靶向人GSK-3β基因的shRNA真核表达质粒的构建及其在人胰腺癌细胞株PANC-1中的稳定表达

目的 构建针对人糖原合成激酶-3β(GSK-3β)基因的shRNA真核表达质粒,并筛选基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体;转染人胰腺癌细胞株PANC-1,建立稳定表达GSK-3β shRNA的细胞模型.方法 针对GSK-3β基因的mRNA序列设计并分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经...     

连环蛋白p120 shRNA重组慢病毒载体构建及鉴定

目的构建连环蛋白p120特异性shRNA重组慢病毒载体,感染胰腺癌PANC-1细胞,鉴定干扰效果。方法针对p120ctn mRNA设计合成3对shRNA序列,连接入酶切线性化的慢病毒载体pGCSIL-GFP,PCR鉴定及测序正确后与构建成功的含p120ctn基因的载体pGC-FU-p120ctn-3FLAG共转染293T细胞,蛋白质印迹分析筛选有效shRNA序列,包装慢病毒,测定病毒滴度。重组慢病毒感染胰腺癌PANC-1细胞,实时定量PCR及蛋白质印迹分析鉴定干扰效果。结果 PCR及测序证实成功构建出p120ctn-shRNA-LV慢病毒载体,病毒滴度达到3×109TU/ml。重组慢病毒感染PANC-1细胞后,实时定量PCR提示PANC-1细胞p120ctn mRNA表达下降82.6%(P0.05),蛋白质印迹分析提示p120ctn蛋白表达较转染前显著下降。结论成功构建出p120ctn基因shRNA慢病毒载体,为进一步研究p120ctn在胰腺癌浸润及转移中的作用奠定了基础。     

PDX1真核表达载体的构建及其对PANC-1细胞PI3K/AKT信号途径的影响

目的 构建胰腺十二指肠同源框蛋白1(PDX1)基因真核表达载体并转染至PANC-1细胞,观察其对PI3K/AKT信号通路的影响.方法 从Hela细胞中提取总RNA,逆转后PCR扩增PDX1编码区片段,然后将PDX1的CDS插入PCMV6-Entry质粒构建PCMV6-Entry-PDX1表达重组体.重组体转染至PANC-1细胞中通过G418筛选出稳定表达细胞株.Western blot分析PDX1蛋白水平表达及p-AKT水平变化.结果 PDX1基因成功在PANC-1中表达.利用West-ern blot检测验证获得了稳定的PDX1过表达细胞株.West-ern blot结果显示:过表达PDX1的细胞株AKT表达含量与正常细胞及对照细胞没有区别而p-AKT水平降低.结论 PDX1基因过表达能够降低PANC-1细胞的p-AKT水平.     

siRNA靶向稳定干扰HDGF基因胃癌细胞株的建立

目的 构建针对肝癌衍生生长因子(HDGF)基因的siRNA表达载体,建立稳定干扰HDGF表达的胃癌细胞株. 方法 常规聚合酶链反应(PCR)检测HDGF基因在胃癌SGC-7901细胞株的表达情况.构建重组靶向HDGF shRNA慢病毒表达质粒pLentiU6/ HDGFshRNA,用脂质体转染的方法将载体导入胃癌细胞株.经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的细胞株.荧光定量PCR检测干扰效率. 结果 在胃癌SGC-7901细胞株中,HDGF显示高表达.测序验证pLentiU6/HDGFshRNA重组质粒构建成功;在将干扰表达质粒稳定转染入胃癌细胞株后能明显抑制HDGF mRNA表达水平. 结论 成功构建了pLentiU6/HDGFshRNA慢病毒重组质粒,建立了稳定靶向干扰HDGF表达的siRNA胃癌细胞株.     

人AQP1-shRN A 表达质粒载体的构建与筛选

目的：构建针对人水通道蛋白1（AQP1）基因的shRNA表达质粒载体,并验证其干扰效果,为进一步探讨AQP1基因对人乳腺癌细胞的作用及机制建立基础。方法设计合成4对针对人AQP1基因不同位点的shRNA片段,通过DNA重组技术将其插入载体GV115中,构建AQP1‐shRNA重组质粒,转染人乳腺癌MCF‐7细胞,并通过实时荧光定量 PCR（RT‐PCR）和Western blot法检测干扰效率。结果 RT‐PCR法证实AQP1在乳腺癌 MCF‐7细胞中有表达。测序验证表明4对靶向AQP1‐shRNA表达载体均构建成功。4组干扰载体能够从基因和蛋白表达水平不同程度抑制 AQP1表达,其中以AQP1‐shRNA 4对AQP1的干扰效率最强。结论成功有效地构建了针对人AQP1基因的shRNA重组质粒,能够有效抑制人乳腺癌细胞MCF‐7中A Q P1的表达。     

稳定靶向干扰候选抗药基因UGT1A9鼻咽癌细胞株建立

目的构建针对UGT1A9基因的shRNA慢病毒干扰表达载体;建立稳定UGT1A9干扰鼻咽癌细胞株,测定干扰效率。方法应用荧光定量PCR法检测UGT1A9 mRNA在鼻咽癌成瘤高转移细胞株5-8F和成瘤非转移细胞株6-10B之间的差异表达水平。构建重组UGT1A9 shRNA表达质粒pLentiU6/UGT1A9,经293FT细胞包装后,产生的慢病毒感染5-8F细胞,荧光定量PCR检测干扰效率。结果 UGT1A9在鼻咽癌细胞株中明显高表达。PCR、测序验证pLentiU6/UGT1A9-shRNA重组质粒构建成功;经293FT细胞病毒包装,感染5-8F细胞后,与阴性对照组和未干扰组相比,可明显抑制UGT1A9 mRNA水平。结论成功构建了稳定靶向干扰候选抗药基因UGT1A9的鼻咽癌细胞株,为研究UGT1A9可能参与介导鼻咽癌抗药的分子机理奠定了基础。     

SL7207/pEGFP-N1-AQP9及SL7207/pshRNA-AQP9重组沙门菌的构建及表达

目的将人水甘油通道蛋白9(AQP9)真核表达质粒pEGFP-N1-AQP9及干扰质粒pshRNA-AQP9通过电穿孔转化减毒沙门菌株SL7207,并验证其表达情况,为阐明AQP9在非酒精性脂肪肝病(NAFLD)中的作用奠定基础。方法从人肝脏组织中通过RT-PCR获得AQP9基因,克隆到载体pEGFP-N1上,构建真核表达质粒pEGFP-N1-AQP9,设计合成针对人AQP9的siRNA,退火形成双链shRNA,并插入pGenesil-1质粒中,构建干扰质粒pshRNA-AQP9,电穿孔转化减毒沙门菌株SL7207,通过PCR、Western blot验证其表达情况,并检测其稳定性。结果成功构建pEGFP-N1-AQP9及pshRNA-AQP9重组质粒,将其转化SL7207后,能在重组沙门菌中表达。结论成功构建SL7207/pEGFP-N1-AQP9及SL7207/pshRNA-AQP9重组沙门菌,为进一步研究AQP9对NAFLD的基因治疗奠定基础。     

慢病毒介导的siRNA靶向干扰EIF4G1鼻咽癌稳定细胞株的建立

目的 检测人真核翻译起始因子4G1(EIF4G1)基因在8株鼻咽癌细胞中的差异表达,寻找最高表达的细胞株.构建EIF4G1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,建立稳定干扰EIF4G1表达的鼻咽癌细胞株,测定干扰效率.方法 应用荧光定量PCR检测EIF4G1 mRNA在鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、C666-1、CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、SUNE1表达水平.构建重组靶向EIF4G1 shRNA慢病毒表达质粒pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA.用293FT细胞包装后产生的成熟慢病毒颗粒感染5-8F细胞.经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的5-8F鼻咽癌细胞株.最后荧光定量PCR检测干扰效率.结果 在8个鼻咽癌细胞株中,EIF4G1显示在5-8F细胞株中表达最高.PCR和测序验证pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA重组质粒构建成功;经293FT细胞病毒包装,感染5-8F细胞后,与阴性对照组和未十扰组相比可明显抑制EIF4G1 mRNA水平EIF4G1表达.结论 成功构建TpLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA慢病毒重组质粒,建立了稳定靶向干扰EIF4G1表达的siRNA5-8F鼻咽癌细胞株.     

再生基因4(Reg Ⅳ)的原核表达、蛋白结构复性及纯化

目的:构建再生基因4(Reg Ⅳ)的原核表达载体,获得重组人Reg Ⅳ蛋白。方法:将已构建好的pEGFP-C1-Reg Ⅳ质粒进行酶切纯化获得目的基因,并构建到pET-30a原核表达载体上,经测序鉴定后将序列正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定,并用凝胶层析对表达产物进行复性纯化。结果:构建了pET-30a-Reg Ⅳ原核表达重组质粒,IPTG诱导表达出约22KD的重组蛋白,表达产物经复性纯化后获得纯度较高的目的蛋白。结论:成功构建了Reg Ⅳ原核表达载体,并成功表达了重组人Reg Ⅳ蛋白。     

慢病毒载体介导CD1d和GFP融合基因转染PANC-1细胞的实验研究

目的构建人免疫基因CD1d与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)融合基因慢病毒载体并转染人胰腺癌细胞(PANC-1).方法实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得CD1d的全外显子片段,使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿梭质粒转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定.通过慢病毒转染预实验确定MOI,进行人CD1d重组慢病毒载体转染胰腺癌PANC-1细胞株.结果电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的CD1d基因序列完全一致.重组慢病毒质粒可高效转染PANC-1细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光.结论成功构建了CD1d与GFP融合基因慢病毒表达载体并转染人胰腺癌细胞.     

大鼠线粒体膜蛋白Nix基因过表达与shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建线粒体膜蛋白Nix基因过表达与shRNA慢病毒载体.方法 PCR扩增获得Nix基因序列,与经BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切的pHBLV-CMVIE-IRES-Puro载体连接获得Nix过表达重组慢病毒载体;以Nix为靶基因,合成寡核苷酸,退火形成双链DNA,与经BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切的pHBLV-U6-Scramble-Puro载体连接获得Nix shRNA重组慢病毒载体;将病毒包装辅助质粒与上述重组慢病毒载体共转染293T细胞,收集上清液并浓缩获得慢病毒浓缩液,3倍梯度稀释法测定病毒滴度;用病毒颗粒感染PC12细胞,经嘌呤酶素筛后得到稳定感染细胞株;荧光显微镜检测Nix荧光水平,Western blot检测Nix蛋白的表达.结果 成功构建Nix基因过表达和shRNA慢病毒载体,并在293T细胞中包装获得病毒.重组病毒感染PC12细胞后,荧光显微镜检测Nix基因过表达细胞荧光水平增加,shRNA感染细胞荧光水平降低;Western blot检测显示Nix基因过表达PC12细胞中Nix蛋白表达显著升高,shRNA慢病毒感染细胞中Nix蛋白表达明显降低,而Nix shRNA1干扰效果最好.结论 成功构建Nix基因过表达与shRNA慢病毒载体,并获得Nix过表达与干扰细胞模型.     

沉默CXCR4基因表达抑制胰腺癌增殖和侵袭的体外研究

目的 利用RNAi技术构建CXCR4 shRNA表达载体,观察CXCR4基因干扰后胰腺癌细胞增殖及侵袭能力的变化.方法 在不同分化程度胰腺癌细胞株中筛选出CXCR4高表达胰腺癌细胞株,RNAi技术构建CXCR4shRNA表达载体,转染胰腺癌CXCR4高表达细胞Miapaca-2并应用G418筛选出稳定表达株,Real-time PCR、Western blot实验观察RNAi对CXCR4基因的抑制效率;MTT实验检测CXCR4基因干扰后胰腺癌细胞增殖,应用Transwell侵袭小室观察CXCR4干扰对胰腺癌细胞侵袭转移力的影响.结果 胰腺癌细胞株Miapaca-2 CXCR4表达异常增高,特异性CXCR4基因沉默能够在基因和蛋白水平稳定、高效、特异地抑制CXCR4的表达,抑制效率达70％以上.特异性CXCR4 shRNA能够抑制细胞生长,细胞达到对数生长期的时间延长(P＜0.05).Transwell实验证明CXCR4基因干扰后细胞侵袭能力减低(P＜0.05),即使SDF-1的刺激也不能够使细胞侵袭能力增加.结论 成功构建了针对胰腺癌细胞CXCR4的siRNA载体;CXCR4基因沉默能抑制胰腺癌细胞增殖、侵袭和成瘤能力.     

Cycl慢病毒干扰载体的构建及在鼻咽癌细胞中干扰效率检测

目的 检测Cycl在鼻咽癌中的表达.构建稳定干扰Cycl慢病毒载体及检测其在鼻咽癌细胞中的干扰效率.方法 应用基因芯片技术检测Cycl基因在鼻咽癌组织中的表达.Real-time PCR确证Cycl基因在鼻咽癌组织和细胞中高表达.构建重组靶向Cycl的shRNA慢病毒质粒pLentiU6/Cycl-shRNA.建立稳定干扰Cycl基因的鼻咽癌细胞系,荧光定量PCR检测干扰效率.结果 基因芯片检测显示,Cycl基因在鼻咽癌组织中高表达.qRT-PCR确证了墓因芯片结果的可靠性.在8个鼻咽癌细胞株中,Cyc1基因基本上都显示了高表达,其中最高的为鼻咽癌5-8F细胞.测序验证pLentiU6/Cycl-shRNA重组质粒构建成功.重组质粒能明显稳定地抑制Cycl基因在鼻咽癌细胞中的表达.结论 Cycl 基因在鼻咽癌中高表达.构建的靶向Cycl基因的慢病毒载体能明显抑制其表达.这为研究Cycl基因在鼻咽癌中的功能及分子机制奠定了基础.     

慢病毒介导的shRNA靶向干扰nestin鼻咽癌稳定细胞株的建立

摘要：目的检测nestin基因在8种鼻咽癌细胞中的表达差异,寻找高表达的细胞株。构建nestin基因的shRNA表达载体,
建立nestin稳定干扰的鼻咽癌细胞株。方法应用Real-time PCR和免疫荧光技术检测nestin在鼻咽癌细胞株中的表达水
平。构建带GFP的重组靶向nestin shRNA慢病毒表达质粒,筛选阳性克隆,测序鉴定。293T细胞包装病毒,收集病毒上
清,测定滴度。经Real-time PCR内源筛靶,选择最佳靶点。将重组慢病毒感染5-8F细胞,Western blotting 和Real-time
PCR检测nestin的表达。结果在8种鼻咽癌细胞株中,5-8F细胞中nestin表达较高。PCR和测序验证重组质粒构建成
功。慢病毒感染5-8F细胞后,与阴性对照组和空白组相比,nestin的mRNA和蛋白水平明显受到抑制。结论成功构建了
干扰nestin的慢病毒重组质粒,并建立了稳定靶向干扰nestin表达的5-8F鼻咽癌细胞株。
     

pEGFP-N1-亚麻苦甙水解酶重组真核表达载体的构建及亚麻苦甙水解酶在SGC-7901细胞中的表达

目的:构建携带亚麻苦甙水解酶(lis)基因的重组真核表达载体,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,导入SGC-7901细胞中表达。方法:提取木薯总RNA,PCR扩增lis目的基因,将该基因全长定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒载体。用电穿孔法转染体外培养的SGC-7901细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察lis-EGFP融合蛋白在细胞中的表达。用PCR检测lis转录水平的表达,用Western blot法验证lis蛋白水平的表达。结果:酶切和测序证实pEGFP-N1-lis重组质粒构建正确,重组质粒载体在SGC-7901细胞中获得了表达,表达的融合蛋白具有lis和EGFP的双重活性。结论:通过基因克隆方法成功地构建了pEGFP-N1-lis重组质粒载体,并且在SGC-790细胞中稳定表达。     

靶向hVEGF165基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选

目的 构建编码hVEGF165 mRNA的shRNA质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法 以hVEGF165 mRNA编码区中第5和第7外显子序列作为RNA干扰靶点,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体并通过PCR进行鉴定.经鉴定后分别转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞,实时荧光定量PCR和Western blotting分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果.结果 构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出预期条带,构建成功.靶向hVEGF165基因的shRNA对所转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞中hVEGF165基因mRNA和蛋白质表达均有抑制作用,其中shRNA2最为明显.结论 成功构建了靶向hVEGF165基因的shRNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2质粒.     

TMEFF2基因对SH-SY5Y细胞增殖的影响

目的探讨TMEFF2基因过表达对体外培养SH-SY5Y细胞增殖的影响。方法克隆全长的TMEFF2基因,连接入pEGFP-N2载体。以脂质体包裹重组质粒转染SH-SY5Y细胞。在细胞中可表达生成TMEFF2-EGFP融合蛋白。经G418筛选,建立TMEFF2过表达细胞株,同时筛选作为对照的pEGFP-N2稳定转染细胞株。MTT法测定TMEFF2过表达细胞株和pEGFP-N2稳定转染细胞株以及SH-SY5Y细胞增殖。结果成功构建真核表达质粒pEGFP-TMEFF2,并筛选得到稳定表达细胞株。在细胞接种密度较高时,TMEFF2过表达细胞株的增殖较pEGFP-N2稳定转染细胞株以及SH-SY5Y细胞株均明显降低。结论TMEFF2基因可以抑制SH-SY5Y细胞的增殖,且抑制作用具有明显密度依赖性。     

RNA干扰Twist基因真核表达载体的构建与筛选

目的： 构建编码Twist mRNA 的短发卡样RNA （shRNA ）质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA 质粒表达载体。方法： 以Twist mRNA 编码区中第777位和第845位序列作为RNA干扰靶点,分别构建2个shRNA 质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,构建后通过PCR 酶切电泳和质粒测序进行鉴定。经鉴定后分别转染稳定表达Twist基因的膀胱癌T24细胞,RT-PCR 和Western blotting 分别从mRNA 和蛋白质水平检测抑制效果。结果： 构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出400 bp的目的条带,插入片段测序结果与合成的shRNA 结果一致。靶向Twist基因的shRNA 对膀胱癌T24细胞中Twist基因mRNA 抑制率为90%,蛋白质抑制率为86%,两种干扰质粒中shRNA1干扰效果最明显。结论： 成功构建了靶向Twist 基因的shRNA 质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA 质粒表达载体为pGenesil-shRNA1 质粒。     

Reg Ⅳ基因缺失CRD结构域片段获得及其表达载体的构建与转染

目的: 探讨应用基因重叠延伸拼接PCR (SOE-PCR)技术构建Reg Ⅳ基因缺失CRD 结构域表达载体,并转染Reg Ⅳ低表达结直肠癌细胞系.方法: 应用SOE-PCR法获得Reg Ⅳ缺失CRD 结构域片段,构建真核表达载体并转染Reg Ⅳ低表达结直肠癌LoVo细胞,G418筛选,RT-PCR检测鉴定.结果: 经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体构建成功,经pcDNA3.1-Reg Ⅳ-domain△转染的LoVo细胞Reg Ⅳ-domain △呈阳性表达.结论: 利用SOE-PCR技术可成功构建Reg Ⅳ基因缺失CRD 结构域的表达载体.     

EZH2 shRNA真核表达载体的构建及其在卵巢癌A2780细胞系的稳定表达

目的 采用基因工程技术,构建EZH2 shRNA的真核表达载体,获得稳定表达干扰质粒的卵巢癌A2780细胞系.方法 合成特异性干扰EZH2的shRNA片段并定向克隆插入Supersilencing shRNA质粒表达载体pGPU6/GFP/Neo,获得表达载体pGPU6/GFP/Neo-shEZH2.脂质体介导重组质粒转染A2780细胞,经G418加压筛选获得稳定转染细胞株,Real time RT-PCR和Western blot检测转染后细胞系EZH2的表达.结果 测序结果证实重组载体构建成功,稳定转染shEZH2的A2780细胞EZH2的mRNA和蛋白水平下降(90.20±1.66)%和(73.80±5.49)%,P＜0.01,差异有统计学意义. 结论成功构建EZH2 shRNA表达载体,获得EZH2基因稳定沉默的A2780细胞系,为进一步研究以EZH2为靶点的卵巢癌治疗奠定实验基础.