相色谱测定结果显示供试品为单峰 ,保留时间与对照品一致 ;蜂毒素剂量依赖性地抑制 3种受试肿瘤细胞的生长。结论以凝胶过滤色谱可制得高纯度的蜂毒素 ,蜂毒素在体外呈现出明显的抗肿瘤作用     

Purification and characterization of a neurotoxic phospholipase A2 from Indian cobra (Naja naja naja) venom.

Snake venoms contain multimolecular forms of phospholipase A2 which are diverse with respect to their pharmacological properties. A neurotoxic PLA2 from Naja naja naja venom has been purified in two steps. (1) The whole venom was fractionated on CM-Sephadex C-25 column; 4.6% of the total PLA2 activity recovered was found in the NN-V fraction. (2) The NN-Vb-PLA2 fraction was purified to homogeneity by gel filtration of fraction NN-V on Sephadex G-50. It is a basic protein with a mol. wt between 10,500 and 11,000, and is more toxic than other basic PLA2s purified from Naja naja naja venom. The LD50 of NN-Vb-PLA2 is 0.27 mg/kg body wt. It induced neurotoxic symptoms in experimental mice and is devoid of myotoxic, anticoagulant and edema-inducing activities.