应用DHPLC筛查人类mtDNA高变区I的异质性

[目的]检测人类 mtDNA HVI区的异质性,建立有效的筛查低水平异质性 DNA的技术.[方法] 扩增人 mtDNA 的 HVI区内 269 bp的片段,以不同比例混合相差一个碱基的 2种 DNA片段的 PCR扩增产物,配制异质性 DNA模型,用变性高效液相色谱技术 (DHPLC)检测 ,确定最佳检测条件.[结果] 应用 DHPLC检测 HVI区的片段 (269 bp),最低可检测出含量为 5%的异质性样本.在 80例无关个体的 mtDNA 样本中 ,共检测到 15例具有异质性.[结论] 所建立的 PCR-DHPLC方法可用于检测 mtDNA的异质性.     

应用DHPLC筛查黑白头发mtDNA控制区的异质性研究

目的 探讨黑头发和白头发线粒体DNA(mtDNA)控制区的异质性.方法 将人头发mtDNA控制区扩增成5个部分互相重叠的片段,利用已建立的DHPLC技术分析中国汉族正常人与Alzheimer病同个体黑头发和白头发mtDNA控制区的异质性.结果 50例中国汉族正常人同个体中黑头发和白头发mtDNA控制区的异质性为10...     

应用DHPLC进行线粒体异质性突变分析

目的:检测人类线粒体DNA异质性从而建立有效的筛查低水平异质性DNA的方法.方法:选择包含Ⅱ型糖尿病高突变位点的人mtDNA 3083～3339 nt片段进行PCR扩增,以不同比例混合相差一个碱基的两种DNA片段的PCR扩增产物,建立不同比例异质性DNA模型.确定最佳检测条件后分别用变性高效液相色谱技术(DHPLC)和DNA测序技术进行分析和比较.结果:应用DHPLC检测mtDNA 3083～3339 nt(257 bp),最低可检测出该区域含量为5%的异质性样本,而DNA测序技术只能检测出异质性含量大于20%的样本.结论:成功建立分析mtDNA 3083～3339 nt片段异质性突变的方法,该方法可用于检测低水平的mtDNA异质性.     

黑白头发mtDNA控制区的异质性差异研究

目的探讨黑头发和白头发线粒体DNA(mtDNA)控制区的异质性差异。方法提取毛干mtDNA,用PCR技术扩增mtDNA控制区5个目标片段,以变性高效液相色谱技术分析中国汉族正常人与Alzheimer病同个体黑头发和白头发mtDNA控制区目标片段的异质性差异。结果 30～40岁正常人、50～70岁正常人和50～70岁Alzheimer病患者黑头发mtDNA异质性分别为:3.2%、10.0%及16.4%;30～40岁正常人、50～70岁正常人和50～70岁Alzheimer病患者白头发mtDNA异质性分别为:7.2%、20.4%及28.0%,各年龄段正常人及Alzheimer病患者同个体白头mtDNA异质性明显高于黑头发。结论同个体中黑白头发和mtDNA控制区的异质性有明显差异,年龄越大,异质性越明显。     

The heterogeneity differences in mtDNA control region between black and white hairs.

目的 探讨黑头发和白头发线粒体DNA(mtDNA)控制区的异质性差异.方法提取毛干mtDNA,用PCR技术扩增mtDNA控制区 5 个目标片段,以变性高效液相色谱技术分析中国汉族正常人与Alzheimer病同个体黑头发和白头发mtDNA控制区目标片段的异质性差异.结果 30～40岁正常人、50～70岁正常人和50～70岁Alzheimer病患者黑头发mtDNA异质性分别为:3.2%、10.0 %及16.4%;30～40岁正常人、50～70岁正常人和50～70岁Alzheimer病患者白头发mtDNA异质性分别为:7.2%、20.4%及28.0%,各年龄段正常人及Alzheimer病患者同个体白头mtDNA异质性明显高于黑头发.结论 同个体中黑白头发和mtDNA控制区的异质性有明显差异,年龄越大,异质性越明显.     

不同年龄Ⅱ型糖尿病患者中黑白头发mtDNA异质性研究

摘要：目的研究T2DM患者头发中mtDNA异质性的规律。方法选择T2DM高突变位点的mtDNA 编码区和控制区2片段进
行PCR扩增,以DHPLC技术分析黑、白头发mtDNA目标片段在T2DM组和对照组异质性差异。结果在20~45岁对照组、20~
45岁T2DM组、45~70岁对照组和45~70岁T2DM组4个研究对象群,黑头发的mtDNA异质性分别为：3%,10%,9%,17%,白头
发的mtDNA异质性分别为：9%,20%,21%,40%。其中同年龄T2DM组和对照组比较：20~45岁、45~70岁2个年龄组T2DM患
者黑头发mtDNA异质性均高于同年龄对照组,45~70岁T2DM组白头发mtDNA异质性也高于同年龄对照组患者;不同年龄的
T2DM组以及不同年龄对照组之间比较：45~70岁对照组白头发mtDNA异质性高于20~45岁对照组、45~70岁T2DM组黑头发
mtDNA异质性明显高于20~45 岁T2DM患者(P<0.05) ;组内比较：白头发mtDNA异质性在45~70 岁对照者和2 个年龄组的
T2DM患者组内内明显高于黑头发(P<0.05)。结论T2DM患者mtDNA异质性增高,年龄越大程度越高。
     

不同年龄Ⅱ型糖尿病患者中黑白头发mtDNA异质性研究

目的研究T2DM患者头发中mtDNA异质性的规律。方法选择T2DM高突变位点的mtDNA编码区和控制区2片段进行PCR扩增,以DHPLC技术分析黑、白头发mtDNA目标片段在T2DM组和对照组异质性差异。结果在20~45岁对照组、20~45岁T2DM组、45~70岁对照组和45~70岁T2DM组4个研究对象群,黑头发的mtDNA异质性分别为:3%,10%,9%,17%,白头发的mtDNA异质性分别为:9%,20%,21%,40%。其中同年龄T2DM组和对照组比较:20~45岁、45~70岁2个年龄组T2DM患者黑头发mtDNA异质性均高于同年龄对照组,45~70岁T2DM组白头发mtDNA异质性也高于同年龄对照组患者;不同年龄的T2DM组以及不同年龄对照组之间比较:45~70岁对照组白头发mtDNA异质性高于20~45岁对照组、45~70岁T2DM组黑头发mtDNA异质性明显高于20~45岁T2DM患者(P<0.05);组内比较:白头发mtDNA异质性在45~70岁对照者和2个年龄组的T2DM患者组内内明显高于黑头发(P<0.05)。结论 T2DM患者mtDNA异质性增高,年龄越大程度越高。     

七宝美髯丹对60岁以上肝肾不足老年人黑白头发mtDNA异质性影响

目的 :研究七宝美髯丹对60岁以上肝肾不足老年人黑白头发mtDNA异质性影响。方法 :选择mtDNA高突变位点的编码区和控制区的2片段进行PCR扩增,以DHPLC技术分析黑、白头发mtDNA目标片段在七宝美髯丹治疗组和对照组异质性差异。结果 :七宝美髯丹治疗组黑头发在纳入观察时、纳入观察后30 d和60 d时mtDNA出现异质性比率和对照组比较均没有统计学差异;七宝美髯丹治疗组白头发在纳入观察后30 d和60 d时mtDNA出现异质性比率和对照组比较有下降,但没有统计学差异。以mtDNA编码区和控制区2个区域共60个mtDNA片段发生异质性总和数进行七宝美髯丹治疗组和对照组比较,纳入观察后60 d,二者有统计学差异。结论 :七宝美髯丹能减轻60岁以上肝肾不足老年人白头发mtDNA异质性。     

应用DHPLC技术分析浙江沿海地区ESBLs基因类型的研究

目的应用变性高效液相色谱（denaturinghigh—performanceliquidchromatography,DHPLC）技术检测超广谱β-内酰胺酶（extendspectrumβ-lactamases,ESBLs）基因型,了解浙江沿海地区ESBLs基因型分布情况。方法收集171株多重耐药肠杆菌及标准菌株采用多重PCR进行头孢克肟-M型（CTX—M）扩增,扩增产物经DHPLC分析．确定临床菌株基因分型。结果171株多重耐药肠杆菌经表型试验有142株Il缶床菌株ESBLs表型阳性,经多重PCR扩增109株携带CTX—M基因,其中52株为CTX—M-1产物,57株为CTX—M-9产物．检出率达76．8％（109／142）。其中大肠埃希菌携带CTX—M基因比例最高（92．3％）,其次是肺炎克雷伯菌（72．3％）和阴沟肠杆菌（60．0％）。109株临床菌株PCR产物经DHPLC分析检测出4种CTX—M基因型,33株携带CTX—M-3、19株携带CTX—M-15、5株携带CTX—M-9、52株携带CTX—M-14。结论CTX—M型ESBLs菌株检测出4种基因型,CTX—M-3、CTX—M-15、CTX—M-9和CTX—M-14,其中CTX—M-14型是CTX—M型ESBLs主要型别。浙江沿海地区携带CTX—M型ESBLs的细菌以大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌为多见．     

七宝美髯丹对60岁以上肝皆不足老年人黑白头发mtDNA再质性影响

目的：研究七宝美髯丹对60岁以上肝肾不足老年人黑白头发mtDNA异质性影响。方法：选择mtDNA高突变位点的编码区和控制区的2片段进行PCIK扩增,以DHPLC技术分析黑、白头发mtDNA目标片段在七宝美髯丹治疗组和对照组异质性差异。结果：七宝美髯丹治疗组黑头发在纳入观察时、纳入观察后30d和60d时mtDNA出现异质性比率和对照组比较均没有统计学差异;七宝美髯丹治疗组白头发在纳入观察后30d和60d时mtDNA出现异质性比率和对照组比较有下降,但没有统计学差异。以mtDNA编码区和控制区2个区域共60个mtDNA片段发生异质性总和数进行七宝美髯丹治疗组和对照组比较,纳入观察后60d,二者有统计学差异。结论：七宝美髯丹能减轻60岁以上肝肾不足老年人白头发mtDNA异质性。     

杂合突变的PCR产物中包含异源双链DNA片段的研究

目的:验证杂合突变的PCR产物中包含异源双链DNA片段.方法:采用PCR、PAGE电泳和变性高效液相色谱分析的方法,对中国人表皮松解性掌跖角化症致病基因KRT9第1外显子的杂合的碱基插入/缺失突变(497delAinsGGCT)进行实验验证.结果:KRT9基因第1外显子碱基插入/缺失突变(497delAinsGGCT)杂合子的PCR产物,本身包含2种异源双链DNA片段和2种同源双链DNA片段,不需要经过额外的变性、退火处理.结论:在用DGGE、TGGE、DHPLC和HA等需要形成杂合双链体的基因突变检测技术进行突变检测时,如果突变为杂合子,则PCR产物可以直接进行突变检测,不需要预先加热/冷却等预处理以形成异源双链DNA分子.     

应用变性高效液相色谱技术筛查一个正常血钾性周期性麻痹家系的SCN4A基因突变

目的 应用变性高效液相色谱(DHPLC)技术筛查一发生Met1592Val替换的正常血钾性周期性麻痹(normoKPP)家系的SCN4A基因,证实该突变为疾病相关突变,并总结其在此家系的临床表型特点。方法 总结一normoKPP家系14例患者的临床特点,应用DHPLC技术筛查SCN4A基因全部24个外显子,并对发现异常洗脱峰者进行测序。结果 该家系具有典型的normoKPP临床特征,无肌强直表现及早显、性别偏移现象,病程呈良性过程,发病早晚与症状严重程度及预后无相关。DHPLC筛查发现在外显子1及24存在杂合二倍体,测序及连锁分析证实位于外显子1的突变为良性多态性,外显子24的Met1592Val替换为疾病相关突变。结论 国人存在Met1592Val突变,此突变可导致normoKPP。normoKPP与高钾性周期性麻痹临床表现相似,两者可存在共同突变。     

应用变性高效液相色谱筛查颅内静脉系统血栓形成AT-Ⅲ基因突变及多态性

目的 应用变性高效液相色谱(DHPLC)方法筛查生育期女性颅内静脉系统血栓形成(CVT)AT-Ⅲ基因的突变及多态性.方法 标本来自于2006年6月～2007年12月南方医院生育期女性CVT患者,及52例严格配伍的健康女性外周静脉血.提取所有受试者全血DNA.PCR扩增后应用变性高效液相色谱(DHPLC)技术分析抗凝血酶-Ⅲ(AT-Ⅲ)基因的启动子区,第1～6外显子及其侧翼序列的基因变异情况.结果 DHPLC技术分析发现病例组出现6种异常峰形,经测序证实1例致病突变为Exon6 G13328A的杂合突变,1例新发现的同义突变Exon4+243 G>A;SNP位点6个,其中4个SNP库已报道的SNP位点.2个新发现的SNP位点,对照组发现一种异常峰型(三峰).结论 DHPLC是一种自动、快速、高通量的基因突变及SNP位点的筛查方法,AT-Ⅲ基因突变可能是导致生育期非妊娠女性CVT的遗传因素之一,功能性SNP位点也可能参与了该人群VTE的发生.

Abstract：

Objective To identify antithrombin Ⅲ(AT- Ⅲ) gene mutation and polymorphisms in pregnant women and parturients with cerebral venous thrombosis (CVT) using denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC). Methods The genomic DNA was extracted from the blood samples of 50 pregnant women and parturients with CVT and 52 matched healthy women for molecular analysis using a PCR/DHPLC assay followed by DNA sequence analysis. Ten primer pairs were designed for amplifying the AT-Ⅲ promoter region and exons 1-6 including the exon/intron boundaries. A rapid screening assay based on DHPLC was established to screen the mutation and polymorphisms of AT- Ⅲ gene. Results Six abnormal peaks were detected in 40 of the patients by DHPLC. Direct DNA sequencing was performed on representative samples detected by DHPLC profiling. One pathogenic heterozygous G13328A missense mutation in exon 6, and a novel silent mutation in exon 4+243 G>A were identified. Six single nucleotide polymorphism (SNP) sites were found, including 4 previously reported ones in the SNP library and two were novel SNP sites. An abnormal peak was detected in the control group by DHPLC. Conclusion DHPLC allows automated and rapid high-throughput detection of AT-Ⅲ gene mutation and polymorphisms in the clinical setting and prenatal diagnosis. Our findings suggested that AT-Ⅲ gene mutation, as well as its polymorphisms, contributes to the occurrence of CVT in pregnant women and parturients.     

肺腺癌患者血浆线粒体DNA D-LOOP高变区基因突变的研究

目的探讨检测线粒体DNA D-LOOP高变区基因突变对于肺腺癌诊断的参考价值。方法选取肺腺癌患者31例,分别提取血浆和癌组织DNA,用聚合酶链反应扩增血浆和癌组织线粒体DNA的D环HVR1,然后用变性高效液相色谱法进行突变筛选。直接测序法测定D环HVR1序列,确定肺腺癌患者组织和血浆中的D环HVR1区的基因突变。结果与对照组相比,肺腺癌患者的血浆和癌组织DNA的扩增率有显著差异(P<0.05),D-LOOP高变区HVR1存在点突变。结论线粒体基因D环高变区HVR1在肺腺癌肿的突变在肺腺癌的诊断中可能有一定作用。     

人类线粒体DNA多态区荧光标记序列分析的研究及其在法庭科学中的应用

人类线粒体ＤＮＡ多态区荧光标记序列分析的研究及其在法庭科学中的应用张纯斌周静倪锦堂李伯龄（公安部第二研究所）ＤＮＡ分析技术在法庭科学中的应用是一个重要的分支，以往的ＤＮＡ个体识别与亲子关系鉴定分析技术主要有对存在于细胞核中的ＤＮＡ做各种不同方式的分析...     

应用部分变性高效液相色谱技术检测胃癌组织、血清中基因突变的研究

目的:探讨部分变性高效液相色谱(DHPLC)在检测胃癌组织、血浆中基因突变中的应用.方法:应用DHPLC对39例胃癌组织及血清中p53基因突变进行检测,并测序验证.结果:本研究中p53基因的突变率为21%(8/39);其中肠型胃癌突变率40%(6/15)明显高于弥漫型胃癌8.33%(2/24)(P＜0.01);发现既往未见报道突变3例.血清标本中50%(4/8)可扩增出目的片段,但均未检出突变.结论:DHPLC是一项较好的检测胃癌组织中基因突变的筛查方法,在血清中的应用仍需探讨.     

遗传性非息肉病性结直肠癌患者的临床特点及hMSH2与hMLH1种系突变的筛查

目的　分析我国遗传性非息肉性结直肠癌 (HNPCC)患者的临床特点 ,报告hMSH2和hMLH1基因突变筛查结果。方法　共收集了 2 8个家系 ,其中 15个家系符合阿姆斯特丹Ⅰ标准 ,13个家系符合日本临床诊断标准。记录的数据包括患者性别 ,结直肠癌发生的部位 ,诊断年龄 ,是否具有同时和 /或异时结直肠癌及结肠外癌 ,肿瘤的组织病理特点等。通过PCR及变性高效液相色谱分析(DHPLC)筛查hMSH2和hMLH1基因的突变 ,然后对DHPLC图形异常的样本进行测序。结果　 12 6例患者共诊断 170例次恶性肿瘤 (2 3例患有多原发癌 )。 98例 (77 8% )的患者患有结直肠癌 ,且发病年龄早 (平均 4 5 9岁 ) ,右侧癌多见。共在 12个家系中发现 8种hMSH2或hMLH1基因序列改变 ,其中hMSH2基因的第 3个外显子的无义突变即G2 0 4X是发现的首例我国蒙古族家系错配修复 (MMR)基因突变。结论　HNPCC患者是恶性肿瘤 (尤其是结直肠癌 )的高发人群。DHPLC是一种非常有效的筛选hMSH2和hMLH1基因突变的方法。在我国hMLH1基因尤其是其前九个外显子的突变较hMSH2基因的突变更常见。     

乳腺癌患者血清中20种氨基酸的检测及在乳腺癌筛查中的意义

目的 考察乳腺癌患者与正常体检者血清中氨基酸水平的差异,并探讨其在乳腺癌筛查中的意义.方法 招募2019年4-6月重庆大学附属肿瘤医院病理科确诊的女性乳腺癌患者59例作为乳腺癌组,以正常女性体检者53例作为对照组.采用高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)检测招募者血清中20种氨基酸水平,分析乳腺癌组与对照组间、乳腺癌不同分子亚型组间、早期乳腺癌组与晚期乳腺癌组间氨基酸水平的差异.采用ROC曲线对差异血清氨基酸在乳腺癌筛查中的效能进行评估.结果 乳腺癌组血清中丙氨酸(Ala)、天冬酰胺(Asn)、瓜氨酸(Cit)、谷氨酸(Glu)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、鸟氨酸(Orn)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)的水平均高于对照组(P均<0.05),精氨酸(Arg)水平低于对照组(P=0.003).ROC曲线分析表明,在乳腺癌患者血清中升高的14种氨基酸中,Ala和Pro单独筛查乳腺癌的效能较高,AUC均为0.75;Ile单独筛查乳腺癌时有最高的灵敏度,达0.82;Lys单独筛查乳腺癌时有最高的特异度,达0.94;这14种氨基酸联合检测时能够提高乳腺癌的筛查效能,AUC为0.88,灵敏度为0.69,特异度为0.94.早期乳腺癌(TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期)患者血清Val水平高于晚期(TNM分期Ⅲ期和Ⅳ期)患者(P=0.044),其他19种氨基酸水平在早期和晚期乳腺癌患者之间差异均无统计学意义(P均>0.05).20种血清氨基酸水平在Luminal A型、Luminal B型、三阴性型、人表皮生长因子受体2(HER2)阳性型乳腺癌组间差异均无统计学意义(P均>0.05).结论 乳腺癌患者血清中15种氨基酸水平与正常体检者相比存在差异,有助于乳腺癌筛查;14种在乳腺癌患者血清中升高的氨基酸的联合检测有利于提高乳腺癌筛查效能,是有潜力的生物学标志物.     

海南黎族人缺血性脑卒中与MTHFR基因多态性关系的研究

目的探讨N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性与海南黎族缺血性脑卒中(IS)的关系。方法运用变性高效液相色谱(DHPLC)技术检测87例海南黎族IS组及83例对照组的MTHFR基因多态性。结果IS患者的MTHFR基因TT、CT、CC基因型频率分别为8.0%、64.4%、27.6%,T等位基因频率为40.2%,C等位基因频率59.8%;对照组的TT、CT、CC基因型频率分别为3.6%、39.8%、56.6%,T等位基因频率为23.5%,C等位基因频率76.5%,两组的TT基因型及T等位基因频率比较差异有显著性意义。结论MTHFR基因多态性与海南黎族IS有一定关系,MTHFR基因可能是IS的易感基因,对人群进行大规模筛选,早期对TT和CT基因型的人群进行维生素干预,对预防IS的发生有一定价值。     

两种尿蝶呤谱检测方法的比较及在高苯丙氨酸血症中的应用

目的 对碘(I₂)氧化法和二氧化锰(MnO₂)氧化法两种前处理方法在尿蝶呤谱检测进行方法学评价,提高尿蝶呤谱在高苯丙氨酸血症(HPA)诊断及分型准确率。方法 分别用I₂氧化法和MnO₂氧化法处理65例尿液样本,通过定量分析尿液中新蝶呤(N)和生物蝶呤(B)含量、比较两种方法的最低检测限、精密度和回收率,以及分析两种方法在HPA的诊断符合率。结果 I₂氧化法和MnO₂氧化法处理苯丙酮尿症(PKU)、四氢生物蝶呤缺乏症(BH₄D)和正常儿童尿液样本,诊断符合率均达100%。I₂氧化法检测的N和B浓度均高于MnO₂氧化法,差异有统计学意义(P<0.05)。两种方法N的检测限[I₂氧化法：(0.000 63±0.000 27)μg/L;MnO₂氧化法：(0.000 76±0.000 32)μg/L];B的检测限[I₂氧化法：(0...