EV71病毒对树鼩原代肾上皮细胞感染模型的建立

目的 建立EV71对树鼩原代肾细胞的感染模型。方法 胰蛋白酶消化法获得树鼩的原代肾细胞，用EV71感染树鼩肾细胞，测定1、2、4、6和8 d培养上清病毒滴度，分别用Western blot和间接免疫荧光法检测细胞中EV71病毒VP1蛋白的表达，以确定EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性。结果 对分离得到的树鼩原代肾细胞进行传代纯化和形态鉴别，建立以树鼩原代肾细胞为主的细胞培养。用EV71病毒感染树鼩原代肾细胞，感染后48 ~ 96 h病毒滴度可达到1.3×10⁶ TCID₅₀/mL，说明EV71病毒可有效感染树鼩原代肾细胞并有效增殖。Western blot检测发现，EV71病毒VP1蛋白可在感染后2 ~ 8 d的树鼩原代肾细胞中有效检出，间接免疫荧光法则在感染后2 ~ 6 d细胞的细胞质中检测到病毒VP1蛋白的分布。结论 在成功建立树鼩原代肾细胞培养的基础上，确定了EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性和病毒增殖特性，初步建立了EV71树鼩原代肾细胞感染模型。     

EV71病毒反向遗传学系统的建立及拯救病毒的鉴定

目的：建立高效的EV71病毒反向遗传学系统,快速获得拯救病毒并鉴定其活性。方法：首先构建含有人RNA聚合酶Ⅰ启动子（Ppol Ⅰ）、ccdB自杀基因和鼠终止子（mTer）的接收质粒pHM-ccdB,并在ccdB两侧引入AarⅠ酶切位点;为了回避EV71病毒基因组中自身的AarⅠ酶切位点,分两段PCR扩增基因组,在引物中引入必需的AarⅠ酶切位点,通过Golden Gate Clone技术连接到目的载体中获得病毒拯救质粒pHT-EV71,转染至RD细胞后,获得拯救的EV71病毒,并以RT-PCR、病毒滴度、Western blot以及电镜检测等方法鉴定拯救子代病毒。结果：通过引入ccdB致死基因和Golden Gate Clone成功构建了EV71病毒的拯救质粒（pHT-EV71）,并将其转染至RD细胞后,观察到明显的致细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）,将得到的拯救子代病毒,经EV71 VP1的特异性引物进行RT-PCR扩增,观察到长约1 900 bp的特异性条带;Western blot结果显示,该病毒可与EV71 VP1特异抗体结合;透射电子显微镜（transmission electron microscopy,TEM）检测可见20～30 nm球形病毒颗粒;在RD细胞中将子代病毒连续增殖8代后,检测其毒力高于母本株（6.35 lgTCID50/mL）。结论：通过引入ccdB和Golden Gate Clone技术,建立了快速、高效构建EV71病毒的拯救质粒的方法,效率达到100%,为正链RNA病毒反向遗传学系统的构建提供了一种新的策略,为进一步研究EV71病毒的致病机制及疫苗制备等提供了技术平台。     

肠道病毒71型温度适应性进化对毒株毒力的影响研究

目的 研究EV71病毒温度适应性进化过程中的毒力变异,为相关手足口病的防控提供参考。方法 以EV71姊妹株（谱系#100、#101）亲代株、各温度适应株分别感染Vero细胞,进行噬斑实验验证、CCK-8细胞毒性实验、Vero细胞感染后宿主蛋白质组学研究,确认表型差异、比较不同毒株细胞抑制率,质谱检测并分析宿主细胞差异表达蛋白的功能。结果 确认Vero细胞感染热适应株（谱系#101）后发生噬斑变异;各温度适应株细胞抑制率较亲代株均有增长,但增幅不同。聚类分析与主成分分析显示,Vero细胞感染后宿主蛋白质组表达热适应株与亲代株、冷适应株与常温适应株分别具有相似性,组间差异表达蛋白500种（上调蛋白239种,下调蛋白261种）;其中上调蛋白功能与转录后蛋白修饰等功能有关,下调蛋白则与SRP依赖性共翻译蛋白的膜定位/易位、逆蛋白转运有关。结论 EV71病毒在温度适应性进化中可能伴随毒力变异,其作用机制有待进一步研究。     

NSPc1-siRNA重组慢病毒的构建及其对U87细胞NSPc1基因的沉默效应

【目的】构建包装NSPc1-si RNA慢病毒颗粒,并在U87胶质瘤细胞中鉴定其感染及基因沉默效果。【方法】根据Gen Bank中基因信息,采用干扰序列设计软件设计靶点,制备合成GV118-si RNA目的质粒,转化感受态细胞,对于长出的克隆应用菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和对比分析,重组病毒质粒与另外2种辅助包装载体质粒通过Lipofectamine TM2 000共转染293T细胞,培养48 h后,收集细胞培养上清液,将病毒浓缩后在293T细胞中测定病毒滴度;并检测病毒颗粒在目的细胞U87胶质瘤细胞中的感染效率,实时荧光定量PCR（RT-PCR）和Western blotting方法检测NSPc1 si RNA慢病毒对U87中NSPc1的干扰作用。【结果】成功构建NSPc1 si RNA慢病毒载体GV118-si RNA,重组病毒滴度为4×10^8TU/ml;用该病毒体外感染U87胶质瘤细胞,当感染复数（MOI）为10时,感染效率大于90%;RT-PCR和Western blotting方法检测NSPc1基因沉默的效率分别为66.4%、60.0%。【结论】成功构建了NSPc1 si RNA慢病毒载体GV118-si RNA,该重组病毒包装后在体外感染U87胶质瘤细胞的效率较高,且具有显著的基因沉默效果。     

人NOB1基因shRNA慢病毒载体构建与RNAi效率的鉴定

目的：构建人NOB1基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体并在卵巢癌SKOV3和HEY细胞上定其沉默效率。 方法：针对NOB1基因设计特异性siRNA靶点,构建于慢病毒pLVTHM载体,筛选获得的有效shRNA慢病毒载体在293T细胞包装成病毒颗粒,随后将其感染卵巢癌SKOV3和HEY细胞,采用Real-time PCR方法检测靶基因在mRNA水平的沉默效率。 结果：构建的慢病毒载体shRNA的PCR鉴定和测序正确,包装病毒后滴度达到8×10⁸ PU/L。shRNA慢病毒颗粒感染SKOV3和HEY细胞后NOB1基因的 mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组分别下降了73.5%和82.2%。 结论：成功构建NOB1基因的shRNA慢病毒表达载体,该慢病毒表达载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

卷柏多糖对肠道病毒71型复制的体外抑制作用

目的研究卷柏多糖对EV71病毒复制的体外抑制活性。方法将卷柏多糖不同提取物设置不同剂量作用于人恶性横纹肌肉瘤细胞(RD),采用细胞病变效应(CPE)及细胞计数试剂盒(CCK8法)检测细胞存活率,并计算药物的半数中毒浓度(CC50);培养EV71感染的RD细胞,建立体外病毒感染模型,并设立正常细胞对照组和阳性药物对照组(利巴韦林3.2mg/L),将卷柏多糖不同提取物设置不同剂量作用于EV71感染后的RD细胞,应用CCK8法检测药物抗病毒抑制率,并计算药物的半数抑制浓度(IC50);收集药物作用于感染后RD细胞的培养液上清,进行荧光定量PCR检测,观察药物对EV71病毒RNA表达的影响。结果卷柏30%醇沉多糖和50%醇沉多糖对RD细胞的CC50值分别为396和142 mg/L,抑制EV71病毒致CPE的IC50值分别为40.8和26.2 mg/L。与病毒感染对照组相比较,卷柏30%和50%醇沉多糖作用后,经EV71感染的RD细胞培养液中病毒RNA拷贝数显著降低(P<0.05)。结论卷柏及其30%和50%醇沉多糖可以作为新的抗EV71的潜在药物。     

贵州省及部分周边地区牛博尔纳病病毒感染的情况调查

目的探讨贵州省及周边地区牛群博尔纳病病毒(BDV)感染状况。方法采用荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)检测了120例牛的外周血单个核细胞中的BDV p24基因片段。结果牛外周血单个核细胞(PBMCs)中BDVp24基因片段阳性率均为4.17%。牛BDV p24基因片段的测序结果与GeneBank提供的标准病毒株比较,同源性96.51%～97.67%;有2个位点出现一致性沉寂突变(nt1675C-T,nt1678T-C突变率为2%);与马的Strain V病毒株比较,有3个位点出现一致性沉寂突变(nt1650T-C,nt1671C-T,nt1674C-T突变率为3%);与H1766病毒株比较,有2个位点出现一致性沉寂突变(nt1675C-T,nt1678T-C突变率为2%);与He80/FR病毒株比较,在3个位点出现一致性沉寂突变(nt 1660T-C,nt 1669A-G,nt 1672C-T突变率为3%);但它们所编码的氨基酸没有改变。结论贵州及湖南省部分地区牛群中存在BDV自然感染,可能是BDV流行区域之一;人感染BDV可能具有潜在的动物源性。     

EV71入侵人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞机制的初步研究

目的:初步研究肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV71)入侵人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的机制。方法:将临床EV71分离株接种于人横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RD)细胞,扩增和纯化病毒;MTT法检测不同病毒胞吞途径阻断剂对SKN-SH细胞生长抑制作用;用特异性的化学阻断剂预处理靶细胞后,Taq Man real-time PCR验证其对EV71 m RNA表达的影响。结果:RD细胞能够成功扩增出EV71病毒,病毒滴度为1×105 TCID50。随着药物浓度梯度的增加,SK-N-SH细胞的生长增殖受到抑制。Taq Man荧光定量RT-PCR结果显示氯丙嗪(chlorpromazine,CPZ)能够抑制EV71 m RNA的表达(Ρ<0.05),制霉菌素(nystatin,NT)对其影响不大(Ρ>0.05)。结论:初步推测EV71入侵SK-N-SH细胞是通过网格蛋白依赖性的内吞作用入胞。     

针对糖尿病易感基因Vβ13的慢病毒系统的建立及其对T细胞的转导

目的 应用慢病毒介导的RNA干扰技术,有效沉默连接红色荧光蛋白mCherry与靶基因1型糖尿病易感基因Vβ13的表达,建立一种简便有效基因沉默的系统,并初步研究慢病毒感染T细胞的可能性.方法 以Vβ13 mRNA编码序列作为干扰靶点,以慢病毒质粒UTG作为载体,构建靶向Vβ13的shRNA表达质粒,构建携带Vβ13的mCherry红色荧光蛋白的质粒作为验证shRNA有效性的靶点,并转染293FT细胞.通过红色荧光的表达及RT-PCR和Western blot确定最佳沉默Vβ13序列后,将有效的UTG-Vβ13质粒与辅助质粒共转染293FT细胞,低温超高速离心,获取高滴度慢病毒.应用慢病毒感染大鼠T细胞,光镜观察T细胞被慢病毒感染的情况,流式细胞术检测T细胞的绿色荧光表达情况.结果 成功构建Vβ13-shRNA慢病毒载体UTG-shRNA-Vβ13,RT-PCR及Western blot结果显示慢病毒感染的293FT细胞Vβ13 mRNA及蛋白表达相对于对照组显著降低.构建的慢病毒可以成功感染T细胞.结论 红色靶基因-绿色慢病毒系统具有简便的筛选性能;UTG慢病毒对神经干细胞具有较高感染效率.可作为一种良好的基因导入载体,实现慢病毒介导的RNA干扰在T细胞内的有效表达,并为T细胞过继性转移的相关研究提供技术支持.     

RNA特异性腺苷脱氨酶的生物学作用及其与人类疾病的关系

RNA编辑(尤其是A-to-I RNA编辑)是哺乳动物常见的转录后修饰方式。RNA特异性腺苷脱氨酶(adenosine deaminase acting on RNA，ADAR)是A-to-I编辑的关键蛋白，它通过脱氨基作用使双链RNA中的腺苷基团转化为肌酐基 团，从而导致核苷酸序列改变。目前已发现的ADARs共有3类(ADAR1，ADAR2，ADAR3)，它们的异常与众多人类疾 病密切相关，如病毒感染、代谢性疾病、神经系统疾病、肿瘤等。     

肠道病毒71型对人神经胶质瘤U251细胞线粒体动力学的影响

  目的  探讨肠道病毒71型（EV71）对人神经胶质瘤U251细胞线粒体动力学的影响。  方法  采用非洲绿猴肾细胞Vero对EV71进行增殖,用Reed-Muench公式计算病毒液的50%细胞感染剂量（50% tissue culture infective dose,TCID₅₀);将EV71接种于U251细胞,光学显微镜下观察细胞形态,激光共聚焦显微镜下观察线粒体形态,透射电镜观察线粒体超微结构的改变;Western blot检测线粒体分裂蛋白Drp1、p-Drp1(S637)和融合蛋白Opa1的表达水平;ATP试剂盒检测线粒体ATP水平;MitoSOX染色检测线粒体超氧化物水平。  结果  EV71的TCID₅₀为10－5.4/ 0.1 mL; EV71感染U251细胞24 h、48 h后细胞明显出现皱缩、变圆或死亡。激光共聚焦显微镜和透射电镜结果显示,EV71感染后细胞线粒体明显延长,线粒体嵴模糊不清;Western bolt结果显示,EV71感染U251细胞24 h和48 h后,Drp1、Opa1表达降低,而p-Drp1（S637）在48 h表达升高,且差异有统计学意义（P<0.05）。EV71感染48 h后,与未感染EV71的U251细胞相比,线粒体ATP生成减少,线粒体超氧化物水平升高（P<0.05）。  结论  EV71感染U251细胞后,能引起线粒体形态及动力学改变,进而导致线粒体功能的变化,这可能是其引起神经系统功能紊乱的机制之一。     

乙肝病毒(HBV)感染对肝细胞癌(HCC)患者A-to-I RNA编辑的影响

 目的 探究乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）感染对肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者肝脏正常组织和癌组织中腺嘌呤转变为次黄嘌呤（adenine to inosine,A-to-I）RNA编辑活性的影响。方法 从基因表达数据库（gene expression omnibus,GEO）收集28套成对正常组织和癌组织的转录组数据,分为HBV阴性正常组织（HBV-N）组、HBV阴性癌组织（HBV-T）组、HBV阳性正常组织（HBV+N）组和HBV阳性癌组织（HBV+T）组。用SPRINT软件进行位点鉴定后,从催化酶表达水平、位点编辑水平和位点所在基因的基因本体论（gene ontology,GO）富集通路层面进行分析。结果 在正常组织和癌组织中均发现HBV感染时腺苷酸脱氨酶1（adenosine deaminases acting on RNA 1,ADAR1）表达水平更高。癌组织中HBV阳性样本的A-to-I RNA编辑水平上升,正常组织中则无此现象。两类组织中HBV阳性样本编辑基因显著富集在细胞增殖、基因调控相关信号通路。结论 HBV感染上调ADAR1的表达,从而改变宿主编辑事件活性,这对HCC的发生发展可能有促进作用。     

肠道病毒71型能诱导THP-1巨噬细胞的自噬和凋亡

目的 探讨肠道病毒71型（EV71）诱导THP-1巨噬细胞自噬和凋亡及其相关信号通路。方法 设置EV71处理组和DMEM对照组,EV71处理组是用感染复数0.1感染THP-1巨噬细胞2、8和16 h,对照组是用DMEM培养基作为阴性对照即是0 h组。CCK-8检测EV71对THP-1巨噬细胞增殖和毒性的影响;荧光定量PCR法检测EV71在细胞内病毒核酸变化情况;透射电镜观察THP-1巨噬细胞内超微结构变化;Hoechst 33342染色法和AnnexinV/PI 双染法检测EV71诱导THP-1巨噬细胞凋亡的情况; 免疫印迹法分析EV71诱导THP-1巨噬细胞自噬和凋亡相关蛋白水平的变化;用3-MA和Ac-DEVD-CHO抑制剂分别检测EV71对THP-1巨噬细胞自噬和凋亡的影响。结果 EV71作用THP-1巨噬细胞2、8和16h的细胞存活率逐渐下降（P<0.05）;细胞内病毒核酸拷贝数逐渐增多（P<0.01）;可见细胞内自噬小体和病毒颗粒;总细胞凋亡率逐渐增加（P<0.01）;与对照组比较,EV71处理组LC3转化量（LC3-II/LC3-I）逐渐增多,而p62蛋白逐渐减少,cleaved caspase 3蛋白增多,Bcl-2和caspase-3蛋白减少（P<0.01）,而cleaved caspase-8无差异（P>0.05）;与PBS对比,在8 h时3-MA明显抑制EV71诱导THP-1巨噬细胞自噬,LC3-II/LC3-I比值减少,而p62蛋白增多（P<0.01）;与DMSO对比,Ac-DEVD-CHO明显抑制EV71诱导THP-1巨噬细胞凋亡,凋亡率分别为15.5%和7.7%（P<0.01）。结论 EV71能感染THP-1巨噬细胞并在其中复制,且能诱导自噬和凋亡,其可能与激活LC3/p62自噬途径和caspase凋亡途径有关。     

亳州地区384例手足口病患儿肠道病毒实时RT-PCR检测结果分析

目的 针对2009-2011期间亳州市各区县上报市CDC的手足口病临床诊断病例,进行病毒学检测和鉴定,以了解亳州地区手足口病的流行规律,为手足口病的预防控制及诊断治疗提供科学依据.方法 临床诊断为手足口病患儿的咽拭子标本384份,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法进行肠道病毒EV71、CoxA 16、非EV71、非CoxA16的其它肠道病毒的检测.结果 经检测,EV71感染159例,CoxA16感染94例,非EV71、非CoxA16感染29例,EV71合并CoxA16感染79例,EV71合并其它22例,CoxA16合并其它2例,EV71、CoxA 16合并其它感染1例.感染的主要病毒种类为EV71病毒,其次为CoxA16病毒,亳州市各县区发病无明显的地域差别;此病的高发季节在春夏季;年龄以1～3岁为主;男性多于女性,但差异无统计学意义.结论 引起亳州地区2009-2011年间手足口病的主要病原体为EV71病毒和CoxA16病毒.     

2010年聊城地区手足口病病原学检测结果分析

目的 了解聊城地区2010年手足口病病原情况.方法 2010年6月采集聊城地区240例手足口病病人(包括27例重症病人)咽拭子并提取病毒RNA.采用Real-time RT-PCR方法,以肠道病毒5'UTR区通用引物及探针对240份临床标本进行初步筛查,初筛阳性标本进一步采用CA16及EV71 VP1区特异性引物及探针...     

缺硒饲养ICR小鼠加快肠道病毒71型在体内的复制研究

目的观察硒蛋白对手足口病病原体肠道病毒71型（EV71）在感染动物体内复制的影响情况。方法将30只雌性ICR小鼠分为常规饲料组、缺硒饲料组和加硒饲料组,各种饲料饲养小鼠6周后,通过电感耦合等离子体质谱仪（ICP—MS）测定小鼠外周血中硒的含量以及荧光定量PCR方法测定动物体内肠道病毒EV71的载量．然后用病毒空斑实验测定病毒滴度并用酶促法来测定主要硒蛋白酶的活性。结果通过测定外周血中硒的含量发现,缺硒饲料组的ICR小鼠硒含量为0．081μg／g,显著低于常规饲料组0．135μg／g和加硒饲料组的0．128μg／g,差异有统计学意义（P〈0．01）;用荧光定量PCR方法测定EV71载量,加硒饲料组ICR小鼠体内EV71核酸扩增Ct值,明显高于缺硒饲料组（P〈0．05）;ICR小鼠体内主要硒蛋白酶（GPX1）的活力在缺硒饲料组的动物体内显著低于加硒饲料组：病毒空斑实验结果表明,缺硒饲料组的ICR小鼠体内EV71病毒复制活力显著高于其他两组。结论缺硒可能导致硒蛋白GPX1合成减少或其活力降低从而加快EV71在宿主内的复制。