低氧致肺动脉平滑肌细胞增殖及其作用机制初探

目的和方法：实验采用ＰＤＧＦ生物活性检测法，流式细胞术，「＾３Ｈ」－ＴｄＲ掺入以及细胞免疫线化等方法探讨了低氧状态下，血小板源生长因子（ＰＤＧＦ）及其受体与肺动产滑肌细胞（ＰＡＳＭＣ）增殖间的相互关系。结果：低氧可以增强ＰＤＧＦ的活性，上调ＰＧＦ受体促进ＰＡＳＭＣ增殖以ＰＤＧＦ作为刺激嘲一步促进低氧的促增殖作用。结论：低氧状态下，ＰＡＳＭＣ的ＰＤＧＦ及其受体进一步活化，从而增强了ＰＤＧＦ自分泌、旁     

血小板源生长因子在低氧性肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

运用流式细胞仪及细胞原位杂交方法测定低氧对培养的新生牛肺动脉平滑肌细胞（ＰＡＳＭＣ）生长的影响，并探讨血小板源生长因子（ＰＤＧＦ）在其中的作用，结果表明：培养的ＰＡＳＭＣ的低氧１２ｈ时，由Ｇ０／Ｇ１期进入Ｓ斯的细胞数明显增多，为对照组的１５７．７％（Ｐ〈０．０５）；ＰＤＧＦ可进一步促进低氧状态下ＰＡＳＭＣ的增殖，Ｓ期细胞为对照组的２４２．３％（Ｐ〈０．０１），原位杂交结果显示：低氧（１２ｈ）条件下     

低氧诱导因子与产科疾病的关系

缺 氧时组织细胞和机体发生极为复杂的反应。机体产生低氧反应基因 (hypoxiaresponsivegenes ,HRG)以保持体内氧的平衡状态 ,是体内应激的一种适应机制[1] 。低氧诱导因子 1(hypoxia induciblefactor 1,HIF 1)是调节低氧状态下多种平衡的中心环节[2 ] 。1　HIF 1的结构和特点HIF 1是一种核转录因子 ,由HIF 1α、HIF 1β两个亚单位组成。HIF 1α是由 82 6个氨基酸组成的bHLH PAS(basishelix loop helix PAS)蛋白。BHLH主要是结合DNA ,PAS主要是识别PER、ARNT、SIM等蛋白质构成异二聚体。HIF 1α的氨基酸序列中 1 16 6…     

钙敏感受体在缺氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

目的:观察钙敏感受体(CaSR)在缺氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用。方法:Ⅱ型胶原酶消化法提取、培养大鼠肺动脉平滑肌细胞。应用Western blotting技术及免疫荧光染色分析CaSR蛋白在肺动脉平滑肌的表达;采用激光共聚焦扫描技术检测不同处理因素对细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的影响,应用MTT法分析不同处理因素对细胞存活率的影响。结果:大鼠肺动脉平滑肌细胞有CaSR蛋白表达。缺氧能够增加CaSR和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达、细胞存活率及[Ca2+]i(与对照组比较,P0.05)。GdCl3(CaSR激动剂)能够增强缺氧的上述作用,NPS2390(CaSR抑制剂)则能够减弱缺氧的作用。结论:缺氧诱导的CaSR表达增加参与了缺氧性肺动脉平滑肌细胞增殖。     

蛋白激酶C在低氧肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

低氧肺动脉平滑肌细胞的增殖在肺血管重构、低氧性肺动脉高压的形成发展中有重要作用。蛋白激酶C(PKC)是细胞后信号通路之一 ,在低氧肺动脉平滑肌细胞增殖的多个环节中发挥作用。     

一氧化氮在脂多糖抑制血管平滑肌细胞增殖中的作用

本研究采用MTT 法,3 H-TdR 掺入实验、分光光度计测量和免疫组织化学的方法,观察了脂多糖对离体培养SD 大鼠血管平滑肌细胞殖增、DNA 合成、一氧化氮产量和一氧化氮合酶表达的影响。结果发现,脂多糖可明显抑制血管平滑肌细胞的增殖和DNA 合成,推测该效应可能是通过iNOS-NO-cGMP 通路实现的。     

缺氧诱导因子与miRNA在低氧性肺血管重构中作用的研究进展

【摘要】　低氧性肺血管收缩(hypoxic pulmonary vasoconstriction, HPV) 与肺血管重构(hypoxic pulmonary vascular remolding, HPVR) 是低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension, HPH) 发生发展过程中的两个主要阶段, 其中低氧性肺血管重构是HPH 的主要病理生理特征。血管壁的肺动脉内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞异常的增殖、凋亡和代谢变化会导致肺血管重构和阻塞, 是HPH 进行性加重的主要原因。目前发现缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factors, HIF) 与微小核糖核酸(miRNA) 均可引起与低氧性肺动脉高压肺血管重构相关的血管壁细胞的改变, 导致细胞增殖与凋亡的失衡, 并进一步诱导HPH 的形成。了解HIF 和miRNA 在低氧性肺血管重构中作用的最新研究成果, 有助于了解HPH 发病的分子基础, 确定新的预后标志物及治疗靶点, 为靶向治疗疾病提供新的导向。     

缺氧诱导因子-1在缺氧诱导一氧化氮合成酶基因表达中的作用

目的 研究缺氧诱导因子-1(HIF-1)在一氧化氮合成酶基因缺氧诱导反应中的作用。方法 体外合成具有HIF-1特异结合位点的DNA片段(红细胞生成素3'-增强子片段),借助脂质体,转入培养的鼠主动脉内皮细胞和肺微血管细胞,用半定量RT-PCR方法测定诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)mRNA。结果 (1)大鼠主动脉内皮细胞、肺微血管内皮细胞在常氧下培养,有iNOS基因表达;(2)缺氧能诱导这两种细胞iNOS基因表达增加;(3)野生型EPO3'-增强子片段能阻断缺氧对内皮细胞iNOS基因表达的诱导作用,而突变片段则无此作用。结论 在iNOS基因序列中,可能存在EPO3'-端增强子片段,其参与内皮细胞的缺氧反应。     

低氧及一氧化氮对SW480细胞缺氧诱导因子-1α、VEGF及iNOS 表达的初步研究

目的：观察一氧化氮(NO)对低氧培养的人结肠腺癌细胞株SW480中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响。方法： 运用免疫细胞化学检测HIF-1α、VEGF、iNOS蛋白表达，Western blot检测HIF-1α蛋白表达。原位杂交法检测HIF-1α mRNA表达。结果： 免疫细胞化学染色图像分析结果显示：低氧组细胞HIF-1α、VEGF和iNOS蛋白表达水平显著高于常氧组(P<0.01，P<0.01，P<0.05)和低氧＋genistein（三羟基异黄酮）组（P<0.01，P<0.05，P<0.05）。低氧条件下，SNP（硝普钠）显著抑制HIF-1α、VEGF蛋白的表达,但对iNOS表达无明显影响；NOC5（NO发生剂）诱导HIF-1α、VEGF、iNOS蛋白的表达；NO抑制剂L-NAME(N-硝基精氨酸甲酯)则抑制3者的表达。 Western blot结果显示：低氧培养条件下，HIF-1α呈强表达，给予genistein能显著抑制其表达；而给予SNP和L-NAME后，蛋白表达量减少，给予NOC5，则蛋白表达增强。原位杂交结果显示：常氧组、低氧组及低氧＋genistein组、低氧＋SNP组、低氧＋NOC5组、低氧＋L-NAME组HIF-1α mRNA表达A值组间均无显著差异。结论： 低氧诱导SW480细胞HIF-1α蛋白表达量增高，从而上调VEGF和iNOS表达。低氧条件下，NO供体SNP抑制SW480细胞HIF-1α蛋白及VEGF表达，而另一种供体NOC5则促进HIF-1α表达，两种供体对HIF-1表达的影响可能存在不同的机制。     

FHL1在香烟烟雾刺激的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖与迁移中的作用

 目的：研究FHL1 (four-and-a-half LIM domain 1)在香烟烟雾提取物（CSE）刺激的大鼠远端肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖及迁移中的作用。方法：原代培养PASMCs,分别予CSE及FHL1 siRNA转染干预,分为6组：空白组、阴性转染组、FHL1 siRNA转染组、CSE组、CSE+阴性转染组和CSE+FHL1 siRNA转染组。Real-time PCR法检测FHL1 mRNA的表达,Western blotting法检测FHL1 蛋白,CCK-8法检测细胞增殖,Transwell 法测定细胞迁移。结果：CSE刺激导致PASMCs增殖、迁移及FHL1蛋白表达增加 (P<0.01) ,但FHL1 mRNA的表达无明显改变（P＞0.05）。FHL1 siRNA转染PASMCs,可降低CSE所致的PASMCs增殖及迁移(P<0.01)。结论：CSE可促进PASMCs增殖与迁移以及FHL1蛋白的表达, 抑制FHL1蛋白的表达可减弱CSE对PASMCs增殖和迁移的作用。这些结果表明CSE促进PASMCs增殖和迁移与FHL1蛋白有关。     

Diazoxide对缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞内氧自由基的变化及细胞增殖的作用

目的： 研究线粒体膜上ATP敏感钾通道（MitoK_ATP）开放剂diazoxide和线粒体膜电位（ΔΨm）在缺氧导致的大鼠肺动脉平滑肌细胞内氧自由基的变化及细胞增殖/凋亡失衡中的作用，探索缺氧性肺动脉重建和肺动脉高压形成的发生机制。方法： 取大鼠正常肺组织，分离出肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）进行常氧或慢性缺氧培养。将样本分为6组：① 正常对照组；② 线粒体膜上ATP敏感钾通道（MitoK_ATP）开放剂diazoxide组；③ MitoK_ATP 阻断剂5-HD组；④ 慢性缺氧(CH)组；⑤ CH+diazoxide组；⑥ CH+5-HD组。利用激光共焦显微镜（Leica SP-1 USA）成像检测线粒体膜电位，荧光染色检测细胞内氧自由基含量，流式细胞仪检测细胞周期和MTT法检测细胞增殖情况。结果： ① Diazoxide作用24 h后，R-123荧光强度明显强于正常对照组，线粒体膜电位去极化，细胞内氧自由基含量明显高于正常对照组，细胞增殖明显多于正常对照组、凋亡少于正常对照组，P<0.05；而5-HD作用24 h后，上述指标与正常对照组相比较，均无显著差异,P>0.05；②慢性缺氧24 h，结果与diazoxide组相似，R-123荧光强度明显强于正常对照组，线粒体膜电位去极化，细胞内氧自由基含量明显高于正常对照组，细胞增殖明显多于正常对照组、凋亡少于正常对照组，P<0.05；CH+diazoxide组，R-123荧光强度和线粒体膜电位去极化明显强于缺氧组，细胞内氧自由基含量明显高于缺氧组，细胞增殖明显多于缺氧组、凋亡少于缺氧组，P<0.05；CH+5-HD组，R-123荧光强度和线粒体膜电位去极化明显弱于缺氧组，细胞内氧自由基含量明显低于缺氧组，细胞增殖明显少于缺氧组、凋亡多于缺氧组，P<0.05;R-123荧光强度、MTT的A值与细胞内氧自由基含量均呈显著正相关；凋亡细胞百分比与细胞内氧自由基含量呈显著负相关。结论： 本实验结果显示，diazoxide能够通过开放线粒体膜上ATP敏感的钾通道，引起ΔΨm去极化，ΔΨm的变化影响细胞内氧自由基的含量，氧自由基可能作为信号分子通过影响肺动脉平滑肌细胞的增殖/凋亡的平衡，参与了缺氧性肺动脉重建和肺动脉高压的发生和发展过程。     

大鼠肺动脉平滑肌细胞Rho激酶对 p-Smad1核迁移的作用及机制

目的: 研究Rho激酶对p-Smad1核迁移的作用及信号转导途径,探讨它们在肺血管重构中的作用机制。方法: 分离培养大鼠远端肺动脉平滑肌细胞,应用血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)启动肺动脉平滑肌细胞Rho激酶信号通路,应用骨形态发生蛋白2(BMP-2)启动BMP信号通路,并用Rho激酶抑制剂Y-27632、MEK抑制剂U0126进行干预。培养细胞分成5组:(1)对照组;(2)BMP-2组;(3)BMP-2+PDGF-BB组;(4)BMP-2+PDGF-BB+Y-27632组;(5)BMP-2+PDGF-BB+U0126组。免疫荧光染色标记p-Smad1在细胞核内外的分布并计算p-Smad1核迁移阳性细胞百分数(即核迁移率)。分离平滑肌细胞核蛋白和胞浆蛋白,Western blotting分析p-Smad1在细胞内的总量和细胞核内外相对含量的变化。Kit-WST-8试剂盒检测细胞增殖。结果: BMP-2组p-Smad1在细胞内的总量、在细胞核中的相对含量和核迁移率明显高于对照组(P<0.05);BMP-2+PDGF-BB 组p-Smad1的核迁移率和在细胞核中的相对含量明显低于BMP-2组(P<0.05),但是细胞内p-Smad1总量无明显改变(P>0.05);BMP-2+PDGF-BB+ Y-27632组和BMP-2+PDGF-BB+U0126组细胞内p-Smad1的总量、在细胞核中的相对含量和核迁移率与BMP-2组基本相似(P>0.05)。BMP-2组的A值明显小于对照组(P<0.05);PDGF-BB+BMP-2组的A值明显大于BMP-2组(P<0.05)且大于对照组(P<0.05);BMP-2+PDGF-BB+Y-27632组和BMP-2+PDGF-BB+U0126组的A值均小于PDGF-BB+BMP-2组(P<0.05)。结论: 在大鼠肺动脉平滑肌细胞,PDGF-BB激活的Rho激酶通过MEK/ERK1/2抑制BMP-2引起的p-Smad1核迁移,促进平滑肌细胞增殖。     

缓激肽对TGF-β1诱导的猪肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

 目的：研究缓激肽（BK）对转化生长因子 β1（TGF-β1）诱导的肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖的影响及其可能机制。方法：原代培养猪PASMCs,采用CCK-8法测定BK对TGF-β1诱导的PASMCs增殖能力的影响,同时应用Western blotting检测PASMCs PI3K、p-Akt和p-ERK1/2表达的变化。结果：TGF-β1呈剂量依赖性促进PASMCs增殖（P<005）,BK显著抑制了TGF-β1诱导的PASMCs增殖（P<005）,而BK 2型受体（B2R）抑制剂HOE-140可以显著抑制BK的效应（P<005）;Western blotting结果显示,BK抑制TGF-β1诱导的PASMCs增殖主要是通过阻断PI3K/Akt和ERK1/2信号通路活化而实现。结论：BK显著抑制TGF-β1诱导的PASMCs增殖,此作用可能与其抑制PI3K/Akt和ERK1/2信号通路活化有关。     

大鼠远端肺动脉平滑肌细胞分离与原代培养

目的探索简便、高效原代培养大鼠远端肺动脉平滑肌细胞的方法,为研究肺动脉高压发病机制提供实验材料。方法采用显微操作和分次酶消化法进行原代培养并与传统酶消化法比较。对培养的细胞进行形态学观察、平滑肌α-actin免疫荧光细胞化学法鉴定、激光扫描共聚焦显微镜计算纯度。结果两种酶消化法均可获得高纯度的远端肺动脉平滑肌细胞。镜下细胞呈典型的"峰-谷"状生长,胞质特异的α-actin阳性表达,细胞纯度达98%。分次酶消化法获得的细胞数及细胞存活率均大于传统酶消化法,并且提前了3d得到足够进行实验的细胞数量。结论本法简便、可靠、低成本,短期内可获得大量高纯度、功能良好的远端肺动脉平滑肌细胞。     

低氧诱导因子-1α和内皮素-1基因在大鼠低氧性肺动脉高压中的表达

目的　探讨低氧诱导因子 1(HIF 1α)和内皮素 1(ET 1)基因表达在低氧性肺动脉高压发病过程中的变化和作用。方法　复制低氧性肺动脉高压大鼠模型 ,测定平均肺动脉压 ,弹力纤维染色显示腺泡内肺动脉 ,用放射免疫法测ET含量 ,原位杂交方法进行检测HIF 1αmRNA。结果　HIF 1αmRNA在低氧各组腺泡内肺动脉有表达 ,低氧 14d组 (0 2 5 6 9± 0 0 46 8)和低氧 2 8d组 (0 2 2 5 8±0 0 45 3)染色强于低氧 5d组 (0 145 5± 0 0 2 72 )和正常组 (0 110 9± 0 0 2 2 4) ;ET 1mRNA在低氧各组腺泡内肺动脉有表达 ,低氧 14d组 (0 412 2± 0 0 783)和低氧 2 8d组 (0 36 84± 0 0 72 9)染色强于低氧5d组 (0 2 0 17± 0 0 34 9)和正常组 (0 185 5± 0 0 36 1) ,HIF 1α和ET 1基因表达在H14d组和H2 8d组明显增加 (P <0 0 5 )。肺动脉血中ET 1含量在H14d组 [(15 8 78± 2 5 14)pg/ml]和H2 8d组 [(142 93± 2 3 38)pg/ml]明显高于H5d组 [(79 6 8± 12 5 4)pg/ml]和正常组 [(6 5 37± 10 82 )pg/ml](P <0 0 5 ) ;H14d组 [(34 0± 5 8)mmHg]和H2 8d组 [(2 9 0± 4 7)mmHg]的mPAP也明显高于H5d组[(19 0± 3 5 )mmHg]和正常组 [(17 0± 2 8)mmHg](P <0 .0 5 ) ,并且与肺动脉血中ET 1含量呈正比(rs=0     

慢性缺氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞胞内钙的影响及其机制研究

目的:研究慢性缺氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)胞内钙浓度(［Ca²⁺］_i)的影响及L-型钙通道和胞内钙库的作用,为缺氧性肺动脉高压(HPH)发病机制的进一步研究提供理论依据。 方法:复制大鼠缺氧性肺动脉高压动物模型，利用Fura－2/AM钙离子成像方法测定PASMCs在不同钙离子浓度细胞外液及L-型钙通道阻滞剂nifedipine和IP3R钙通道抑制剂肝素干预前后 ［Ca²⁺］_i变化。 结果:(1)缺氧＋含钙外液组PASMCs ［Ca²⁺］_i 显著高于对照＋含钙外液组（P<0.05）。缺氧＋含钙外液组PASMCs ［Ca²⁺］_i显著高于缺氧＋无钙外液组（P<0.05）。(2)缺氧nifedipine组PASMCs［Ca²⁺］_i在加药前后无显著差异（P>0.05）。（3）缺氧未干预组与缺氧肝素组PASMCs ［Ca²⁺］_i无明显差异（P>0.05）。 结论:慢性缺氧可使PASMCs的［Ca²⁺］_i增加。慢性缺氧引起［Ca²⁺］_i增加可能与细胞外钙内流有关，L-型钙通道和IP3R钙通道在调节［Ca²⁺］_i的过程中可能不独立发挥作用。     

缺氧诱导因子-1在缺氧预处理心肌保护中的作用及其机制研究

目的:研究缺氧诱导因子-1(HIF-1)在缺氧预处理(HPC)心肌细胞保护中的作用及其机制。方法:在培养的SD乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(H/R)模型上,观察HPC对于24h后心肌细胞H/R损伤的影响,以MTT法测定心肌细胞存活率,试剂盒测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性。制备心肌细胞蛋白提取物,以磷酸化的细胞外信号调节激酶(ERK1/2)抗体测定HPC后不同时间ERK1/2活性,以聚丙烯酰胺电泳迁移实验观察HIF-1α磷酸化,并观察蛋白磷酸酶激动剂BDM和ERKs的上游激酶(MEK1/2)抑制剂PD98059对于HPC诱导的HIF-1α磷酸化以及心肌细胞保护作用的影响。结果:HPC可以提高心肌细胞H/R后存活率、减少LDH漏出,并激活ERK1/2,使HIF-1α发生磷酸化;蛋白磷酸酶激动剂BDM和ERKs的上游激酶MEK抑制剂PD98059可以消除HPC诱导的HIF-1α磷酸化和心肌细胞保护作用。结论:HPC可以提高乳鼠心肌细胞对于H/R的耐受性,其机制涉及ERKs介导的HIF-1α磷酸化。     

瞬时感受器电位香草酸受体1参与低氧性人肺动脉平滑肌细胞系的增殖

 目的 探讨低氧培养的人肺动脉平滑肌细胞系中瞬时感受器电位香草酸受体1的表达及功能改变,。方法 用RT-PCR、Real-time PCR和Western blot检测人肺动脉平滑肌细胞中TRPV1的表达。用细胞计数法检测细胞增殖。结果 低氧能明显上调人肺动脉平滑肌细胞中TRPV1通道的mRNA和蛋白的表达,并促进增殖, TRPV1通道阻断剂 Capsazepine呈剂量依赖性地抑制增殖。结论 TRPV1通道可能参与或调制低氧所致细胞增殖。     

PI-3K在低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的表达

目的:研究低氧肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖时磷脂酰肌醇3 激酶(PI-3K)的表达。方法:实验分为无血清培养基(SFM)组和低氧48 h(H48 h)组, 应用免疫组织化学法和流式细胞仪检测低氧PASMC。结果:SFM组和H48 h组PASMC细胞浆内均有PI-3K p110阳性表达, H48 h组(0.1891±0.0301)的表达明显高于SFM组(0.1025±0.0164, P＜0.05);PCNA在SFM组的少数PASMC细胞核内有阳性表达, H48h组(24.58±4.07)%的增殖指数(PI)明显高于SFM组(8.76±1.21)%(P＜0.05);流式细胞仪检测发现PASMC的S+G₂／M期细胞所占细胞总数的百分比在H48 h(27.15±5.43)%显著高于SFM组(10.64±1.52)%(P＜0.05)。结论:低氧可显著上调PI3K的表达, 提示PI-3K可能在低氧PASMC增殖中起重要作用。     

衰老和低氧对体外培养大鼠肺动脉平滑肌细胞形态的影响

目的： 探讨衰老及低氧对体外培养的PASMCs形态的影响。方法： 将细胞分为年轻常氧组、老年常氧组、年轻低氧组、老年低氧组，应用光镜观察、免疫组化及免疫荧光的方法检查细胞的形态变化。结果： 低氧状态与常氧条件下培养的PASMCs形态上有明显差别，且胞浆内F-actin分布及排列均有明显差别；老年组PASMCs的 SM-α-actin 含量减少比年轻组明显；低氧组PASMCs的SM-α-actin含量比常氧组减少明显。结论： 衰老及低氧使PASMCs形态发生变化，均能直接刺激PASMCs的转化;衰老的平滑肌细胞受低氧刺激,SM-α-actin变化最为明显。