醋酸铅对体外培养未成年小鼠骨髓间充质干细胞生长的影响

目的:探讨醋酸铅对体外培养未成年小鼠骨髓间充质干细胞生长的影响,为进一步阐明铅骨髓毒性作用机制,采取相应防治措施提高儿童健康水平提供依据。方法:不同浓度醋酸铅作用于体外培养的骨髓间充质干细胞,观察其对间充质干细胞成集落(CFU-F)数的影响及变化规律。结果:醋酸铅可明显抑制CFU-F的生长,各实验组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),且随浓度增加抑制作用增强,呈明显的剂量-效应关系(r=-0.960,P=0.000),其中CFU-F集落的IC50=80.00μmol/L。结论:醋酸铅可明显抑制体外培养的骨髓间充质干细胞生长。     

铅对未成年小鼠骨髓干/祖细胞和外周血的毒性作用

目的:为防治铅中毒提供实验室研究资料,探讨铅染毒时铅对未成年小鼠骨髓造血干/祖细胞和外周血的毒性作用。方法:60只昆明系小鼠随机分成4组,分别以0mg Pb2+/L、164mg Pb2+/L、546mg Pb2+/L、1638mg Pb2+/L浓度的醋酸铅饮用水对小鼠染毒,于染毒的第10天取小鼠股骨骨髓细胞作体外培养,观察各组红系祖细胞成集落数(BFU-E)和粒系祖细胞成集落数(CFU-GM)的变化并进行外周血测定。结果:醋酸铅可明显抑制骨髓BFU-E和CFU-GM的生长,集落数与对照组相比差异显著(P<0·05),且随醋酸铅浓度的增加,骨髓BFU-E抑制作用增强(相关系数为rs=-0·972,P=0·000),而外周血Hb、WBC和PLT与对照组比较差异无显著性(P<0·05)。结论:骨髓造血祖细胞对铅较为敏感,铅染毒小鼠外周血变化不明显时,已引起骨髓BFU-E和CFU-GM的生长障碍。     

体外培养法观察铅对未成年小鼠造血干/祖细胞生长的影响

目的:为防治儿童铅中毒提供实验室研究资料,探讨醋酸铅对体外培养的小鼠骨髓造血祖细胞的影响。方法:将不同浓度的醋酸铅作用于体外培养的骨髓粒系造血祖细胞(CFU-GM)和红系造血细胞(BFU-E),观察CFU-GM和BFU-E细胞的集落数变化。结果:醋酸铅可明显抑制骨髓CFU-GM和BFU-E的生长,与对照组比较差异显著(P<0.05),且随浓度增加抑制作用增强,呈明显的剂量-效应关系;进行等级相关分析,相关系数分别为rs=-0.969(P=0.000)和rs=-0.983(P=0.000)。结论:醋酸铅可明显抑制体外培养的骨髓CFU-GM和BFU-E的生长。     

诱导分化骨髓干细胞（MSCs）构建膀胱的实验研究

目的分离提起大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,体外培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,通过组织工程技术．构建组织构建膀胱,为进一步临床应用奠定基础。方法将sD大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增后,以生长状态良好的骨髓问充质干细胞接种于制备好的聚乳酸一聚乙醇酸支架上,进行体外联合培养,构建组织工程皮肤。观察细胞生长情况及组织工程构建膀胱。结果体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞生长良好,传代扩增容易,骨髓间充质干细胞在聚乳酸一聚乙醇酸基质中生长良好,可体外构建组织工程膀胱。结论通过利用体外扩增培养的骨髓问充质干细胞制备的上皮细胞可以体外聚乳酸一聚乙醇酸支架构建组织工程膀胱。     

骨髓间充质干细胞支持脐血造血干／祖细胞体外扩增的研究

目的体外分离培养人新鲜脐血（UCB）造血干细胞（HSC），利用骨髓间充质干细胞作为滋养层联合细胞因子组合以扩增脐血造血干／祖细胞。方法采用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离UCBHSC，加入骨髓间充质干细胞和细胞因子，检测脐血造血干／祖细胞总有核细胞（NC）总数和CD34^＋细胞数。结果有核细胞总数扩增（75．2±15．0）倍，CD34^＋细胞数扩增（18．7±12．3）倍。结论体外HSC培养，加入骨髓间充质干细胞和细胞因子对造血干／祖细胞增殖有明显的作用。     

Notch信号通路在低剂量铅暴露对卵巢癌干细胞样细胞体外致瘤功能中的作用

目的 探讨Notch信号通路改变在低剂量铅暴露对卵巢癌干细胞样细胞体外致瘤功能中的作用。 方法 对SKOV3细胞进行悬浮培养,对其进行低剂量(2 μM)的铅暴露。分别观察铅暴露组、对照组SKOV3、细胞球形成率和集落形成率的差异;通过Western blot检测铅暴露组与未处理组SKOV3细胞Notch信号通路的改变;通过Notch信号通路的抑制剂作用SKOV3细胞,检测铅暴露对SKOV3细胞球形成率和集落形成率的改变。 结果 与对照组相比,铅暴露组SKOV3源性卵巢癌干细胞样细胞球形成率降低,细胞集落形成率显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。Notch1和Hes1蛋白表达显著增加。当Notch信号通路被抑制后,铅诱导的卵巢癌干细胞样细胞球形成率和集落形成率降低的趋势被逆转(P<0.05)。 结论 低剂量的铅暴露能够抑制SKOV3细胞球形成率和集落形成率,并且在此过程中Notch信号通路发挥了关键作用,抑制Notch信号通路能够降低铅暴露对SKOV3细胞球形成率和集落形成率。     

醋酸铅对原代培养大鼠皮层神经元的毒性效应

目的探讨醋酸铅对体外培养大鼠皮层神经元的毒性效应。方法用不同浓度的醋酸铅(50、100和200μg/ml)染毒后,原代培养乳大鼠皮层神经元,通过中性红染色和PI-Hoechst 33342双染色法观察醋酸铅作用6、12、24和48h对细胞存活的影响;结果PI-Hoechst 33342双染色结果表明,各组醋酸铅染毒12h后,部分细胞出现核固缩,随着醋酸铅浓度的增加和培养时间的延长,出现核固缩细胞增多,呈红色荧光细胞比例增加,凋亡细胞增加。对照组细胞凋亡比例明显低与中浓度和高浓度醋酸铅组P0.05)。中性红染色结果表明,不同浓度醋酸铅作用皮层神经元不同时间后各染铅组细胞活性随时间的延长而降低,但除高醋酸铅染毒组在24和48h较6h差异有统计学意义(P0.05)外,其余差异均无统计学意义(P0.05)。各染铅组细胞活性随染铅剂量的增加而降低,尤其是高铅组与对照组及低铅组相比,差异有统计学意义(P0.05)。结论低、中、高浓度醋酸铅(50、100、200μg/ml)作用皮层神经元12h后细胞存活都明显低于正常对照组,并呈剂量和时间依赖关系。     

与盆底韧带成纤维细胞间接共培养对大鼠骨髓间充质干细胞弹性蛋白、LOX及Fibulin-5mRNA表达的影响

目的:研究与盆底韧带成纤维细胞间接共培养对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化的影响,探索在体外条件下诱导BMSCs向韧带成纤维细胞分化微环境的创建并检测诱导分化细胞内弹性蛋白、LOX、Fibulin-5的表达。方法:选择7天SD大鼠,利用密度梯度离心法体外分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞并对其进行鉴定;取大鼠盆底韧带组织,自行分离传代,获得大鼠盆底韧带成纤维细胞;取纯化的第四代盆底韧带成纤维细胞与纯化培养后的第四代骨髓间充质干细胞间接共培养;实时定量RT-PCR检测弹性蛋白、LOX及Fibulin-5在不同共培养天数BMSCs中mRNA的表达情况。结果:与相应天数阴性对照组相比,3天共培养组弹性蛋白、LOX、Fbulin-5 mRNA的表达量增加,但均无显著变化(P>0.05),6、12天共培养组mRNA的表达量均显著增高(P<0.05);与3天对照组相比,6天对照组和12天对照组的表达量均无显著变化(P>0.05);与3天共培养组相比,6天共培养组的表达量增高,但差异无统计学意义(P>0.05),12天共培养组的表达量均有显著增高(P<0.05)。结论:与盆底韧带成纤维细胞间接共培养可以促进BMSCs弹性蛋白、LOX、Fbulin-5mRNA的表达,这一结果为BMSCs作为韧带组织工程的种子细胞在体外诱导分化条件的探索提供了一条新的研究思路。     

骨髓间充质干细胞移植对大鼠心梗后血清E-selection的影响

目的:探讨骨髓间充质干细胞心肌移植对大鼠心梗后血清E-selection(E-选择素)的影响,推测干细胞移植的安全性。方法:取大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养、增殖和标记,同时结扎左前降支建立建立心梗模型。2周后分别将2×106个细胞悬液和无血清培养基注入实验组和对照组心梗区数个不同部位。另取5只大鼠作为正常组,仅行两次开胸手术。分别于移植后2周、4周检测外周血中E-selection含量,从而探讨干细胞移植对内皮功能的影响。结果:骨髓间充质干细胞心肌移植后2周,心梗模型组E-selection含量为(36.04±14.47)ng/ml,与正常对照比较差异有统计学意义(P<0.01),骨髓干细胞移植组含量为(24.29±8.51)ng/ml,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05),细胞培养基组E-selection含量无明显变化(P>0.05)。造模后4周,心梗模型组E-selection含量为(33.02±17.78)ng/ml,虽有所降低,但与正常对照比较差异仍显著(P<0.01),骨髓干细胞组移植组E-selection含量为(17.45±7.22)ng/ml,与心梗模型组比较差异显著(P<0.01),细胞培养基组E-selection含量仍无明显变化(P>0.05)。结论:骨髓间充质干细胞于移植后2周和4周E-selection含量均较心梗组有下降趋势,提示骨髓间充质干细胞移植可能不会造成内皮功能损伤,相反可能会带来有益影响。     

牛磺酸对染铅大鼠骨髓生化指标的影响

目的　探讨牛磺酸 (Tau)对染铅大鼠骨髓中一氧化氮 (NO)、谷氨酸 (Glu)信号分子等指标的影响。方法　将Wistar大鼠随机分为 2组 ,空白对照组和铅染毒组〔6 0mg/ (kg·d)〕的醋酸铅灌胃 ,然后将已染铅大鼠随机分为 4组 ,即铅对照组、3个牛磺酸治疗组〔2 0 0 ,4 0 0 ,80 0mg/ (kg·d)〕。Tau治疗 80d后处死动物 ,测定血铅和骨髓中NO、一氧化氮合酶 (NOS)、Glu、钙含量、巯基 ( SH)指标水平。结果　 (1 )各Tau治疗组大鼠血铅水平均低于铅对照组 ,差异有统计学意义 (P <0 0 5或P <0 0 1 )。 (2 )Tau 80 0mg组大鼠骨髓NO含量、总NOS活动、iNOS活力、巯基含量及Tau 4 0 0mg组Glu含量与铅对照组比较 ,差异有统计学意义 (P <0 0 5 )。结论　Tau能够调节铅暴露大鼠骨髓中信号分子NO、Glu的水平 ,能够拮抗铅的骨髓毒性。     

TRAIL净化自体造血干细胞移植物中白血病细胞的实验研究

目的探讨TRAIL作为自体造血干细胞移植物体外净化剂的可行性。方法常规分离骨髓单个核细胞，分别以PE—DcR1、PE—DcR2荧光染色，荧光显微镜观察观察TRAIL诱骗受体DcR1和DcR2在骨髓单个核细胞的表达及定位。200ng／ml的TRAIL作用骨髓单个核细胞、白血病Jurkat细胞系18h，FITC-Annexin V／PI标记流式细胞仪定量凋亡率，并将经上述处理的骨髓单个核细胞行成纤维细胞集落（CFU—F）培养。将绿色荧光蛋白标记的Jurkat细胞和骨髓单个核细胞混合经200ng／ml TRAIL作用24h，在GM—CSF和EPO作用下行集落培养，第7天计数Jurkat细胞所形成的荧光集落及骨髓单个核细胞所形成的非荧光集落数CFU—GM和BFU—E。结果TRAIL诱骗受体DcR1和DcR2在骨髓单个核细胞均有表达，且主要定位于胞浆和胞膜。200ng／mlTRAIL作用18h，骨髓单个核细胞、Jurkat细胞系凋亡率分别为（5．95±1．23）％、（33．42±2．28）％，2组间差异有统计学意义（P〈0.01）。TRAIL组每4×10^6个骨髓单个核细胞形成CFU—F集落数为235．67±33．56，与对照组249．33±42．72比较差异无统计学意义（P〉0．05）。200ng／mlTRAIL明显抑制Jurkat细胞所形成荧光集落，但基本不影响骨髓单个核细胞CFU—GM和BFU—E的形成。结论TRAIL能选择性地诱导Jurkat细胞凋亡，而对骨髓单个核细胞无明显毒性作用，可用于自体造血干细胞移植物体外净化。     

新型磷酸钙骨水泥与骨髓间充质干细胞的共培养研究

目的 探讨新型可注射磷酸钙骨水泥与骨髓间充质干细胞共培养的可行性,为组织工程化骨的构建提供科学依据。方法采用浸提法制备CPC浸提液,加入到人骨髓间充质干细胞的培养体系中。MTT法测定细胞相对增殖率,进行细胞毒性反应分级：流式细胞仪检测CPC浸提液培养的hBMSCs的细胞周期。将新型磷酸钙骨水泥在不同凝结时间分别加入到BMSC浓度为1×10^7／L的6孔培养板中,逐日观察材料边缘细胞贴壁生长情况,培养一周后扫描电镜观察;取第三代BMSC,将密度调至1×10^7／L加入到12孔培养板,注入糊状磷酸钙骨水泥（成团期）,分别于培养1天、3天、5天、1周终止培养进行扫描电镜观察。结果新型磷酸钙骨水泥的细胞毒性反应为0～Ⅰ级,基本无毒性。光镜下见细胞在大部分组的CPC材料边缘生长良好,未见细胞变形、坏死;扫描电镜观察见大量细胞紧贴材料生长,细胞生长良好,细胞呈不规则的多角形、近圆形,在骨水泥表面与其他细胞相连融合成片。结论新型可注射性磷酸钙骨水泥具有良好的生物相容性．骨髓间充质干细胞能够在常规培养体系中与新型可注射可降解磷酸钙骨水泥共培养。     

新型磷酸钙骨水泥与骨髓间充质干细胞的共培养研究

目的探讨新型可注射磷酸钙骨水泥与骨髓间充质干细胞共培养的可行性,为组织工程化骨的构建提供科学依据。方法采用浸提法制备CPC浸提液,加入到人骨髓间充质干细胞的培养体系中,MTT法测定细胞相对增殖率,进行细胞毒性反应分级;流式细胞仪检测CPC浸提液培养的hBMSCs的细胞周期。将新型磷酸钙骨水泥在不同凝结时间分别加入到BMSC浓度为1×107/L的6孔培养板中,逐日观察材料边缘细胞贴壁生长情况,培养一周后扫描电镜观察;取第三代BMSC,将密度调至1×107/L加入到12孔培养板,注入糊状磷酸钙骨水泥(成团期),分别于培养1天、3天、5天、1周终止培养进行扫描电镜观察。结果新型磷酸钙骨水泥的细胞毒性反应为0～Ⅰ级,基本无毒性。光镜下见细胞在大部分组的CPC材料边缘生长良好,未见细胞变形、坏死;扫描电镜观察见大量细胞紧贴材料生长,细胞生长良好,细胞呈不规则的多角形、近圆形,在骨水泥表面与其他细胞相连融合成片。结论新型可注射性磷酸钙骨水泥具有良好的生物相容性,骨髓间充质干细胞能够在常规培养体系中与新型可注射可降解磷酸钙骨水泥共培养。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外生长增殖特点的实验研究

目的 了解应用全骨髓贴壁法分离的大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的生长、增殖特点,以及接种密度、培养时间对细胞增殖的影响,为预防和治疗机体退行性疾病等提供多潜能的种子细胞.方法 通过全骨髓贴壁法分离SD大鼠BMSCs,在体外条件下培养,应用倒置显微镜观察细胞形态学特征及流式细胞仪鉴定、检测大鼠BMSCs表面标志抗原,并通过分析对接种于96孔板不同接种密度(2×103、5×103、1×104个细胞/ml)连续培养10 d细胞生长曲线的特点,研究接种密度和培养时间对BMSCs生长、增殖的影响.结果 流式细胞仪分析CD29细胞阳性率为97.68%(7607/7788),CD34、CD45细胞阳性率分别为7.93%(661/8340)、2.76%(215/7788),符合BMSCs表面标记物表达特征.通过换液及消化传代,3代以上的BMSCs较为均一纯化,呈典型的旋涡或放射状生长,约传代至7～10代时出现细胞衰老并衰老细胞逐渐增多;中等密度(5×103个细胞/ml)接种细胞的生长曲线呈较典型的S形曲线.第1、2天为潜伏期;第3～5天为对数生长期;第6天细胞数目进入平台期;第8～10天细胞数量稍有下降.结论 全骨髓贴壁法是获得BMSCs较为简便有效的方法,且中等量接种密度更有利于细胞增殖,可获得更多的种子细胞.     

Transplantation of dermal multipotent cells promotes the hematopoietic recovery in sublethally irradiated rats

Our previous study indicated that dermal multipotent cells with the differentiation capacity to form cells with the phenotypic properties of osteocytes, adipocytes, chondrocytes, and neurons in specific inducing media could be isolated from the enzymatically dissociated dermal cells of newborn rats by their adherence to culture dish plastic. We have also observed that the systemic transplantation of dermal multipotent cells could not repopulate the hematopoietic system in lethally irradiated rats. In this paper, we found that a transplantation of plastic-adherent dermal multipotent cells into sublethally irradiated rats led to a significant increase of white blood cells in peripheral blood, nucleated cells, CFU-GM, and CFU-F colonies in bone marrow. FISH analysis, using a Y-chromosome specific probe, showed that dermal multipotent cells could engraft into bone marrow in recipients. Flow cytometry (FACS) analysis also showed that the proportion of CD2 and CD25 positive lymphocytes in peripheral blood did not change significantly in two weeks after transplantation. By these results, we infer that dermal multipotent cells may represent an alternative origin of mesenchymal stem cells to restore marrow microenvironment and promote the survival, engraftment, and proliferation of hematopoietic cells.     

bFGF联合骨髓干细胞动员剂促进大鼠缺血后肢血管新生的分析

目的：了解bFGF联合骨髓干细胞动员剂促进大鼠缺血后肢血管新生的作用。方法：将48只大鼠的左侧股动脉与其分支切断,构建大鼠后肢缺血模型,并按随机数字表法分成四组,每组12只,其中A组将重组人bFGF蛋白注入大鼠缺血后肢肌内;B组将重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）注入大鼠皮下;C组大鼠予以bFGF联合rhG-CSF;D组予以均等的生理盐水。治疗持续4周后予以每组大鼠腹主动脉造影,进而观察大鼠侧支血管的具体形成状况,予以内收肌以及腓肠肌肌组织病理切片检查,借助图像分析系统,统计各组大鼠血管密度。行免疫组化检测,分析大鼠血管内皮生长因子阳性表述血管数。结果：在大鼠侧支循环血管条数、血管内皮生长因子阳性表述血管数以及血管密度上,C组〉A组〉B组〉D组,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论：对于促大鼠缺血后肢血管新生而言,bFGF蛋白与骨髓干细胞动员剂疗效显著,均可改善大鼠肢体的缺血状态,但骨髓干细胞动员剂联合bFGF蛋白改善大鼠缺血肢体更为明显。     

骨髓间充质干细胞移植在肺气肿大鼠模型肺组织内定植研究

目的：观察骨髓间充质干细胞移植在肺气肿大鼠模型肺组织内的定植情况。方法：选择健康SD大鼠34只,按随机数字表法分为MSCs干预组（A组,10只,慢阻肺大鼠,尾静脉输注MSC 1×106个/mL）,肺气肿模型组（B组,10只,慢阻肺大鼠,尾静脉输注等体积PBS）及MSC对照组（C组,10只,正常大鼠,尾静脉输注MSCs 1×106个/mL）,正常对照组（D组,4只,正常大鼠,尾静脉输注等体积PBS）,采用烟熏法复制大鼠肺气肿模型。全骨髓培养法体外培养扩增雄性SD大鼠来源的MSCs,经GFP标记细胞后将其经尾静脉注入肺气肿模型SD大鼠体内,24 h内处死大鼠,取肺组织迅速冰冻切片,共聚焦激光显微镜下观察观察转染GPF的间充质干细胞在大鼠肺内定植情况。结果：成功培养具有分化潜能的骨髓间充质干细胞,MSCs传至第4代时有99.5%表达CD44、99.6%表达CD29等间充质干细胞表面标志,仅有0.4%表达CD34、1.0%表达CD45单核细胞以及造血干细胞表型;成功复制大鼠肺气肿模型,香烟烟雾暴露组（A、B组）平均肺泡间隔为（119.0±26.2）μm,高于对照组（C、D组）的（89.8±17.3）μm,差异有统计学意义（P〈0.05）;平均肺泡数为（173.9±68.3）个/mm2低于对照组的（280.3±104.0）个/mm2,差异有统计学意义（P〈0.05）;显微共聚焦发现MSCs经尾静脉注入大鼠体内24 h后可见A组大鼠肺组织内转染绿色荧光蛋白质粒的MSCs,而B组、C组及D组均未见转染荧光。结论：骨髓间充质干细胞经尾静脉输注入后可在肺气肿模型大鼠肺内定植,为MSCs治疗慢阻肺可能提供理论依据。     

骨髓间充质干细胞治疗脑出血的临床观察

[目的]观察通过自体骨髓间充质干细胞移植治疗脑出血的近期临床疗效. [方法]选取神经内科收治住院治疗的280例脑出血患者作为治疗组,行手术血肿清除术后,通过腰椎穿刺蛛网膜下腔注射自体骨髓间充质干细胞悬液3.5ml.选择同期入院300例患者作为对照组.分别于移植前后6个月进行神经功能缺损程度评定(NIHSS评分)和日常生活活动能力评定(Barthel指数),行颅脑MRI、血生化指标,监测干细胞移植的安全性. [结果]治疗组移植6个月后与对照组及移植前比较,NIHSS评分均有显著降低(P＜0.01),Barthel指数均有显著升高(P＜0.01).移植后6个月随访,颅脑MRI及血生化指标均未出现明显异常.[结论]自体骨髓间充质干细胞移植治疗脑出血是安全可行的,且在近期内疗效确定,远期疗效尚待进一步观察.     

骨髓间充质干细胞移植降低缺血-再灌注肠黏膜通透性的实验研究

目的:观察骨髓间充质干细胞移植对缺血-再灌注损伤的肠黏膜通透性变化的影响。方法:体外分离、培养和扩增雄性SD大鼠骨髓间充质干细胞,将雌性SD大鼠随机分为三组,A组为假手术组,仅行剖腹,不夹闭肠系膜上动脉;B组大鼠行肠系膜上动脉夹闭45min后开放,取培养至第三代的骨髓间充质干细胞直接肠黏膜下注射移植;C组大鼠夹闭肠系膜上动脉45min后开放,黏膜下注射等量的等渗盐水。术后第3和第6天行乳果糖/甘露醇(L/M)灌胃,6h后收集尿液测定尿L/M比值。取回肠组织行Y染色体原位杂交检测供鼠来源的细胞。测定血浆D-乳酸水平。结果:移植的骨髓间充质干细胞能向缺血-再灌注损伤的肠黏膜归巢,细胞移植的大鼠肠黏膜通透性较C组明显降低(P0.05)。结论:骨髓间充质干细胞移植可抑制缺血-再灌注损伤后肠黏膜通透性的升高,维护肠黏膜机械屏障的完整性。