外源性Wnt-3a促进急性T淋巴细胞白血病细胞增殖与细胞周期进展

目的 应用重组腺病毒介导的Wnt-3a激活急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat中的经典Wnt/β-catenin信号途径,观察该途径激活后对Jurkat细胞增殖及细胞周期的影响,初步探讨其在急性T淋巴细胞白血病分子发病机制中的作用.方法 将携带Wnt-3a基因的重组腺病毒(Ad5-Wnt-3a)感染Jurkat细胞,实验分为3组:实验组(Jurkat/Ad5-Wnt-3a)、空载体组(Jurkat/Ad5-GFP)和空白对照组(Jurkat).转染后,采用RT-PCR方法检测Jurkat细胞内Wnt-3a mRNA的表达;Western blot检测细胞内β-catenin蛋白的表达;MTT法检测细胞增殖,FCM法检测细胞周期,RT-PCR检测Wnt信号通路下游靶基因c-myc和cyclin D1 mRNA表达.结果 重组腺病毒Ad5-Wnt-3a转染Jurkat细胞后48 h,实验组有效表达Wnt-3a的基因.Western blot结果显示,与对照组比较,实验组细胞内β-catenin蛋白表达明显增加(P<0.05).MTT结果显示,Wnt-3a转染后48 h和72 h可明显促进Jurkat细胞的增殖,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).FCM检测发现,Wnt-3a转染后可引起细胞G0/G1期下降,S期升高(P<0.05).RT-PCR检测结果显示细胞内c-myc和cyclin D1 mRNA表达升高,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).结论 腺病毒介导的Wnt-3a可以激活Jurkat细胞中的经典Wnt/β-catenin信号途径,使Jurkat细胞增殖,促进细胞周期进展,其可能的机制是通过调控其下游靶基因c-myc和cyclin D1的表达实现.     

沉默重组蛋白2对NCI-H1688细胞的抑制作用及其Wnt/β连环蛋白信号通路机制

目的：探讨T细胞淋巴瘤常见重排蛋白2（Frat2）通过Wnt/β连环蛋白（β-catenin）信号通路对小细胞肺癌NCI-H1688细胞增殖的影响,阐明其可能机制。方法：选取生长状态良好的人小细胞肺癌NCI-H1688细胞和正常支气管上皮样细胞HBE细胞,采用Western blotting法和逆转录实时荧光定量-聚合酶链反应（Real-Time RT-qPCR）法分别检测NCI-H1688细胞和HBE细胞中Frat2蛋白及mRNA表达水平。NCI-H1688细胞随机分为空白对照组、阴性对照组、Frat2-siRNA组和Frat2-siRNA+XAV组。空白对照组细胞不转染,阴性对照组细胞转染阴性对照慢病毒,Frat2-siRNA组转染Frat2-siRNA慢病毒,Frat2-siRNA+XAV组转染Frat2-siRNA慢病毒并同时加入4 μmol·L^-1Wnt信号通路抑制剂XAV939。采用Western blotting法和Real-Time RT-qPCR法分别检测转染后各组细胞中Frat2蛋白和mRNA表达水平,采用MTT法检测各组细胞增殖活性,采用流式细胞术检测不同细胞周期细胞百分率,采用Western blotting法检测细胞中增殖细胞核抗原（PCNA）、c-myc、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、β-catenin和磷酸化糖原合成酶激酶3（pGSK-3β）蛋白表达水平。结果：与HBE细胞比较,NCI-H1688细胞中Frat2蛋白和mRNA表达水平明显升高（P<0.01）。与空白对照组和阴性对照组比较,Frat2-siRNA组NCI-H1688细胞中Frat2蛋白和mRNA表达水平明显升高（P<0.05）;空白对照组与阴性对照组NCI-H1688细胞中Frat2蛋白和mRNA表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。与空白对照组和阴性对照组比较,Frat2-siRNA组细胞增殖活性降低（P<0.05）,G₀/G₁期细胞百分率升高（P<0.05）,S期和G₂/M期细胞百分率降低（P<0.05）,PCNA、c-myc、Cyclin D1、β-catenin和pGSK-3β蛋白表达水平降低（P<0.05）;与Frat2-siRNA组比较,Frat2-siRNA+XAV组细胞增殖活性降低（P<0.05）,G₀/G₁期细胞百分率升高（P<0.05）,S期和G₂/M期细胞百分率降低（P<0.05）,PCNA、c-myc、Cyclin D1、β-catenin和pGSK-3β蛋白表达水平降低（P<0.05）;空白对照组与阴性对照组上述各指标比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：沉默Frat2可抑制小细胞肺癌细胞增殖,其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。     

ADAMDEC1通过激活Wnt/β-catenin信号转导通路促进T-ALL细胞的增殖

目的 研究去整联蛋白金属蛋白酶家族癸蛋白1(a disintegrin and metalloprotease like decysin 1,ADAMDEC1)对T细胞急性淋巴细胞白血病（T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL）细胞生物学行为的影响及其潜在的分子机制。方法 qRT-RCR和Western blot检测ADAMDEC1在人T淋巴细胞H9与T-ALL细胞Jurkat和CCRF-CEM的表达。CCK-8法检测ADAMDEC1siRNA干扰表达后T-ALL细胞增殖的变化。流式细胞术检测ADAMDEC1siRNA干扰后T-ALL细胞凋亡情况。Western blot检测干扰ADAMDEC1后凋亡及Wnt/β-catenin通路相关分子蛋白水平的变化。结果 ADAMDEC1在CCRF-CEM和Jurkat细胞中高表达。干扰ADAMDEC1后CCRFCEM和Jurkat细胞增殖能力降低,细胞凋亡率增高。干扰ADAMDEC1可促进GSK-3β的表达,抑制β-catenin、pGSK-3β和c-Myc的蛋白水平。Wnt/β-catenin通路...     

慢病毒介导的TSPY1对肝癌SMMC7721和Huh7细胞系增殖的影响

目的：观察转染睾丸特异性蛋白1（ TSPY1）慢病毒表达载体对肝癌细胞SMMC7721和Huh7细胞系增殖能力的影响。方法构建特异性的TSPY1慢病毒过表达载体稳定转染至SMMC7721和Huh7肝癌细胞系,采用荧光定量PCR和蛋白印迹技术检测TSPY1 mRNA和蛋白的表达情况,Cell Counting Kit-8（CCK-8）实验检测转染后细胞的增殖情况。结果在转染过表达TSPY1慢病毒的SMMC7721和 Huh7细胞中, TSPY1 mRNA和蛋白的表达均明显上调（ P＜0.01）。 CCK-8细胞增殖实验发现,过表达TSPY1组SMMC7721和Huh7细胞的增殖能力比对照组增强。结论 TSPY1慢病毒表达载体可明显上调TSPY1 mRNA和蛋白表达,并能够促进肝癌SMMC7721和Huh7细胞的增殖。     

慢病毒转染KISS1基因对人结直肠癌HCT116细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响

目的：探讨慢病毒转染KISS1基因过表达对结直肠癌HCT116细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响,并阐明其作用机制。方法：选取KISS1基因低表达结直肠癌细胞株,构建慢病毒载体并转染KISS1基因,分为对照组（PBS处理）、空载体组（转染空载体）和过表达组（转染含KISS1载体）。荧光显微镜检查转染的荧光率（MOI）,Real-time PCR和Western blotting法检测各组细胞中KISS1mRNA和蛋白（metastin）的表达量,采用CCK-8法检测各组细胞增殖活力,Transwell小室法检测各组细胞侵袭和迁移能力。结果：LoVo、SW620 、SW480、HCT-116和HT29细胞中,HCT-116细胞中KISS1mRNA和蛋白表达量相对最低,因此筛选其作为研究载体。包装有KISS1基因的慢病毒感染HCT-116细胞后,能够稳定表达增强绿色荧光蛋白（EGFP）基因,MOI均>80%。与对照组和空载体组比较,过表达组细胞中KISS1 mRNA和蛋白表达量明显升高（P<0.05）,细胞增殖活力明显降低（P<0.05）,侵袭能力和迁移能力亦明显下降（P<0.05）;与对照组比较,空载体组细胞增殖活力、侵袭能力和迁移能力差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：慢病毒转染KISS1基因能够过表达KISS1蛋白及抑制结直肠癌细胞增殖、侵袭及迁移能力,其机制可能与KISS1蛋白表达有关。     

shRNA 沉默YAP基因对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨慢病毒干扰载体沉默Yes-相关蛋白（Yes-associated protein,YAP）对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响。方法：用细胞免疫荧光法检测肾癌786-O细胞中YAP蛋白表达情况;构建针对YAP基因的shRNA慢病毒干扰载体转染786-O细胞。RT-PCR和Western blot分别检测干扰786-O细胞前后 YAP mRNA及蛋白的表达情况;CCK-8（cell counting kit-8）法检测沉默YAP后细胞增殖的改变;流式细胞仪（flow cytometry,FCM）检测细胞凋亡和周期的变化。结果：786-O细胞中YAP蛋白表达于细胞浆和细胞核;shRNA-YAP慢病毒干扰载体转染4 d后,可明显下调786-O细胞YAP mRNA及蛋白表达水平（P=0.000）,并且明显抑制细胞增殖和促进细胞凋亡（P=0.000）;细胞周期紊乱,G1 期细胞明显增加,S期细胞明显降低（P=0.000）。结论：YAP-shRNA慢病毒干扰载体能有效抑制YAP基因在786-O细胞中表达,进而抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。     

Let-7a过表达对结肠黏液腺癌细胞LS-174T增殖及侵袭性的影响

目的：研究let-7a过表达对结肠黏液腺癌LS-174T细胞增殖及侵袭性的影响。方法：构建let-7a过表达慢病毒载体并感染结肠黏液腺癌LS-174T细胞,设立空白对照组（A组,不进行病毒转染）;转染空病毒组（B组,只含有EGFP,浓度1×107 TU/L）;C1转染组（C1组,浓度1×106 TU/L）：转染hsa-Let-7a（含let-7a病毒和EGFP）;C2转染组（C2组,浓度1×107 TU/L）;C3转染组（C3组,浓度1×108 TU/L）。通过倒置荧光显微镜观察各组感染效率;RT-qPCR检测各组细胞中let-7a基因表达水平;MTT法检测各组细胞增殖活力;Transwell侵袭和划痕实验测评估细胞的侵袭和迁移能力;RT-qPCR和Western blot分析TGF-β1 mRNA和蛋白水平的表达。结果：倒置荧光显微镜观察各组细胞48 h绿色荧光表达情况,C3组荧光表达最强,感染效率可达90%以上,与初始病毒浓度成正相关（P＜0.05）;MTT检测结果显示各组OD值均随时间延长而增高,在第0、第1天,5组OD值差异无统计学意义（P＞0.05）,第2、第3、第4天,与A组比,C组的OD值增幅明显降低（P＜0.05）;各组细胞let-7a基因表达水平行RT-qPCR检测结果显示,与A组比,C组let-7a的基因表达水平显著升高,且转染细胞let-7a的表达水平与含let-7a的慢病毒浓度梯度呈正相关（P＜0.05）,而RT-qPCR及Western blot检测显示let-7a过表达后TGF-β1 mRNA和蛋白水平逐渐降低（P＜0.05）。侵袭和划痕实验结果表明,let-7a的过表达降低了LS-174T细胞的侵袭和迁移能力,且与初始病毒浓度成负相关（P＜0.05）。结论：Let-7a过表达对LS-174T细胞增殖活力有明显抑制作用,可通过下调TGF-β1含量而抑制细胞的侵袭和转移。     

miR-382-5p过表达介导PTEN的表达下调对人脑胶质瘤U251细胞恶性生物学行为的影响

  目的  探究miR-382-5p过表达对人脑胶质瘤U251细胞恶性生物学行为的影响。  方法  将miR-382-5p mimic转染入U251细胞,逆转录-聚合酶链反应检测miR-382-5p、磷酸酶-张力蛋白同源物（PTEN） mRNA水平;生物信息学预测miR-382-5p与PTEN存在碱基结合位点,构建PTEN pcDNA载体过表达,荧光素酶报告实验检测miR-382-5p与PTEN靶向关系,将细胞随机分为4组:Control组、mimics组、pc-PTEN组和mimics+pc-PTEN组进行后续实验,逆转录-聚合酶链反应检测各组细胞PTEN水平;克隆形成法检测细胞增殖;逆转录-聚合酶链反应检测Ki67、 Survivin、 c-Myc mRNA水平;Transwell检测细胞侵袭能力;蛋白免疫印迹检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平。  结果  miR-382-5p和PTEN存在直接靶向作用关系,与Control组相比较,mimics组miR-382-5p mRNA水平升高（P<0.05）,PTEN mRNA水平降低（P<0.05）,细胞克隆形成率降低（P<0.05）,Ki67、Survivin mRNA水平降低（P<0.05）,c-Myc mRNA水平升高（P<0.05）,细胞侵袭数降低（P<0.05）,E-cadherin蛋白水平升高（P<0.05）,N-cadherin、Vimentin蛋白水平降低（P<0.05）。pc-PTEN组miR-382-5p mRNA水平降低（P<0.05）,PTEN mRNA水平升高（P<0.05）,细胞克隆形成率升高（P<0.05）,Ki67、Survivin mRNA水平升高（P<0.05）,c-Myc mRNA水平降低（P<0.05）,细胞侵袭数升高（P<0.05）,E-cadherin蛋白水平降低（P<0.05）,N-cadherin、Vimentin蛋白水平升高（P<0.05）;与pc-PTEN组相比较,mimics+pc-PTEN组miR-382-5p mRNA水平升高（P<0.05）,PTEN mRNA水平降低（P<0.05）,细胞克隆形成率降低（P<0.05）,Ki67、Survivin mRNA水平降低（P<0.05）,c-Myc mRNA水平升高（P<0.05）,细胞侵袭数降低（P<0.05）,E-cadherin蛋白水平升高（P<0.05）,N-cadherin、Vimentin蛋白水平降低（P<0.05）。  结论  miR-382-5p过表达介导PTEN的表达下调可抑制胶质瘤U251细胞增殖、侵袭、生长和上皮细胞-间充质转化。     

CHD4基因表达对急性T淋巴细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响及其启动子鉴定

目的:探讨人染色质解旋酶DNA结合蛋白4(recombinant chromodomain helicase DNA binding protein 4,CHD4)基因表达对急性T细胞淋巴细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响及其启动子鉴定.方法:使用siRNA-CHD4瞬时转染T淋巴细胞白血病细胞(Jurkat)敲低CHD4...     

CXCR7-shRNA慢病毒载体对人肝癌细胞生长及侵袭能力的抑制作用

目的探讨CXCR7-shRNA慢病毒表达载体靶向抑制CXCR7的表达对人肝癌细胞增殖及侵袭能力的影响。方法利用
RNA干扰技术,构建CXCR7的shRNA慢病毒表达载体,转染人肺转移肝癌细胞株HCCLM3,分别通过RT-PCR和Western blot
检测HCCLM3细胞中CXCR7 mRNA和蛋白质表达水平的变化;然后通过MTT法考察CXCR7沉默对HCCLM3细胞增殖侵袭
能力的影响,通过体外粘附实验和Transwell小室法分别考察CXCR7沉默对HCCLM3细胞粘附及侵袭能力的影响。结果与空
白对照组比较,转染CXCR7-shRNA慢病毒载体的HCCLM3细胞中CXCR7 的mRNA及蛋白水平表达均明显降低（P<0.01）,
SDF-1诱导的HCCLM3细胞的增殖能力显著下降（P<0.05）,同时HCCLM3细胞的粘附及侵袭能力也明显受到CXCR7-shRNA
的抑制（P<0.01）。结论靶向沉默CXCR7能显著抑制结肝癌细胞的增殖和侵袭能力,为肝癌的治疗提供一个潜在的作用靶点。