GDF-5基因活化基质体内转染修复兔退变椎间盘的实验研究

目的通过GDF5基因活化基质体内转染兔退变椎间盘,观察其修复效果。方法脂质体介导的pcDNA3.1(+)/GDF-5重组质粒混入Ⅰ型胶原支架,置入兔退变椎间盘;实验分为GAM组,普通支架组,脂质体对照组,2个月后RT-PCR和Western blot观察椎间盘髓核细胞GDF-5基因和蛋白表达的稳定性,间苯三酚法检测髓核蛋白多糖含量,流式细胞仪检测细胞凋亡率来观察修复效果。结果 RT-PCR结果显示术后2个月GDF-5基因稳定表达。GAM组蛋白多糖含量高于另外两组(0.05),空白支架组和对照组之间没有差异(=0.601)。GAM组髓核细胞凋亡率明显低于另外两组(0.01),空白支架组和对照组之间没有差异(=0.902)。结论利用GAM可以有效的进行GDF-5基因体内转染并表达,从而修复退变椎间盘。     

兔椎间盘退变与修复模型的研究现状*

椎间盘退变模型是研究椎间盘退变疾病的基础和关键之一。兔退变椎间盘模型具有操作简单、可重复性好等特点被国内外学者广泛应用。兔椎间盘退变模型包括体内模型、体外模型等。体内模型根据损伤类别包括:机械损伤模型、化学损伤模型、异常应力模型、脊柱不稳模型、脊柱融合模型等;体外模型包括椎间盘细胞模型、椎间盘组织模型等。本文根据近年兔腰椎间盘各种退变模型与修复的研究现状与进展作一综述。     

GDF-5基因体外转染骨髓间充质干细胞移植与GAM体内转染对椎间盘退行性变作用的动物实验研究

目的通过对比体外生长分化因子5(GDF-5)转染并移植和基因活化基质(GAM)体内转染对椎间盘退行性变的修复作用,评价这两种方法的差异,以期为临床应用提供依据。方法日本大耳白兔32只,体质量约1.5~2.0kg,雌雄不限。取兔骨髓,分离骨髓间充质干细胞(BMSC),用脂质体介导的pcDNA3.1(+)/GDF-5基因重组质粒转染BMSC。将兔随机分为A组(正常组)、B组(转染细胞组)、C组(GAM组)、D组(对照组)。B、C、D组从L1-2、L2-3、L3-4、L4-5抽吸约湿质量5mg的髓核组织,制作椎间盘退行性变动物模型;B组植入已转染GDF-5的BMSC,C组植入GDF-5GAM,D组植入空白培养液。术后2个月将包括软骨终板在内的各组完整的椎间盘取出,采用间苯三酚法测量椎间盘髓核中蛋白多糖含量,采用流式细胞仪检测分析髓核细胞凋亡率。结果转染48 h后BMSC生长良好,体积略增大。经测定pcDNA3.1(+)/GDF-5基因转染成功后髓核内蛋白多糖含量,B组(0.2169±0.0264)与A组(0.2401±0.0300)间差异无统计学意义(P=0.149);其余组(C组、D组分别为0.1667±0.0278、0.1153±0.033 7)两两比较,差异都有显著的统计学意义(P0.01)。髓核细胞凋亡率,A组(24.55%±2.681%)与B组(30.980%±2.462%)间差异具有统计学意义(P=0.012),其余各组(C组、D组分别为38.220%±2.524%、57.530%±2.349%)两两相比,差异都有显著统计学意义(P0.01)。结论相对于利用GAM进行体内转染,体外转染BMSC然后再移植入体内的方法修复椎间盘退行性变的效率更高。     

低温等离子消融术建立兔椎间盘退变模型的实验研究

目的　探讨低温等离子消融术建立兔椎间盘退变模型的方法与可行性。 方法　新西兰大白兔24只,随机分为实验组12只,对照组12只。两组均穿刺L3/4～L5/6椎间隙,实验组采用消融30s建模,对照组单纯以穿刺针穿刺建模。分别于术前及术后4、8、12周行CR、MRI检查及病理学检查。 结果　实验组DR及MR检查至术后12周均可见退变逐步加重的征象,如椎间隙高度的丢失及T2信号逐步降低。对照组DR及MR检查4周后无明显的退变加重迹象。两组病理学检查均未见早期的髓核缺失,实验组12周可见髓核正常结构消失,椎间盘内结构紊乱。 结论　低温等离子消融术比传统单纯穿刺更易及快速建立椎间盘退变的动物模型,采用此方法建立兔椎间盘退变模型是可靠可行的。     

转染hIGF-1基因增强兔退变椎间盘蛋白多糖的表达

目的 探讨人胰岛素样生长因子(hlGF-1)基因在退变椎间盘中的表达及对椎间盘中蛋白多糖(agglecan)的影响.方法 制备新西兰大白兔腰椎间盘退变(IDD)模型24只,随机分为Ad/CMV.hlGF-1、hlGF.1生长因子及PBS组,每组8只.IA-5、L5-6椎间盘中分别注射第2代Ad/CMV-hlGF-1(8×108PFU)、hlGF-1生长因子(100μg/L)、PBS均25μL.注射后1、2.4和8周,Western blot检测hlGF-1蛋白表达;RT-PCR检测aggrecan mRNA的表达.结果 hlGF-1蛋白带出现在7.6×103ku.Ad/CMV-hlGF-1组hIGF-I蛋白表达持续达4周以上,hIGF-1组表达持续约2周;PBS注射组无hIGF-1蛋白表达.aggrecan电泳条带出现在200～300 bp;在注射后1～4周,Ad/CMV-hlGF-I组内aggrecan mRNA相对表达量进行性增加,8周轻度下降,4个时期总的比较(F=8.51,P<0.05),注射后1～8周,hlGF-1组、PBS组aggrecan mRNA相对表达量进行性下降.结论 hlGF-1能够增强椎间盘aggrecan的表达.     

椎间盘退变模型的研究进展

椎间盘退变疾病发病率越来越高,但退变的机制尚不明确.椎间盘退变模型是现今研究椎间盘退变疾病的主要方式,退变模型主要分为体内退变模型和体外退变模型两大类.两种退变模型从不同角度研究椎间盘退变的病理生理过程,为揭示退变机制及预防、治疗椎间盘退变疾病起着重要作用.本文就目前国内外关于两种不同椎间盘退变模型研究的进展作一综述.     

兔退变椎间盘中BNIP3的免疫组织化学研究

目的探讨兔退变椎间盘中BNIP3蛋白的表达情况。方法建立兔椎间盘穿刺退变模型,分别培养2、4、8周后对目的椎间盘进行组织HE染色、番红O染色及BNIP3免疫组织化学染色,与正常椎间盘随机对照,检测椎间盘退变程度及BNIP3蛋白表达情况。结果成功建立兔椎间盘退变模型,随椎间盘退变程度加重,BNIP3蛋白在中央髓核组织中的阳性表达逐渐增强。结论兔椎间盘退变过程中,BNIP3蛋白表达增强诱导髓核细胞死亡增加。     

透视引导下穿刺构建兔椎间盘退变模型的影像和病理变化

背景：国内外构建的椎间盘退变动物模型大部分是在手术直视下进行的,手术切开操作对动物的损伤较大。 目的：透视引导下穿刺构建兔椎间盘退变模型,观察椎间盘退变过程中影像学及病理学的变化规律。 方法：透视引导下穿刺新西兰大白兔L2/3、L3/4、L4/5椎间盘,不同时间点进行X射线及MRI扫描与病理学检测,测量椎间盘的T2WI信号强度。 结果与结论：椎间盘穿刺后,随着时间的推移,椎间盘逐渐退变,椎间隙逐渐变窄,椎间盘T2WI信号逐渐减低,椎体边缘骨质增生,髓核、纤维环变性、坏死,最终纤维环完全撕裂。表明透视引导下穿刺后椎间盘逐渐发生退变,病理改变与人类椎间盘退变的病理改变相似,且建模方法具有操作简单,创伤小,成功率高等优点。     

椎间盘退变的机制及修复

背景：目前为止,椎间盘退变源性腰痛的发病机制研究并不十分清楚明了,对于其治疗的手段也多种多样,但效果不一。目的：综述近年国内外椎间盘退变机制及修复的研究进展。方法：由第一作者检索至2014年11月为止 PubMed数据(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed)及CNKI中国期刊全文数据库(http://www.cnki.net/),以“椎间盘退变因素,椎间盘源性腰痛,椎间盘退变治疗”等为检索词,共检索到78篇相关文献,排除重复研究,共30篇文献符合纳入标准。结果与结论：综合大量国内外科研人员对椎间盘退变的研究,目前比较推崇的退变因素包括形态学上的改变、炎性递质和细胞外基质的变化、生长因子的作用等,治疗上仍处于对其形态学的修复方面,其中经皮穿刺椎间盘减压、椎体融合、人工椎间盘置换、动态稳定系统等手术治疗方法对椎间盘退变引起的症状有确切的疗效。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

BMP-2转染BMSCs修复兔股骨头坏死模型的实验研究

目的 探索骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)联合骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)基因转染在治疗兔早期激素性ANFH中的作用,以期为临床上ANFH的基因治疗的应用提供理论依据. 方法 把36只新西兰大白兔ANFH模型被随机分为3组,每组12只.A组为模型对照组,B组为模型对照组处理的基础上减压后植入空质粒BMSCs;C组为模型对照组处理的基础上减压后植入重组BMP-2真核表达载体转染的BMSCs.所有动物均将单侧股骨头制作ANFH模型,观察股骨头坏死(Avascular necrosis of the femoral head,ANFH)模型兔的一般情况,并分别于术后4、8周每组处死6只,收集到的模型股骨头标本分别做X线检查、HE染色.通过X线检查、组织学检查的方法检测ANFH修复重建的效果. 结果 ANFH模型股骨头X线检查结果和股骨头组织切片观察,A、B、C三组的效果依次提高,C＞B＞A.结论 BMP-2与BMSCs在新骨生成过程中具有协同作用.     

ZHX3基因转染BMSCs及对体外成骨能力的实验研究

 目的    探讨转录抑制因子-锌指蛋白和同源框3（zinc fingers and homeoboxes 3,ZHX3）基因过表达对BMSCs体外成骨能力的影响。  方法　采用ZHX3过表达慢病毒载体转染大鼠BMSCs,同时设空载病毒转染BMSCs作为阴性对照及不做任何处理的BMSCs做空白对照。采用荧光显微镜计数细胞转染率,并采用Western blot检测ZHX3蛋白表达状况。于体外培养,经定向成骨诱导21d后采用碱性磷酸酶和茜素红染色观察各组细胞成骨能力。  结果　（1）贴壁法获得的细胞具有BMSCs表型。（2）转染后,ZHX3过表达组和阴性对照组均表达绿色荧光,空白对照组不表达荧光,且ZHX3过表达组ZHX3基因表达显著高于阴性对照组。（3）ZHX3过表达、阴性对照组和空白对照组均可见碱性磷酸酶阳性表达的细胞。Kaplow评分显示前者阳性表达显著高于后两者（P<0.05）。ZHX3过表达组、阴性对照组和空白对照组均可见明显的矿化结节。前者矿化结节的数量和体积均大于后两者。  结论　ZHX3基因过表达可促进BMSCs体外成骨能力。     

Activin B联合BMSCs不同移植方式对大鼠皮肤创伤愈合的治疗

目的　探讨BMSCs联合生长因子对治疗皮肤创伤最为有效的移植途径。 方法　分离并鉴定BMSCs,移植后活体成像仪及冰冻切片观察CFSE标记的BMSCs,统计创面愈合率,并进行HE染色观察伤口愈合。 结果　细胞表面标记物CD90表达呈阳性,CD80表达呈阴性。活体成像仪3、7d观察实验组大鼠皮肤创面均有荧光显示,而对照组无。术后各时间点BMSCs移植组创面愈合率均高于对照组（P＜0.05）,而不同移植方式相比差异无统计学意义。 结论　Activin B联合BMSCs经表皮移植和尾静脉移植均可以迁移至皮肤创伤部位并参与皮肤创伤的修复,相对于尾静脉移植组,表皮移植组在创伤修复中更简便易行。     

骨髓间质干细胞和脑源性神经营养因子联合应用促进兔脊髓外伤性截瘫的修复

目的:观察骨髓间质干细胞(bone m arrow strom a cells,BM SCs)和脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BD N F)联合应用对兔脊髓外伤性截瘫结构和功能修复的影响,以寻求建立一种更有效的治疗脊髓外伤性截瘫的疗法。方法:采用改良A llen打击法建立兔脊髓外伤性截瘫的模型,模型建立成功后观察3d再分别行注射生理盐水(对照组)、BM SCs、BD N F和BM SCs BD N F干预。脊髓损伤移植后1、3、5周进行改良Tarlov评分及CSEP评测,5周观察脊髓结构的变化。结果:与BM SCs组、BD N F组相比,移植后第5周,BM SCs BD N F联合移植组脊髓损伤处结构恢复较好,第3周、5周后,BM SCs BD N F组的CSEP和改良Tarlov评分亦明显好于BM SCs组和BD N F组(P<0.01)。结论:BM SCs和BD N F联合移植对急性脊髓外伤性截瘫的结构和功能有更好的修复作用。     

低频电磁场对BDNF基因修饰的BMSCs增殖影响的实验研究

目的　探讨低频电磁场（LFEMF）对脑源性神经营养因子（BDNF）基因修饰的骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖的影响。 方法　通过同源重组的方法,用pAd-easy I腺病毒包装系统在体外构建含BDNF基因的重组腺病毒表达载体(rADBDNF);体外分离纯化SD大鼠来源的BMSCs,rADBDNF感染后,用LFEMF（50 Hz、5 mT）进行干预,连续干预3 d,并设对照组、BDNF基因修饰组、LFEMF组。在倒置相差显微镜下,对经台盼蓝染色的各组细胞进行计数;四甲基偶氮唑蓝（MTT）法对各组细胞的增殖效率进行检测;流式细胞仪分析细胞周期变化。 结果　LFEMF作用于BDNF基因修饰后的BMSCs,细胞增殖速率与对照组、BDNF基因修饰组比较,差异有统计学意义（P<0.05）,与LFEMF组相比,差异无统计学意义（P>0.05）,G2/M期细胞数量明显增多。 结论　LFEMF干预可促进BDNF基因修饰后BMSCs增殖。     

异基因骨髓源间充质干细胞对BXSB小鼠T、B细胞的影响

目的：探讨异基因骨髓源间充质干细胞（Bonemarrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）对BXSB小鼠T、B细胞增殖、活化及功能成熟等方面的影响。方法：采用。H．TdR掺入法、FACS法、EIJSA等方法检测BMSCs对BXSB小鼠T、B细胞的影响。结果：BALB／c小鼠的BMSCs在不影响BXSB小鼠T细胞诱导活化的基础上抑制其诱导增殖；可降低由ConA诱导的CD4^＋IL^＋细胞的数量，而提高由ConA诱导的CD4^＋IFN-γ^＋细胞数量。对于B细胞，BALB／c小鼠的BMSCs可以抑制其增殖、活化及IgG的分泌。另外，BALB／c小鼠的BMSCs可以抑制BXSB小鼠B细胞上CIMOL的异位表达。结论：异基因BMSCs对自身免疫病小鼠的T、B细胞有一定的调节作用。     

人生长分化因子-5完整成熟肽基因的克隆

目的：克隆人生长分化因子-5(hGDF-5)完整成熟肽基因。方法：根据Genbank中hGDF-5的序列化学合成两条引物，从人胎儿软骨组织提取总RNA，通过反转录聚合酶链式反应(RT—PCR)得到hGDF-5完整成熟肽基因。将所得基因片段插入克隆载体pMD18-T并转化大肠杆菌DH5α，提取重组质粒，酶切鉴定并测序。结果：DNA琼脂糖凝胶电泳显示：PCR产物为一长约380bp的带，阳性克隆质粒经双酶切可切出约380bp的片段。全自动DNA测序表明与Genbank中的序列完全相符。结论：通过反转录聚合酶链式反应从人胎儿软骨组织中成功克隆出人GDF-5完整成熟肽基因，基因序列完全正确。     

CXCR4+骨髓间充质干细胞迁移与氧化型低密度脂蛋白致内皮细胞损伤

目的 研究内皮细胞分泌的基质细胞衍生因子1(SDF-1)是否影响CXCR4+干细胞迁移功能.方法 从骨髓中分离出CXCR4+的骨髓间充质干细胞(CXCR4+BMSC),用氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激人脐静脉内皮细胞(HUVEC),用MTT法检测HUVEC细胞增殖,用RT-PCR检测SDF-1α mRNA的表达,用ELISA检测SDF-1α蛋白表达,用Transwell(R)检测CXCR4+BMSC迁移.结果 ox-LDL的刺激影响HUVEC增殖,并引起SDF-1α mRNA和蛋白表达升高;含SDF-1α培养基上清能促进CXCR4+BMSC迁移,这种迁移可被CXCR4抗体抑制.结论 CXCR4+BMSC可通过SDF-1α/CXCR4轴向引起内皮细胞发生迁移运动.