1700001O22RIK基因在小鼠睾丸的特异表达及生物信息学分析

目的:研究1700001O22RIK(RIKEN c DNA 1700001O22)基因在小鼠睾丸的表达特征,结合生物信息学分析初步探讨其功能。方法:通过分析小鼠基因表达谱芯片,发现1700001O22RIK基因特异性表达于睾丸组织。采用RT-PCR、实时PCR、Western印迹及免疫组化等方法分析该基因在成年C57BL/6J小鼠各组织中的表达特征,以及不同发育阶段小鼠的睾丸组织中的表达变化。利用生物信息学软件对该基因进行相关生物信息学分析。结果:1700001O22RIK基因在小鼠睾丸组织中呈现特异性表达,表达水平具有年龄依赖性,在成年期表达最强;1700001O22RIK蛋白在成年小鼠睾丸组织中主要定位于精原细胞、精母细胞及圆形精子细胞。经生物信息学分析,1700001O22RIK基因编码蛋白氨基酸序列在人和小鼠具有高度同源性,提示该基因在哺乳动物进化过程中十分保守。结论:1700001O22RIK属于睾丸特异性基因,主要表达于生精小管的精原细胞、精母细胞及圆形精子细胞,提示其可能参与精子发生的调节。     

Ccdc70基因在小鼠睾丸精子发生过程中的表达特征

目的:探讨Ccdc70(Coiled-coil domain containing 70)基因在小鼠睾丸中的表达特征并分析其在生精过程中的潜在功能。方法:经表达谱芯片筛选出小鼠睾丸特异性基因Ccdc70,通过RT-PCR、real-time PCR、Western印迹及免疫组化检测Ccdc70基因在成年小鼠睾丸中表达特征,并对该蛋白做相关的生物信息学分析。结果:RT-PCR、real-time PCR和Western印迹结果表明Ccdc70基因在小鼠睾丸中高表达,在附睾中低表达;免疫组化结果表明Ccdc70蛋白在睾丸中主要表达于小鼠精母细胞和圆形精子胞质,在附睾中主要表达在附睾管上皮细胞。生物信息学分析显示该蛋白存在一个CCDC结构域,并在哺乳动物进化过程中高度保守。结论:Ccdc70为小鼠睾丸高表达基因,且主要表达于精母细胞、圆形精子及附睾管上皮细胞,提示其可能参与调控小鼠精子发生过程及附睾精子的进一步成熟。     

Daxx基因在小鼠睾丸精子发生过程中的表达特征

目的:研究死亡结构域相关蛋白(Daxx)基因在小鼠睾丸精子发生过程中的表达特征,初步探讨其在生精过程中的作用。方法:通过实时荧光定量PCR(q PCR)、Western印迹及免疫荧光等方法检测Daxx在不同周龄野生型小鼠睾丸组织以及成年睾丸支持细胞雄激素受体特异性敲除(SCARKO)和雄激素受体敲除(ARKO)小鼠睾丸中的表达特征。结果:q PCR、Western印迹和免疫荧光结果表明,Daxx基因在出生4周后小鼠睾丸中高表达,且主要定位于细胞核;与野生型小鼠相比,SCARKO小鼠睾丸中DAXX的表达差异不显著(0.853±0.058 vs1.000±0.015),但在生精细胞细胞核中呈极性分布;DAXX在ARKO小鼠睾丸表达显著降低(0.299±0.026 vs1.000±0.015,P0.01)。结论 :Daxx基因在小鼠睾丸发育中期时表达最高。ARKO小鼠中DAXX的表达与野生型相比显著降低,睾丸支持细胞中AR基因特异性敲除影响DAXX定位。DAXX可能参与调控小鼠的精子发生过程。     

睾丸特异性基因BAFL在人和小鼠中的表达及其生物信息学分析

目的 筛选与精子发生相关的基因.方法 将4d、9d、18d、35d、54d和6月龄小鼠睾丸组织cDNA探针与Affymetrix全基因组芯片进行杂交,筛选出差异表达的基因.利用网络信息资源对该基因进行生物学信息分析.RT-PCR分析该基因在小鼠睾丸不同发育阶段4d、9d、11d、14d、18d、21d、38d、6月龄及人和小鼠不同组织心、肝、脾、肺、肾、脑、附睾和睾丸中的表达.结果 芯片结果分析筛选出1个差异表达杂交点,生物信息学分析发现该差异点是BAFL基因,该基因全长527bp,含有273bp的完整ORF,编码90个氨基酸、相对分子量(Mr)为10.266kDa的蛋白质.RT-PCR分析表明小鼠mBAFL基因在小鼠21d龄睾丸及之前没有表达,在35d龄睾丸后开始高表达并特异性地表达于睾丸组织.人hBAFL基因在所检测的8种组织中,也只在睾丸组织中表达.结论 BAFL基因为睾丸特异性基因,小鼠mBAFL的表达与小鼠精子发生的过程一致,可能在精子发生中起重要作用.     

去泛素化酶24基因在小鼠睾丸精子发生过程中的表达特征

目的:研究去泛素化酶24(USP24)基因在小鼠睾丸精子发生过程中的表达特征,初步探讨其在生精过程中的作用。方法:通过实时荧光定量PCR(qPCR)和免疫荧光等方法检测USP24在不同周龄野生型小鼠睾丸组织以及成年雄激素受体敲除(ARKO)小鼠睾丸中的表达特征;采用双荧光素酶报告基因实验检测USP24启动子转录活性。结果:qPCR和免疫荧光结果表明,USP24基因在出生1周时表达水平较低,3周时急剧升高,随后维持在相似水平至第8周;USP24主要定位于支持细胞和生精细胞的细胞质;与野生型相比,USP24在ARKO小鼠睾丸表达降低;性成熟小鼠睾丸中,USP24定位于成熟精子头部后端及中部。双荧光素酶报告基因实验结果显示,睾酮刺激后USP24启动子的转录活性升高。结论:USP24基因的表达水平的升高与小鼠的性发育相关,且其蛋白在小鼠成熟精子上表达。USP24是受雄激素受体(AR)调控的靶基因。USP24可能参与调控小鼠的精子发生过程。     

Zfx在小鼠睾丸生精细胞中的表达

目的:了解Zfx基因在各级生精细胞中的表达情况。方法:本试验采集6、8、17日龄和成年小鼠睾丸,采用组合酶消化法制备单细胞悬液,BSA铺设密度梯度法分离生精细胞,运用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)及Western印迹法(WB)方法检测Zfx基因的表达。结果:组合酶消化法制备单细胞悬液、BSA铺设密度梯度法可获得纯度>85%的各级生精细胞;Zfx基因在原始A型精原细胞、A型精原细胞、B型精原细胞中表达水平低,前细线期精母细胞、粗线期精母细胞、圆形精子细胞中表达量高,长形精子、成熟精子不表达。结论:Zfx基因在各级生精细胞中呈现阶段性表达,可能是参与调控生精细胞减数分裂的重要转录因子。     

Tesmin基因在小鼠睾丸中的表达分析

目的 研究Tesmin基因的表达特点值.方法 将4d、9d、18d、35d、54d和6月龄小鼠睾丸组织提取RNA,通过RT-PCR分析差异表达基因Tesmin在小鼠睾丸不同发育阶段中的表达.结果 基因芯片结果显示4d、9d、18d、35d、54d和6月龄小鼠睾丸中分别是31.4(A)、34(A),1292(P)、865.6(P)、977.2(P) 和830.7(P),代表Tesmin基因在4d,9d小鼠中无表达,18d龄后开始高表达,RT-PCR结果表明小鼠Tesmin基因在小鼠9d龄及之前的睾丸中没有表达,在18d龄后睾丸中开始高表达,与基因芯片分析结果相一致.结论 Tesmin基因为小鼠年龄依赖性表达基因,小鼠Tesmin基因的表达与小鼠精子发生有很强的一致性,推测该基因可能在精子发生中起重要作用.     

小鼠睾丸gdnf基因的克隆及其在支持细胞中的表达

目的：从小鼠睾丸中克隆胶质细胞源神经营养因子基因gdnf,构建真核表达载体,并转染支持细胞,以便用作培养精原干细胞（SSCs）的滋养层。方法：以正常成年昆明鼠为材料,提取小鼠睾丸组织中总RNA后,以RT-PCR技术克隆小鼠睾丸gdnf基因,构建真核表达载体,并转染TM4细胞（睾丸支持细胞株）,在转染后40h进行免疫荧光鉴定。结果：成功克隆小鼠睾丸gdnf基因的cDNA,测序正确,免疫荧光细胞染色显示转染后的支持细胞中有GDNF蛋白表达。结论：本研究为以转染了gdnf基因的支持细胞作饲养层培养SSCs奠定了基础。     

Ces5a基因在大鼠睾丸中的表达

目的:分析羧酸酯酶5a (Ces5a)基因在大鼠睾丸发育过程中的表达情况。方法:选取3组不同窝别出生后2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65 d 21个时间点的大鼠,采用RT-PCR、Western印迹、免疫组化、HE染色分别检测大鼠睾丸组织中Ces5a基因在mRNA转录水平和蛋白表达量及定位。结果:①Ces5a mRNA在大鼠出生后的第2～65天均有表达,大鼠出生后2～12 d Ces5a mRNA的表达量较低;与2～12 d相比,14～16 d的表达量下降至最低水平(P0.05);与14～16 d相比,20～35 d该表达量有显著升高(P0.05);与20～35 d相比,40～65 d的表达量有显著升高,达到高峰(P0.05)。②Ces5a蛋白在大鼠出生后第2～65天均有表达,在大鼠出生后2～12 d Ces5a蛋白的表达量较低;与2～12 d相比,14～16 d Ces5a蛋白的表达量无显著变化(P0.05);与14～16 d相比,20～35 d的表达量有显著升高(P0.05);与20～35 d相比,40～65 d的表达量无显著变化(P0.05)。③Ces5a蛋白表达于精原细胞、精母细胞及圆形精子细胞。结论:①Ces5a基因可能参与了大鼠精原细胞增殖过程及减数分裂过程;②Ces5a基因可能在圆形精子发生和精子变形过程中发挥特殊的作用。     

NYD-SP6基因在无精症患者和不同年龄段人群睾丸中的表达

目的探讨NYD-SP6基因在无精症患者和不同年龄人群中的表达及意义。方法将睾丸标本按胚胎、成年人、老人不同年龄段分成3组：胚胎组（4例）、成人组（4例）及老人组（4例）；将无精症患者按病理类型分成3组，生精细胞减少组（7例）、生精阻滞组（13例）及唯支持细胞综合征组（3例）。应用实时（Real time）逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）方法定量测定这些睾丸组织NYD—SP6基因的表达水平。结果与成人组比较，胚胎和老人组NYD—SP6基因的表达量降低。差异有统计学意义（P〈0．01）；生精阻滞组和唯支持细胞综合征组的表达量降低，差异有统计学意义（P〈0．01）。而生精细胞减少组与成人组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论NYD-SP6基因的表达具有时相性，它在成人睾丸的高表达及在生精阻滞和唯支持细胞综合征患者睾丸表达显著降低，提示其在精子发生中具有重要意义。     

Mahoganoid基因在小鼠精子发生中的动态表达及对雄鼠生殖力影响

目的探讨Mahoganoid（Md）基因在小鼠精子第一发生波中的动态表达以及其基因缺失对雄性小鼠生殖力的影响。方法采用荧光实时定量聚合酶链反应（Real-timePCR）相对定量法检测MahoganoidmRNA在7、14、21、28、35、60d龄C3H／HeJ雄鼠睾丸中的表达;对Md基因缺失纯合子（Md^nc）及C3H／HeJ雄鼠精子密度,精子活力,异常精子形态百分率分析,并通过交配实验观察其使正常雌鼠受孕分娩情况。结果MahoganoidmRNA在7d龄C3H／HeJ雄鼠睾丸有低表达,14d表达开始上调,21d上升趋势明显,35d时表达水平为60d91％;Md^nc可以与雌鼠交配,但无幼鼠出生,Md^nc雄鼠精子快速前向运动百分比明显低于C3H／HeJ雄鼠精子（P〈0．01）。结论Mahoganoid基因与精子发生相关,Mahoganoid基因缺失会导致雄性小鼠精子活力下降,影响其生殖能力。     

TNP2基因在小鼠睾丸组织中的表达研究

目的 筛选与精子发生相关的基因.方法 将4d、9d、18d、35d、54d和6月龄小鼠睾丸组织cDNA探针与Affymetrix全基因组芯片进行杂交,筛选出差异表达的基因.通过RT-PCR分析差异表达基因在小鼠睾丸不同发育阶段中的表达.结果 对Affymetrix全基因组芯片杂交结果分析后,筛选得到1个差异表达杂交点,通过NCBI网站与小鼠全基因组序列Blast分析可知,该差异表达基因是TNP2基因.小鼠TNP2基因全长724bp,其编码框大小为375bp.RT-PCR结果表明TNP2基因在小鼠21d龄及之前的睾丸中没有表达,在35d龄睾丸开始高表达.结论 TNP2基因为小鼠年龄依赖性表达基因,小鼠TNP2基因的表达与小鼠精子发生过程有很强的一致性,因此,可以推测该基因在精子发生中可能起重要作用.     

Effects of adenovirus mediated gene transfer to mouse testis in vivo on spermatogenesis and next generation

PURPOSE: We directly injected DNA into mouse testes in vivo using an adenovirus vector to transfect testicular cells. We then analyzed the transfection efficiency, immunological problems and effects of gene transfer on spermatogenesis and the next generation. In this study we discuss the potential of gene therapy for male infertility. MATERIALS AND METHODS: A replication incompetent human adenovirus serotype 5 contained 2 deletions (E1 and E3 deletions) and was constructed such that the transgene was driven by the chicken beta-actin promoter to promote over expression of the downstream target gene (Lac Z). This adenovirus vector or control solution was injected into the interstitial space (intratesticular injection) or seminiferous tubules (intratubular injection) of the mouse testis. We investigated beta-galactosidase gene expression by X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-d-galactopyranoside) staining, the effects of gene transfer on spermatogenesis by evaluating the frequency of apoptotic cells by the TUNEL method, the inflammatory response on testes by detecting CD4 and CD8 positive cells immunohistochemically, and interleukin (IL)-6 and IL-8 by immunoblot analysis, epididymides sperm motility and the reproductive response of each mouse 3, 7, 14 and 28 days after injection. RESULTS: Intratesticular injection of adenovirus vector resulted in strong transgene expression in Leydig cells. In contrast, intratubular injection resulted in strong expression in Sertoli cells. Transgene expression was not detected in germ cells by either method. The peak of beta-galactosidase activity was on day 7, ie 0.674 +/- 0.20 (intratesticular) and 0.534 +/- 0.22 U (intratubular), and it decreased with time thereafter. The apoptosis index on day 7 was significantly higher in adenovirus injected groups than in noninjected groups, ie 0.46 +/- 0.20 vs 0.10 +/- 0.11 (intratesticular) and 0.78 +/- 0.31 vs 0.24 +/- 0.10 (intratubular). Transfected animals showed a slight mononuclear inflammatory response in the testes composed of CD4 and CD8 positive cells. Adenovirus vector stimulation resulted in the induction of IL-6 and IL-8 secretion in the testis. These immune responses subsided after day 7. There were no significant differences in the percent of motile sperm or the rate of abnormal sperm between the groups on any day after injection. Reproductive ability remained almost normal even after adenovirus mediated gene transfer with no effect observed in offspring. CONCLUSIONS: Our results suggest that although slight spermatogenic damage and inflammatory response caused by these methods may present problems, adenovirus mediated gene transfer may be effective for transfecting testicular somatic cells and applicable for in vivo gene therapy for male infertility in the future.     

A game of cat and mouse: xenografting of testis tissue from domestic kittens results in complete cat spermatogenesis in a mouse host

Loss of genetic diversity because of infertility or the premature death of valuable individuals is a significant problem in the conservation of rare and endangered felid species, as well as in the maintenance of lines of cats used to study inherited feline and human disease. Attempts to overcome loss of genetic diversity have focused on freezing sperm; however, sperm cannot be collected from immature males. Previously, we reported completion of spermatogenesis in testis tissue from newborn pigs and goats grafted ectopically into host mice. The objective of this study was to extend the technique of testis tissue xenografting to the domestic cat as a model for felid species. Testes from 1- to 5-week-old domestic shorthaired kittens (n = 9) were cut into small fragments (about 0.5-1 mm3 each), and up to 8 fragments were grafted under the back skin of each castrated immunodeficient host mouse (n = 16). Histologic examination of the testis xenografts was performed between 5 and 54 weeks posttransplantation. At the time of grafting, the seminiferous cords of the donor testis tissue contained only immature Sertoli cells and gonocytes. At 14 weeks after grafting, tubular expansion was evidently caused by the proliferation of Sertoli cells and tubular lumen formation. By 18 weeks after transplantation, the seminiferous epithelium contained spermatocytes, and by 20 weeks, round spermatids were the most advanced types of germ cells. By 36 weeks after transplantation, xenografts of cat testis tissue had completed spermatogenesis. These results demonstrate the potential of xenografting to achieve full spermatogenesis in testis tissue from kittens. Therefore, sperm production in a mouse host can provide an alternative for germ line preservation from immature felids where sperm cryopreservation is not an option.