基于Cas9靶向富集的纳米孔高通量基因测序技术的应用进展

高通量测序已逐渐成为医学与生命科学领域的一种重要技术方法,但全基因组序列分析的复杂性和测序的高成本仍是目前高通量测序的障碍。靶向测序是一种捕获基因组特定区域DNA并进行高深度测序的方法,它在遗传性疾病、癌症测序和精准医学等方面具有广泛应用。目前常见的靶向富集方法主要有杂交捕获法和多重PCR扩增法。杂交捕获法过程繁琐、成本昂贵,PCR扩增法容易受扩增效率影响导致靶序列文库丰度不均匀,且会丢失DNA序列的表观修饰信息。近年来,基于纳米孔测序平台开发了CRISPR/Cas9靶向富集高通量测序方法（nCATs）,可在无需PCR扩增的条件直接对感兴趣的基因位置进行靶向测序。该方法具有直接识别碱基修饰、读长长、实时检测、速度快等优势,在基因结构性变异、突变检测和基因的甲基化修饰检测等方面展现了良好应用前景。尤其是在融合基因的检测方面,该技术通过结合生物信息学的分析工具可检测新的融合基因和断裂位点,在临床诊疗方面具有重要的指导意义。本文将对CRISPR/Cas9靶向富集纳米孔基因测序技术的基本原理和上述应用场景进行综述,并重点阐述该技术在融合基因检测方面的最新进展。     

湖南地区结直肠癌中错配修复蛋白MSH2、MSH6、MLH1及PMS2的表达与临床病理特征的关系

目的:探讨错配修复蛋白MSH2、MSH6、MLH1及PMS2在结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)组织中的表达及其临床病理意义。方法:应用免疫组化PV法检测结直肠癌组织(191例)中MSH2、MSH6、MLH1及PMS2的表达情况,将4种MMR蛋白中的1种及以上表达缺失判定为错配修复基因缺陷(dMMR),全部阳性判定为错配修复基因完整(pMMR),并分析其与临床病理特征的关系。结果:(1)191例中pMMR组159例,MMR蛋白表达率83.2%,dMMR组32例,MMR蛋白缺失率为16.8%。MSH2、MSH6、MLH1及PMS2的表达缺失率分别为2.6%、2.6%、8.9%及14.7%;其中共同缺失表达类型为MSH2-MSH6、MLH1-PMS2及4种共同缺失者分别为4例(2.1%)、14例(7.3%)、2例(1.0%)。(2)CRC癌患者dMMR与pMMR在肿瘤部位、肿瘤直径、分化程度等临床病理特征方面比较,差异均有统计学意义(P0.05),而在性别、年龄、浸润深度、淋巴结转移、脉管侵犯和神经侵犯等方面比较,差异均无统计学意义(P0.05)。结论:MMR蛋白与CRC临床病理特征关系密切。MMR蛋白对预测CRC的恶性程度、临床预后及发病机制方面可能有指导意义。     

结直肠癌MMR蛋白和MSI检测对比及临床病理特征分析

目的 探讨结直肠癌( CRC)患者 MMR 蛋白表达与微卫星不稳定( MSI)检测的一致性以及与临床病理特征的相关性,分析两种检测结果不一致的原因.方法 选取 392 例 CRC 石蜡包埋组织( FFPE)样本,采用免疫组化( IHC)法检测 4 种MMR蛋白(MLH1、MSH2、MSH6 及 PMS2)表达,至少1 ...     

前列腺癌DNA错配修复基因缺失的表达研究

为了探讨DNA错配修复基因（MMR）在前列腺癌中的表达及其意义，采用免疫组化方法检测11例前列腺癌患者的20份标本中错配修复基因MSH2，MLH1，PMS1和PMS2的表达，分析了其与前列腺癌发生与发展的关系。结果：这4种MMR基因在肿瘤区的表达都有不同程度的降低，PMS1在肿瘤细胞中大部分缺失或降低，在肿瘤区的表达率依次为MLH1＞MSH2＞PMS2＞PMS1。结论：在前列腺癌组织中PMS1和PMS2蛋白表达的丢失在MMR突变中是占主导的，其不同的丢失与前列腺癌的发生发展有关。     

错配修复蛋白与结直肠癌病理特征及预后的关系研究

目的：探讨错配修复(MMR)蛋白功能状态与结直肠癌(CRC)患者临床病理特征及预后的关系。方法：收集2018年3月—2020年3月本院148例CRC患者，采用免疫组织化学法(IHC)检测手术切除的癌组织标本中MMR蛋白表达情况；分析CRC患者MMR蛋白表达与临床病理特征及预后的关系。结果：148例CRC患者中，错配修复蛋白缺失(dMMR)患者18例(12.16%),其中PMS2联合MLH1缺失10例，MSH6缺失4例，PMS2缺失2例，MSH2联合MSH6缺失2例；CRC患者MMR功能状态与TNM分期、淋巴结转移及分化程度有关(P<0.05),与性别、年龄、肿瘤部位、CEA水平无关(P>0.05);Kaplan-Meier生存分析显示，dMMR组整体生存情况优于pMMR组(P<0.05);COX回归分析表明：TNM分期Ⅲ/Ⅳ、合并淋巴结转移、低分化是CRC患者总生存期(OS)的独立危险因素(P<0.05),dMMR是CRC患者OS的独立保护因素(P<0.05)。结论：CRC患者MMR功能状态与TNM分期、淋巴结转移、分化程度密切相关，dMMR是CRC患者预...     

常染色体显性遗传性听神经病MPZ基因序列分析

目的:了解MPZ基因是否与1个常染色体显性遗传性听神经病中国家系的发病相关.方法:选择1个现存3代9人的常染色体显性遗传性听神经病家系为研究对象,用基因组DNA抽提试剂盒提取外周血DNA.首先.对所有家系成员DNA进行MPZ基因第3外显子的PCR扩增,扩增产物经纯化后直接测序;然后,采用相同方法对1名家系听神经病患者进行MPZ基因全部6个外显子的PCR扩增和测序分析.测序结果与标准序列对照进行突变检测.结果:所有研究对象的基因区域均扩增成功,序列分析在MPZ基因第3外显子上未检测到Thr124Met和Tyr145Ser 2个已知的突变,整个MPZ基因编码区也未见新的致聋突变.结论:该家系成员MPZ基因上未发现有意义的突变位点,提示新基因参与家系耳聋的发生.     

多重竞争性荧光PCR检测X连锁Alport综合征大片段缺失突变

目的 探讨多重竞争性荧光PCR在X连锁Alport综合征分子诊断中的应用。方法 选择20例在北京大学第一医院确诊且未进行基因诊断的X连锁Alport综合征患者为研究对象,同时选择2例经多重连接依赖性探针扩增技术检测到COL4A5基因大片段缺失突变的患者作为阳性对照和1例经肾活检组织电子显微镜检查证实非Alport综合征的男性作为正常对照。首先应用多重竞争性荧光PCR技术扩增COL4A5基因53个外显子和4个参照基因,对于检测到COL4A5基因缺失第1外显子者,进而应用相同技术扩增COL4A5基因外显子1~4、COL4A6基因外显子1~4、两基因共用启动子以及3个参照基因;对于检测到拷贝数缺失者,应用琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增后的PCR产物或直接测序。结果 两例阳性对照应用多重竞争性荧光PCR技术检测到的COL4A5基因缺失突变与应用多重连接依赖性探针扩增技术检测到的COL4A5基因缺失突变一致。20例患者中6例(30%)明确了基因型,其中2例患者具有累及COL4A5和COL4A6两个基因5'端的大片段缺失,2例患者具有累及COL4A5基因30个外显子以上的大片段缺失,1例患者具有累及COL4A5基因至少1个外显子的大片段缺失,1例患者具有COL4A5基因缺失13个碱基的小的缺失突变,未检测到重复突变。结论 多重竞争性荧光PCR技术可用于检测X连锁 Alport 综合征大片段缺失突变,是对该病分子诊断检测方法的重要补充。     

错配修复蛋白及PD-L1在弥漫浸润型胃癌中的表达及意义

目的:研究DNA错配修复(mismatch repair,MMR)蛋白MLHl、PMS2、MSH2、MSH6及程序性死亡配体-1(programmed death ligand 1,PD-L1)在弥漫浸润型胃癌中的表达及意义.方法:选取2017年1月～2019年8月我院收治的弥漫浸润型胃癌33例,收集病理资料,免疫组化...     

两个家系中X连锁视网膜色素变性的RP2 基因无义突变

目的 检测引起2个家系产生X连锁视网膜色素变性的RP2基因突变。方法 根据RP2基因外显子的内含子DNA序列合成8对引物，以人基因组DNA为模板，PCR扩增出包含RP2基因所有外显子的8个片段。扩增产物化后直接测序。通过比较病人和正常人相应的DNA序列，检测基因突变位点。结果 在2个家系中首次检测到RP2基因的同一个无义突变38C→T。突变位于RP2基因的第2外显子。它使该基因编码精氨酸的遗传密码CGA变为终止密码TGA，引起发病。结论 该突变的检出有助于RP2蛋白的功能分析和X连锁视网膜色素变性的基因诊断。     

PMS2基因胚系突变结直肠癌患者免疫组化及微卫星不稳定的表达

目的 分析PMS2基因胚系突变结直肠癌患者的免疫组化及微卫星不稳定表达特征.方法 对符合Amsterdam Ⅱ、修订Bethesda标准、微卫星高度不稳定、免疫组化MMR蛋白表达阴性的结直肠癌患者使用二代测序进行MMR基因胚系突变检测.结果 共检测出PMS2胚系突变27例,其中致病性突变4例,意义未明突变23例.4例致病性突变均表现为PMS2免疫组化单独表达缺失及高度微卫星不稳定.意义未明突变患者中33.3%(7/21)表现为PMS2表达缺失,52.6%(10/19)表现为高度微卫星不稳定.结论 PMS2基因致病性胚系突变结直肠癌倾向于表现为相应蛋白单独表达阴性.PMS2基因意义未明突变相应的表型多变,致病性分类尚需更进一步资料.     

结直肠癌中错配修复蛋白MLH1、PMS2、MSH2、MSH6和Ki-67表达的意义及与预后的关系

目的 探讨错配修复蛋白MLH1、PMS2、MSH2、MSH6和Ki-67的表达在结直肠癌（colorectal cancer, CRC）中的临床意义及与患者预后的相关性分析。方法选取213例符合纳入标准的结直肠癌患者,回顾性分析4种错配修复蛋白和Ki-67的表达在结直肠癌中的临床意义,分析其与随访患者预后的关系。结果在213例病例中, MLH1、PMS2的表达与结直肠癌的病变部位有关（P<0.05),Ki-67的表达与结直肠癌的病变部位、脉管内癌栓侵犯有关（P<0.05）,在男性、未侵及固有肌层、肿瘤分期为Ⅰ期的结直肠癌,4种错配修复蛋白MLH1、PMS2、MSH2、MSH6和Ki-67的表达有相关性（P<0.05）,对符合标准的患者定期随访,微卫星不稳定性、Ki-67的表达与患者的无疾病进展生存率有相关性（P<0.05）。结论错配修复蛋白MLH1、PMS2、MSH2、MSH6和Ki-67的表达在结直肠癌的诊断、治疗及预后评估有一定的指导意义;且在一定情况下,错配修复蛋白MLH1、PMS2、MSH2、MSH6与Ki-67的表达存在相关性。     

高级别子宫内膜癌中错配修复蛋白的表达及其临床病理意义

目的探讨高级别子宫内膜癌(EC)中错配修复蛋白(MMR)缺失率及意义。方法收集2014年6月至2019年10月宁波市临床病理诊断中心诊治的134例高级别EC患者,复阅病理切片再次明确病理诊断、组织学分类和病理学分级。采用免疫组织化学法检测肿瘤细胞MMR蛋白(包括MSH2、MSH6、MLH1和PMS2)的表达,并分析MMR表达与组织学分类的关系。结果 134例高级别EC患者中102例MMR蛋白表达阳性,32例(23.9%),MMR蛋白表达阴性,其中MSH2和/或MSH6阴性12例(9.0%),MLH1和/或PMS2阴性20例(14.9%)。不同组织学类型的高级别EC患者MMR蛋白阴性表达情况如下:EEC 3级20例,CCC 4例,SC 0例,混合性腺癌2例,癌肉瘤2例,未分化癌1例,去分化癌3例。非II高级别型EC患者MMR蛋白阴性率(41.9%)显著高于II型高级别EC患者(8.3%)(P<0.01)。结论在临床工作中碰到组织学类型为非II型高级别EC时,应特别注意检查是否有MMR蛋白缺失性表达,进一步明确其是否具有MMR基因突变,以便进一步作出相应的治疗。     

聚集性林奇综合征家族一例报告

林奇综合征（LS）是一种常染色体显性遗传疾病,由于DNA错配修复（MMR）基因MLH1、MSH2、MSH6、PMS2等出现缺失,导致MMR基因功能缺失,最终导致基因组中高度重复DNA序列不稳定,最终导致肿瘤的发生。本文报道了1例LS相关子宫内膜癌患者,通过遗传咨询和基因检测,发现其背后的聚集性LS家族。临床上对评估有LS相关肿瘤家族史的患者,应考虑LS并进行MMR免疫组化检测,甚则行LS基因检测。诊断LS对个体和家庭成员有重要的临床意义,筛查和预防措施可最大限度地降低其罹患LS相关癌症的总体风险。     

遗传性非息肉病性结直肠癌的分子病理研究

目的研究遗传性非息肉病性结直肠癌的分子病理特征,评估该病在北京地区住院人群中的发病情况。方法 94例结直肠癌组织标本均采集自2012年3~9月于北京市中西医结合医院及解放军总医院住院接受手术治疗并经病理确诊为结直肠癌的患者。使用免疫组化方法对肿瘤组织内错配修复基因MLH1、MSH2、MSH6及PMS2的蛋白表达情况进行检测。结果 94例结直肠癌患者中,至少有一种错配修复基因表达为阴性的共有13例,其中MLH1表达为阴性的有3例,MSH2表达为阴性的有11例,MSH6表达为阴性的有2例,PMS2表达为阴性的仅有1例,遗传性非息肉病性结直肠癌的发病率为13.83%,MSH2基因突变所占比例达84.62%,与遗传性非息肉病性结直肠癌国际合作组织提供的数据（40%）相比,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论北京地区住院的结直肠癌患者中,遗传性非息肉病性结直肠癌发病率高于世界每年新发病例的水平,且MSH2基因突变致病尤为突出。     

微卫星不稳定性类型及临床病理特征： 基于1394例结直肠癌患者的标本检测

目的 研究微卫星不稳定性（MSI）结直肠癌病人错配修复（MMR）基因突变的类型和临床病理特征。方法 收集南方医科大学南方医院2016~2018年1394例结直肠癌病人石蜡标本,采用免疫组化染色技术检测MMR蛋白;MSI基因检测106例dMMR病例,46例肿瘤细胞呈异质性表达的pMMR病例和147例随机选择的pMMR病例;分析错配修复蛋白缺失与结直肠癌临床病理特征参数的关系;比较两种方法检测结果的一致性。结果 MMR蛋白缺失发生率占总结直肠癌病人的7.6%,缺失类型主要为MLH1、PMS2双缺失,占总缺失的55.7%;MMR蛋白缺失与结直肠癌患者的年龄、发生部位、大体分型、肿瘤大小、组织学分型、分化程度和临床TNM分期均有关（P<0.05）,而与患者的性别无关（P=0.47）;dMMR结直肠癌病人具有典型的临床病理特征：MMR蛋白缺失在年龄<50岁、右半结肠、肿瘤直径>6 cm、腺癌伴粘液腺癌或粘液分泌的混合型癌、低分化腺癌和TNM分期Ⅰ/Ⅱ期组的发生率高;免疫组化和PCR-毛细管电泳法在结直肠癌微卫星不稳定性检测结果一致性为98.7%。结论 微卫星不稳定性错配修复蛋白表达缺失（dMMR）在结直肠癌的主要类型为MLH1、PMS2双缺失,具有典型的临床病理特征,其发生率低于西方报道;免疫组化和PCR毛细管电泳法的检测结果显示高度的一致性。     

黏膜相关淋巴组织结外边缘区淋巴瘤错配修复蛋白和微卫星表型检测的临床意义

目的 探讨黏膜相关淋巴组织结外边缘区（extranodal marginal zone of mucosa-associated lymphoid tissue, MALT）淋巴瘤中错配修复（mismatch repair, MMR）蛋白和微卫星表型检测的意义。方法 应用免疫组化法检测40例MALT淋巴瘤（实验组）和20例良性淋巴组织增生（对照组）中MLH1、MSH2、MSH6、PMS2的表达情况。应用多重荧光PCR-毛细管电泳法检测实验组的微卫星表型,分析其与MMR蛋白的关系。结果 （1） MMR蛋白表达分为3种: 缺失（-）,强弱不等阳性（+++）,强阳性（+++）。MMR蛋白在实验组表达构成比差异有统计学意义（P<0.05）,与MLH1[0%(-),45%(+++),55%(+++)],MSH2[0%(-),60%(+++),40%(+++)],PMS2[2.5%(-),45%(+++),52.5%(+++)]相比,MSH6[7.5%(-),80%(+++),12.5%(+++)]在实验组缺失率和强弱不等表达率最高。MMR蛋白在实验组有3例（7.5%）部分缺失,2例为MSH6缺失,1例为MSH6和PMS2共同缺失;在对照组有1例PMS2缺失5%（1/20）,两组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。MSH6在87.5%（35/40）实验组淋巴滤泡内存在斑驳阳性现象,在对照组淋巴滤泡内未见斑驳阳性（0%）,两组免疫形态比较差异有统计学意义（P<0.05）。（2） 在实验组中,35例（87.5%）为微卫星稳定（microsatellite stability, MSS）,1例（2.5%）为低频率微卫星不稳定（microsatellite instability-low, MSI-L）,4例（10%）为高频率微卫星不稳定（microsatellite instability-high, MSI-H）。5例MSI中有2例MSI-H为MSH6缺失,其余3例MSI未出现MMR蛋白缺失。35例MSS中有1例为MSH6和PMS2共同缺失。（3） PCR-毛细管电泳法检测的MSI-H率（10%,4/40）高于免疫组化检测MMR蛋白缺失的检出率（7.5%,3/40）,但两组比较差异无统计学意义（P>0.05）,检出率一致性达92.5%（37/40）。结论 MALT淋巴瘤可检测到低频率的MSI-H表型和MMR蛋白缺失,可能具有潜在的临床意义;MSH6在MALT淋巴瘤的淋巴滤泡内存在高频斑驳阳性的免疫形态,可辅助鉴别肿瘤性淋巴滤泡。     

低龄大肠癌患者MSH2和MLH1基因的变异分析

目的　探讨错配修复基因MSH2、MLH1功能和结构改变在低龄大肠癌患者发病中的作用。方法　配对提取 4 2例低龄 (<5 0岁 )大肠癌患者的正常细胞和肿瘤细胞DNA ,在错配修复基因功能状态分析的基础上 ,对伴有微卫星DNA不稳定 (MSI+ )患者 ,应用变性高效液相色谱技术(DHPLC)、DNA序列分析技术及定量多重PCR技术系统分析MSH2、MLH1基因的微小突变和大片段DNA缺失。结果　 2 2 / 4 2 (5 2 .4 % )的患者肿瘤细胞检出MSI+ ,其中 10 / 4 2为高度不稳定 (MSI+ H) ,12 / 4 2低度不稳定 (MSI+ L)。对MSI+ 患者的进一步突变分析揭示 ,在 9例患者存在MSH2、MLH1基因的 8个位点遗传性单个碱基的改变 ,其中 3/ 8为新发现的点突变 ,5 / 8为基因的多态位点 ;在 2例存在MSI+ H的肿瘤组织检出MSH2基因大片段DNA(exon 1 6 )缺失或MLH1基因的错义突变Met2 4 2Ile。结论　中国人低龄大肠癌患者中MSH2、MLH1基因的遗传性和体细胞性突变为频发事件。     

利用RNA捕获法在全基因组进行egfr启动子片段的富集

目的以表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,egfr)启动子片段为目标靶序列,用RNA捕获法在全基因组进行靶序列的富集,结合第二代测序技术,实现候选基因区段的深度测序。方法本研究以宫颈癌细胞系HeLa S3 egfr启动子为模型,提取基因组后用MboⅠ酶切,补平加PE接头,回收400 bp～1000 bp的DNA片段作为模板,并用egfr启动子RNA与制备的基因组模板杂交将egfr启动子片段富集,富集的DNA片段PCR扩增15轮后用Solexa高通量测序。结果通过生物信息学技术分析,从实验组中随机取总条数为106 reads,比对到egfr启动子片段reads条数为1 889条,而比对到随机挑选的notch 1、pdgf-B、src基因reads条数分别为2、3、3条。从人类全基因组随机取总条数为106的等长reads作为对照组,比对到notch 1、pdgf-B、src、egfr基因reads条数分别为3,2,3,2条。在本实验中egfr启动子片段通过RNA捕获法被富集了630倍。结论用本研究建立的RNA捕获法进行基因组靶序列捕获、富集、测序文库建立的技术路线可行,所建DNA文库可直接用于Solexa测序仪的测序。RNA捕获技术与第二代高通量测序技术结合能应用于靶区域的重测序,研究可变剪切、核小体分布,发现和分析新的单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphisms,SNPs)位点,寻找许多复杂疾病相关基因及位点,针对性强,简便易行,节约成本。