组织蛋白酶L反义基因转染对高转移人骨肉瘤细胞生物学行为的影响

目的构建人组织蛋白酶L（CATL）基因的正、反义真核表达载体。观察反义CATL核酸转染后对高转移人骨肉瘤细胞体内、外侵袭特性的抑制效应。方法采用RT-PCR的方法,从人骨肉瘤组织中扩增出1001bp的CATL全长cDNA片段,以BamHⅠ及XbaⅠ双酶切,定向克隆到真核表达载体pcDNA 3.0中。对重组质粒进行限制性内切酶酶切分析及DNA序列测定。应用脂质体介导的基因转染技术将重组质粒导入高转移人骨肉瘤细胞中,观察转染后细胞的生长、体外侵袭能力及裸鼠体内成瘤及自发转移能力等指标的变化。结果正、反义真核表达载体成功构建并转染入高转移人骨肉瘤细胞中。基因转染对细胞的体外生长无明显影响。反义载体转染后细胞的体外侵袭能力和裸鼠体内成瘤性及自发转移能力均受到一定程度抑制。结论反义CATL基因可显著抑制骨肉瘤细胞的体内、外侵袭力。     

反义RNA抑制Ezrin表达对乳腺癌细胞侵袭能力的影响

目的 观察特异性阻断Ezrin的表达对人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7的增殖和侵袭能力的影响.方法 将anti-pCR3.1-Ezrin质粒经脂质体介导,转染人人乳腺癌细胞MDA-MB-231 6、12和24 h,应用Western blot和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Ezrin的表达变化情况;转染质粒24h后,噻唑蓝(MTT)比色法检测抑制Ezrin对MDA-MB-231和MCF-7细胞体外增殖能力的影响,Boyden小室法检测抑制Ezrin对MDA-MB-231和MCF-7细胞体外侵袭能力的影响.结果 转染anti-pCR3.1-Ezrin后,对MDA-MB-231细胞中的Ezrin表达抑制在24 h时达高峰.MTT法比色实验结果显示,MDA-MB-231和MCF-7细胞中转染anti-pCR3.1-Ezrin组、转染空质粒组和对照组的A值分别为0.410±0.018、0.765±0.058、0.795±0.061和0.480±0.021、0.632±0.052、0.648±0.059.转染anti-pCR3.1-Ezrin组细胞的增殖受到明显抑制,抑制率分别为(47.9±3.1)%和(32.0±2.8)%(P<0.05).Boyden小室法检测结果显示,MDA-MB-231和MCF-7细胞中转染anti-pCR3.1-Ezrin组细胞的侵袭能力分别为对照组的(50.5±3.2)%和(74.8±4.6)%(P<0.05).结论 Ezrin在乳腺癌的生长和侵袭过程中发挥重要作用.     

转染环氧合酶-2反义寡核苷酸对骨肉瘤细胞侵袭性的抑制作用

目的 探讨环氧合酶-2(COX-2)反义寡核苷酸(ODNs)对人骨肉瘤细胞株OS-732侵袭性的抑制作用及其机制.方法 设计和合成COX-2反义寡核苷酸,体外转染骨肉瘤OS-732细胞,逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot证实转染效果.改良Boyden-transwell方法观察肿瘤细胞侵袋抑制率,RT-PCR方法研究转染COX-2反义ODNs对OS-732细胞尿激酶型纤溶酶原激活物及其受体(uPA、uPAR)mRNA表达的影响.结果 转染COX-2反义ODNs的细胞COX-2核酸、蛋白表达水平显著降低.转染组细胞侵袭能力显著降低,呈浓度依赖性.转染组细胞uPA、uPAR的mRNA表达水平显著降低(P<0.01).结论 COX-2反义ODNs对OS-732细胞侵袭能力有明显抑制作用,其对uPA、uPAR表达的下调是主要作用机制.     

miR-143调控基质金属蛋白酶-13表达对骨肉瘤细胞迁移及侵袭的影响

目的:探究miR-143对基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase,MMP-13)表达的调节作用及其对骨肉瘤细胞迁移及侵袭能力的影响。方法:采用96孔板培养小鼠骨肉瘤细胞系143B细胞,设立空白组、阴性组、阳性组、干预组。空白组不做特殊处理,阳性组加入50 μg miR-143 mimic,阴性组加入等量mimic NC(miR-143 mimic的对照序列),干预组加入50 μg miR-143 mimic及10 μg MMP-13蛋白,继续培养3~6 h,最后吸出血清处理0.5 h。分别采用荧光定量PCR和Western-blot测定各组miR-143和MMP-13蛋白表达,采用Transwell、划痕实验测定细胞的侵袭与迁移能力。结果:阳性组及干预组MMP-13蛋白表达量明显低于空白组,阳性组低于干预组(P<0.05);空白组、阴性组、阳性组及干预组每个视野的侵袭细胞数均值分别为(1 000.01±44.77)、(959.25±46.32)、(245.04±4.33)、(634.06±33.78)个;阳性组及干预组划痕愈合率均明显低于空白组,阳性组低于干预组(P<0.05)。结论:MMP-13是miR-143作用的一个靶点,可以通过抑制MMP-13表达降低骨肉瘤细胞的迁移及侵袭能力。     

Survivin反义寡核苷酸对人骨肉瘤细胞的抑制作用

我们以骨肉瘤OS 73 2细胞为对象 ,在明确其高表达Survivin基础上 ,尝试通过合成靶向Survivin的反义寡核苷酸(ASODN)转染OS 73 2细胞 ,以封闭Sur vivin表达 ,探讨ASODN对骨肉瘤细胞凋亡 /增殖的影响及其对化疗药物的促进作用。一、材料与方法1.材料 :人骨肉瘤细胞株OS 73 2购自北京积水潭医院骨科研究所。针对Survivin基因翻译起始密码区 ,设计合成ASODN (上海生工公司 ) ,序列为 5′CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG 3′ ,并设正义 (senseoligonucleotide ,SODN )对照 ,序列为 5′GTTCCTCGACCTTCCGACCC3′ ,两组寡核苷酸均…     

白藜芦醇抑制骨肉瘤细胞侵袭实验研究

目的探讨白藜芦醇对骨肉瘤细胞侵袭的作用及其潜在的作用机制。方法用不同浓度的白藜芦醇处理4种骨肉瘤细胞系,24、48、72h后采用CCK-8法评估细胞增殖情况,并进行流式细胞术实验分析细胞凋亡情况。采用Transwell测定法检测细胞侵袭能力。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)分析肿瘤细胞侵袭相关基因的表达。结果白藜芦醇以剂量依赖性的方式抑制骨肉瘤细胞增殖,同时促进骨肉瘤细胞凋亡,并显著抑制骨肉瘤细胞侵袭,其中相关基因基质金属蛋白酶(MMP)1、MMP2、MMP9表达明显下降。结论白藜芦醇可有效抑制骨肉瘤细胞侵袭,其潜在机制可能是下调MMP1、MMP2、MMP9等肿瘤侵袭相关基因的表达。     

miR-542-3p对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响以及靶基因预测

【】目的 明确miR-542-3p抑制骨肉瘤细胞系HOS以及SAOS2细胞侵袭能力,建立生物信息学miR-542-3p靶基因调控网络,并探讨其潜在作用靶点。方法 使用miR-542-3p mimics 转染HOS以及SAOS2细胞,进行Transwell小室细胞侵袭能力测定。利用基因表达共享数据库GEO联合GEO2R平台,获取并分析miRNA-542-3p与miR-neg转染的U2OS细胞的基因表达谱数据及差异表达基因,进而使用miRNA预测数据库及Cytoscape软件,预测并建立miR-542-3p靶基因调控网络。qPCR验证mir-542-3p转染HOS以及SAOS2细胞后,部分预测目标靶基因的mRNA表达水平变化。结果 mir-542-3p 转染组骨肉瘤细胞的侵袭能力较对照组明显降低(P<0.05)。数据库差异基因分析表明,miRNA-542-3p与miR-neg转染的U2OS细胞的表达差异基因共417个,其中185个基因表达下调。实时定量PCR结果显示,Targetsacn以及MiRanda数据库预测靶基因中,miR-542-3p转染细胞组的ILK, TBPL1和ETS1表达水平显著低于对照组(P<0.05)。结论 miR-542-3p通过下调ILK, TBPL1以及ETS1显著抑制骨肉瘤细胞的侵袭能力。     

miR-542-3p对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响及其靶基因预测

目的 明确miR-542-3p对骨肉瘤细胞系HOS和SAOS2细胞侵袭能力的影响,通过生物信息学建立miR-542-3p靶基因调控网络,并探讨其潜在作用靶点。方法 使用miR-542-3p mimics转染HOS和SAOS2细胞,同时设立正常组（未转染）及阴性对照组（转染miR-neg mimics）,Transwell小室试验检测转染后细胞的侵袭能力。通过美国国立生物信息中心（NCBI）基因表达共享数据库（GEO）联合GEO2R平台,获取并分析miRNA-542-3p与miR-neg转染的U2OS细胞的基因表达谱数据及其差异表达基因,进而使用miRNA预测数据库及Cytoscape软件,预测并建立miR-542-3p靶基因调控网络。实时荧光定量PCR验证miR-542-3p转染HOS和SAOS2细胞后,部分预测目标靶基因的mRNA表达水平变化。结果 miR-542-3p干预组HOS和SAOS2细胞的侵袭能力较正常组和阴性对照组明显降低（P均＜0.05）。数据库差异基因分析表明,miR-542-3p与miR-neg转染的U2OS细胞的表达差异基因共有417个,其中185个基因表达下调。miRNA预测数据库预测的266个靶基因中,有14个与差异基因分析中得到的表达下调基因重合。实时荧光定量PCR分析得出,ILK、TBPL1、ETS1这3个预测靶基因在miR-542-3p干预组中的表达水平显著低于阴性对照组,差异均有统计学意义（P均＜0.05）。结论 miR-542-3p通过下调ILK、TBPL1、ETS1显著抑制骨肉瘤细胞的侵袭能力。     

基质金属蛋白酶及其组织抑制物表达与壶腹癌侵袭转移的关系

我们应用免疫组织化学方法观察壶腹癌中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)MMP-2、MMP-9及其组织抑制物(tissue inhibiton of metalloproteinase，TIM)TIMP-1和TIMP-2的表达，报告如下。     

组织因子对人胃癌细胞体外侵袭转移特性的影响

目的 构建稳定转染人组织因子(TF)的人胃癌细胞株SGC7901,研究TF对胃癌细胞体外侵袭转移特性的影响.方法 采用巢式PCR技术自人胎盘组织克隆目的基因TF,应用脂质体介导的转染技术将其导入人胃癌细胞株SGC7901,采用G418筛选稳定表达TF的细胞,采用RT-PCR及Western blot法检测TF mRNA及蛋白的表达,并进行Transwell实验及划痕实验观察细胞体外侵袭转移能力的变化.结果 经基因测序证实成功构建了稳定、高效表达TF的人胃癌细胞系SGC7901/TF.转染组TF mRNA及TF蛋白表达增高;与阴性对照组及空白对照组相比,转染组细胞的体外侵袭转移能力增强.结论 TF能够增强人胃癌细胞的体外侵袭转移能力.     

反义调控DNA甲基转移酶1基因对人胆管癌细胞生长的抑制效应

目的观察转染反义DNMT1基因真核表达载体对人胆管癌细胞QBC-939生长的影响,初步探讨DNMT1基因在胆管癌发生中的表遗传学机制。方法将构建好的反义DNMT1基因真核表达载体用脂质体介导法转入人胆管癌细胞QBC-939,Western blot检测转染前后DNMT1蛋白的表达变化,MTT法和软琼脂克隆形成试验观察各组细胞的生长增殖能力,流式细胞术观察细胞生长周期及凋亡率的变化。结果（1）Western blot检测证实转染反义基因能使DNMT1蛋白表达水平降低;（2）转染反义DNMT1基因能抑制QBC-939的生长曲线,并使其软琼脂克隆形成率从（38．020±4．120）％减少至（14．860±2．129）％,差异有显著性意义（P=0．000）;（3）转染反义DNMT1基因能影响QBC-939的细胞周期,使之阻滞于G1期,细胞凋亡率从（1．63±0．27）％增加到（6．19±0．78）％,差异亦有显著性意义（P=0．000）。结论通过转染反义DNMT1基因真核表达载体,可下调DNMT1在QBC-939细胞中的表达水平,并能抑制胆管癌细胞的生长和增殖,促进凋亡的发生,提示DNMT1可能通过甲基化途径与胆管癌的发生有关。     

Inhibition of MMP-1 expression by antisense RNA decreases invasiveness of human chondrosarcoma.

We previously reported that an elevated level of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) gene expression in patients with chondrosarcoma has a strong statistical correlation with recurrence and in vitro invasion. In the present study, we used an antisense RNA strategy for MMP-1 inhibition to determine if this would affect the invasive characteristics of the cells. We transfected a human chondrosarcoma cell line with a retroviral plasmid expressing a 770 bp genomic fragment of the human MMP-1 gene in the sense or antisense orientation. The results show that cells transfected with the MMP-1 antisense fragment had a significant decrease in both MMP-1 protein and enzyme activity (p<0.05) as compared to cells transfected with an empty plasmid or the parental cells. Cells transfected with the MMP-1 antisense fragment demonstrated a significant decrease in their ability to invade the collagen I barrier (p<0.05). The gene expression for MMP-8 and MMP-13 were unaffected in cells transfected with the MMP-1 antisense fragment, MMP-1 sense fragment, or empty plasmid. These results support the hypothesis that MMP-1 facilitates tumor cell egress from chondrosarcoma tissue and demonstrate the potential of MMP-1 as a promising target for a novel biologic therapy in chondrosarcoma.     

RNA干扰沉默Cathepsin L基因表达对肝癌细胞生物学特性影响的实验研究

目的 探讨RNA干扰技术沉默Cathepsin L基因对肝癌细胞生物学特性的影响.方法 实验组为肝癌细胞CathepsinL siRNA转染基因沉默组(沉默组),实验对照为肝癌细胞空白对照组(空白组)和siRNA转染荧光蛋白对照组(荧光对照组).观察时间为Cathepsin L siRNA转染后1、3和6 d.观察各组肝癌细胞Cathepsin L siRNA转染效率.用免疫荧光、RT-PCR法及WB法检测肝癌细胞Cathepsin L表达,MTT法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡变化,侵袭小室法测定肝癌细胞侵袭力变化.结果 沉默组与空白组、荧光对照组比较,Cathepsin L mRNA水平和蛋白水平显著下降,细胞生长受抑制,增殖指数显著下降,细胞凋亡率显著增加,肝癌细胞侵袭力显著下降.结论 RNAi可有效沉默肝癌细胞Cathepsin L表达,降低肝癌细胞增殖活力及细胞侵袭力.     

ets-1反义寡核苷酸对胃癌细胞株SGC-7901侵袭力的影响

目的　研究ets 1反义寡核苷酸对胃癌细胞株SGC 790 1侵袭力的影响。方法　应用ets 1反义、正义寡核苷酸转染SGC 790 1细胞 ,并设磷酸盐缓冲液 (PBS)对照组。转染后应用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测ets 1mRNA的变化 ,应用Transwell小室检测体外侵袭力的变化 ,并应用裸鼠胃癌皮下转移模型检测对体内侵袭力的影响。结果　转染ets 1反义寡核苷酸后 ,ets 1mRNA表达降低 (0 .42 3± 0 .0 86vs 0 .815± 0 .176、0 .80 7± 0 .169,P <0 .0 1) ,侵过小室滤膜细胞数目减少 (97.1± 11.1vs 198.7± 18.3、2 0 5 .8± 2 2 .2 ,P <0 .0 1) ,裸鼠胃癌生长明显受到抑制 (1.2 8±0 .13vs 1.18± 0 .11、0 .60± 0 .11,P <0 .0 1)。结论　ets 1反义寡核苷酸能够抑制胃癌细胞株SGC 790 1的侵袭力     

端粒酶反义RNA影响人肝癌细胞系HepG2生长的初步报告

目的探讨抗端粒酶在肝细胞癌治疗中的意义。方法将反义hTR真核表达载体经脂质体介导转染人肝癌细胞系HepG2,体外培养及接种裸鼠观察其基因转染细胞的细胞周期、超微结构变化及致瘤性。结果形态学观察,转染后HepG2细胞出现典型的凋亡现象。FCM检测发现G1期前出现凋亡峰,凋亡率为4·2%。在裸鼠皮下的致瘤性明显降低。HepG2/pBBS212细胞的瘤体抑制率为2·4%,与HepG2/pBBS212-hTR细胞的25·6%相比,差异有显著性(P<0·05)。结论转染端粒酶反义RNA能抑制肝癌HepG2细胞的恶性表型,促进其凋亡。     

整合素连接激酶反义寡核苷酸对胃癌细胞的作用

目的探讨全硫代修饰整合素连接激酶(integrin-linkedkinase,ILK)反义寡核苷酸(antisenseoligonucletide,ASODN)导入胃癌细胞株SGC-7901后对胃癌细胞的作用。方法(1)应用脂质体将ILK的ASODN导入胃癌细胞系SGC-7901,以RT-PCR及Western印迹方法检测作用后胃癌细胞ILK的mRNA和蛋白水平的变化;(2)应用MTS法及流式细胞术评价ILK的ASODN导入细胞后对其体外增殖和凋亡的影响。结果(1)转染后胃癌细胞ILK的蛋白表达水平明显下降,但mRNA水平无明显变化;(2)胃癌细胞生长受到明显抑制,抑制效应具有浓度依赖性,并可明显诱导细胞产生凋亡。结论ILK反义寡核苷酸导入胃癌细胞株SGC-7901后可以降低细胞内ILK的蛋白表达水平,并可体外抑制胃癌细胞增殖,诱导胃癌细胞凋亡。     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人乳腺癌细胞株侵袭力的抑制作用

目的　探讨乙酰肝素酶 (HPSE)反义寡脱氧核苷酸 (AS ODN )对人乳腺癌细胞株侵袭力的抑制活性。方法　设计合成分别互补于HPSEmRNA 5 '未翻译区和起始密码区的AS ODN1、AS ODN2及相应对照NS ODN1、NS ODN 2 ,在脂质体介导下以 2 5 0nmol/L终浓度转染人乳腺癌MDA43 5细胞 ,以RT PCR和Westernblot分别检测HPSEmRNA和蛋白表达 ,以基质凝胶侵袭实验检测细胞侵袭力。结果　AS ODN 2组的HPSEmRNA相对表达量、蛋白表达量和侵袭细胞数(0 .62± 0 .0 4、12 .70± 1.70、61.0 0± 9.0 0 )与脂质体对照组 (1.60± 0 .0 4、3 6.2 0± 2 .10、178.0 0±17.0 0 )和NS ODN2组 (1.48± 0 .0 3、3 5 .5 0± 2 .3 0、174.0 0± 2 0 .0 0 )相比较均显著降低 (P <0 .0 1) ;而AS ODN 1组与脂质体对照组和NS ODN1组相比较差异均无显著性 (P >0 .0 5 )。结论　互补于起始密码区的HPSEAS ODN可通过下调HPSE表达显著抑制人乳腺癌细胞株MDA43 5的侵袭力。     

反义SKP2对胆管癌细胞系QBC中p27kip1表达的影响

目的 通过S期激酶相关蛋白（SKP2）反义寡核苷酸（ASODN）阻断泛素，蛋白酶体降解途径，观察对胆管癌细胞QBC中SKP2和p27^kip1表达的影响，探讨泛素-蛋白酶体途径在胆管癌发生发展中的作用。方法 SKP2反义寡核苷酸和胆管癌细胞QBC共培养，脂质体转染，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR），Western blot法检测SKP2和p27^kip1 mRNA和蛋白在QBC中的表达。结果 SKP2 ASODN作用于QBC后，SKP2在mRNA和蛋白的表达较对照组和NSODN组均显著降低（P〈0．05），p27^kip1 mRNA表达差异无统计学意义（P〉0．05），蛋白表达则较对照组和NSODN组明显增高（P〈0．05）。结论 SKV2介导的泛素-蛋白酶体途径在调节胆管癌细胞QBC中p27^kip1的降解中发挥重要作用，SKP2反义寡核苷酸在显著抑制QBC中SKP2 mRNA和蛋白的表达的同时，促进p27^kip1蛋白表达，但对p27^kip1 mRNA无明显影响，提示SKP2对p27^kip1的调节主要在转录后水平。SKV2作为胆管癌基因治疗中有效的潜在靶基因，在胆管癌的基因治疗方面具有重要意义。