细胞周期素D1反义脱氧寡核苷酸对A549细胞增殖及凋亡的调控作用

提要:目的探讨脂质体转染细胞周期素D1(cyclinD1)反义脱氧寡核苷酸链(antisenseoligodeoxynucleotide,ASON)对A549细胞增殖及细胞周期的影响。方法采用脂质体转染技术将cyclinD1ASON转入A549细胞培养,用MTT法检测细胞生长状况,应用流式细胞术(FACS)、检测细胞DNA梯形带等方法观察细胞凋亡及RT PCR法检测cyclinD1蛋白的表达。结果脂质体转染cyclinD1ASON组和单纯cyclinD1ASON组的A549细胞存活率较对照组显著降低(P<0.01)。脂质体转染cyclinD1ASON组cyclinD1表达水平(32%)较对照组(83%)明显减低(P<0.01),并能检测出DNA断裂。结论脂质体转染cyclinD1ASON能在体外明显抑制肺腺癌细胞的生长,且有诱导细胞凋亡、抑制细胞内cyclin D1合成的作用,可能会成为基因治疗的一个新靶点。     

基质溶解素及其反义寡核苷酸对肺腺癌A549细胞增殖的作用

目的 探讨重组基质溶解素 (recombinant matrilysin, rMMP-7)和脂质体-MMP-7反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide of matrilysin by liposome transfection, LIPO- MAON)对肺腺癌A549细胞和人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)增殖的影响.方法 ①构建MMP-7的反义寡核苷酸.②MTT法检测rMMP-7和LIPO-MOAN作用下A549和HUVEC的增殖状况.③RT-PCR法检测rMMP-7 和LIPO-MAON作用下腺癌A549细胞和HUVEC MMP-7 mRNA的表达.结果 0.75、1.0 μg/ml rMMP-7对HUVEC增殖有促进作用,各种浓度的LIPO-MAON无作用;对A549细胞的增殖,0.5、0.75、1.0 μg/ml的rMMP-7均有促进作用;而高浓度(7.5、10 nmol/ml)的 LIPO-MAON对A549细胞增殖有明显抑制作用.RT-PCR检测结果表明,HUVEC不表达MMP-7 mRNA;rMMP-7能增加A549细胞MMP-7 mRNA的表达,LIPO-MAON 可降低其MMP-7 mRNA的表达(P＜0.05).结论 在本试验浓度范围内高浓度的MMP-7能促进正常血管内皮细胞和肺腺癌细胞的增殖,其反义寡核苷酸不能抑制正常血管内皮细胞增殖,但高浓度的反义寡核苷酸能抑制肺腺癌细胞的增殖.     

Bcl-xl反义寡核苷酸转染对肺腺癌A549细胞增殖及凋亡的影响

目的研究Bcl-xl反义寡核苷酸(ASODN)对肺腺癌A549细胞增殖及凋亡的影响。方法将肺腺癌A549细胞分为细胞对照组(无脂质体及核酸)、脂质体(Lip)组(空脂质体,无核酸)、序列对照寡核苷酸(SCODN)组和ASODN组,设计合成特异性靶向Bcl-xl ASODN,用阳离子脂质体介导其转染肺腺癌A549细胞株。采用细胞计数试剂盒(CCK8)法检测A549细胞增殖抑制率;末端脱氧核苷酰基转移酶介导性d UTP切口末端标记(TUNEL)法检测A549细胞凋亡情况;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测A549细胞中Bcl-xlm RNA和蛋白表达水平。结果 ASODN和SCODN浓度为50 nmol·L~(-1)时,各组A549细胞增殖抑制率比较差异均无统计学意义(P>0.05);浓度为100、200、400 nmol·L~(-1)时,ASODN组A549细胞增殖抑制率均高于SCODN组和Lip组(P<0.05);ASODN对细胞增殖抑制作用随其浓度增加而增高,具有剂量依赖性(P<0.05)。细胞对照组、Lip组、SCODN组和ASODN组细胞凋亡率分别为(4.01±0.18)%、(5.23±0.22)%、(8.01±0.32)%和(41.50±1.91)%,ASODN组细胞凋亡率高于SCODN组、Lip组和细胞对照组(P<0.05)。ASODN和SCODN浓度为50 nmol·L~(-1)时,各组A549细胞中Bcl-xl mRNA表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05);浓度为100、200、400 nmol·L~(-1)时,ASODN组A549细胞中Bcl-xl mRNA表达量均低于SCODN组、Lip组和细胞对照组(P<0.05);ASODN组A549细胞中Bcl-xl mRNA表达量随浓度增加相应地下降(P<0.05);SCODN组和Lip组Bcl-xl mRNA表达量较细胞对照组下降,但差异均无统计学意义(P>0.05)。细胞对照组、Lip组、SCODN组和ASODN组A549细胞中Bcl-xl蛋白表达量分别为0.62±0.17、0.67±0.27、0.62±0.21和0.23±0.10,ASODN组A549细胞中Bcl-xl蛋白表达量低于细胞对照组、Lip组和SCODN组(P<0.05)。结论转染Bcl-xl ASODN可下调Bcl-xl基因表达,能有效抑制A549细胞增殖,并显著促进A549细胞凋亡;Bcl-xl基因有望成为肺腺癌基因治疗的新靶点。     

Livin反义寡核苷酸对肺腺癌A549细胞增殖的影响

目的：探讨Livin基因反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides,ASODN）对肺腺癌A549细胞增殖的影响。方法：用阳离子脂质体介导Livin ASODN转染至A549细胞,反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测Livin基因mRNA的表达;MTT法检测转染细胞的生长抑制情况。结果：转染ASODN后A549细胞的Livin基因mRNA的表达明显减少,Livin基因ASODN显著抑制A549细胞增殖,并呈剂量依赖性,与对照的错义寡核苷酸（missense oligodeoxynucleotides,MSODN）比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：Livin反义寡核苷酸能明显抑制A549细胞Livin基因mRNA的表达,抑制细胞增殖,Livin基因有望成为肺癌基因治疗的新靶点。     

细胞周期素D1shRNA表达载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的 构建针对细胞周期素D1(cyclinD1,由CCND1基因编码)的shRNA表达载体,筛选出有效序列,观察其对肺腺癌A549细胞增殖的影响.方法 设计针对cyclin D1基因编码区的3条寡核苷酸链,体外退火后克隆入干扰栽体Pgenesil-1中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定.以脂质体法将空载体Pgenesil-1-K和3个重组质粒Pgenesil-1-CCND11、Pgenesil-1-CCND12、Pgenesil-1-CCND13分别导人549肺腺癌细胞,48 h后用Real time PCK和Western blotting技术检测各实验组肺腺癌细胞内cycli D1 mRNA及蛋白的表达情况,用流式细胞仪检测细胞周期观察构建的载体对A549细胞增殖的影响.结果 经酶切鉴定及DNA测序,重组质粒中已插入了目的 基因片断.转染cyclin D1-shRNA的A549细胞48 h后测定cyclin D1 mRNA和蛋白含量.以Pgenesil-1-CCND13抑制cyclin D1 mRNA及蛋白表达效果最为有效.其抑制率分别为62%和60%,而且它能抑制A549细胞的增殖.结论 成功构建了针对cyclin D1的RNA干扰表达载体Pgenesil-1-CCND11、Pgenesil-1-CCND12、Pgenesil-1-CCND13,Pgenesil-1-CCND13能有效抑制cyclin D1在A549细胞中的表达,并抑制A549的增殖,为进一步应用于肺腺癌的治疗实验研究奠定了基础.     

反义细胞周期素D1基因对肝癌细胞的作用

目的研究反义基因封闭技术体外抑制细胞周期素D1（cyclin D1）表达后对肝癌细胞增殖的影响。方法肝癌HepG2细胞被转染表达cyclinD1反义互补脱氧核苷酸（AScDNA）的质粒后，观察其cyclinD1表达及体外增殖活性的改变。结果cyclinD1反义cDNA可特异性地抑制肝癌细胞，cyclinD1蛋白的表达。从而调控细胞周期，抑制肝癌细胞增殖。结论利用cyclin D1反义cDNA进行细胞周期干预对肝癌的治疗具有潜在的意义。     

Anti-miR-155反义寡核苷酸对肺腺癌A549细胞增殖的影响

目的观察anti-miR-155反义寡核苷酸（AMOs）对肺腺癌A549细胞增殖的影响。方法 A549细胞分为对照组和AMOs处理组，采用AMOs抑制A549细胞内miR-155的活性，液闪计数仪测定[3^H]-TdR掺入量，MTT法测定细胞增殖抑制率，流式细胞仪测定细胞周期。结果与对照组相比，AMOs显著减少A549细胞[3^H]-TdR掺入量，随着浓度从10nmol/L逐渐增加至100nmol/L，A549细胞[3^H]-TdR掺入量亦随之减少。MTT法测定细胞增殖抑制率结果显示，与对照组相比，AMOs显著抑制A549细胞的增殖。流式细胞术检测结果显示AMOs使G0/G1细胞比例显著增加，G2/M期细胞比例显著减少。结论采用AMOs抑制A549细胞内高水平表达miR-155的活性后，可显著抑制A549细胞的增殖。     

锂对A549细胞增殖及细胞周期的影响

目的探讨氯化锂（lithium chloride，LiCl）对人肺泡Ⅱ型上皮细胞来源的A549细胞在细胞增殖和细胞周期方面的影响。方法以不同浓度的LiCl作用A549细胞24h后，采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）检测各组细胞的增殖活性；利用流式细胞术进行细胞周期分析；免疫细胞荧光技术检测糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase3β，GSK3β）在各组细胞中的表达；并通过Western blot检测LiCl对GSK3β、磷酸化GSK3β（p—GSK3β）及CyclinD1蛋白质表达水平的影响。结果LiCl能提高A549细胞的增殖活性。且随着LiCl浓度的升高，处于G1期的细胞数量减少，而S期细胞数量增多，与正常对照组相比，差异具统计学意义（10mmol／L组：P〈0．05；20mmol／L组：P〈0．01）。LiCl能使GSK3β表达降低而无酶活性的p-GSK3β表达升高；同时上调CyclinD1的表达水平。结论LiCl能加快A549细胞的G1／S期转换并促进增殖，GSK3β的活性受抑从而减少Cyclin D1的降解是其可能的机制。     

肺癌组织MMP-7表达及其反义寡核苷酸对肺腺癌A549细胞增殖的作用

目的 检测非小细胞肺癌患者基质溶解素（matrilysin,MMP-7）的表达,探讨重组基质溶解素（rMMP-7）和脂质体-MMP-7反义寡核苷酸（antisense oligonucleotde of matrilysin by liposome transfection,LIPO-MAON）对肺腺癌A549细胞和人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）增殖的影响。方法 ①免疫组化法检测NSCLC患者癌组织MMP-7表达;②MMT法和半定量RT-PCR法检测rMMP-7和LIPO-MOAN作用下A549和HUVEC的增殖及MMP-7-mRNA表达。结果 57例肺癌组织47例MMP-7表达为阳性,阳性表达率为82．5％,与正常对照组相比P〈0．01。rMMP-7能促进肺腺癌A549细胞的增殖,LIPO-MAON对AM9细胞增殖则有明显抑制作用。对HUVEC增殖,仅高浓度的rMMP-7（0．75、1．0μg／ml）有促进作用,而LIPO—MAON对其增殖无抑制作用。RT-PCR结果表明,HUVEC不表达MMP-7-mRNA;rMMP-7能增加A549细胞MMP-7-mRNA的表达,LIPO-MAON可降低其表达（P〈0．05）。结论 非小细胞肺癌患者MMP-7表达阳性率为82．5％,MMP-7反义寡核苷酸能抑制肺腺癌细胞的增殖及MMP-7-mRNA表达,对正常血管内皮细胞增殖无抑制作用。MMP-7能促进肺腺癌细胞增殖。     

生存素反义寡核苷酸对人胃癌细胞增殖的抑制作用

目的 探讨生存素（survivin）反义寡核苷酸（ASODN）对人胃癌细胞SGC7901增殖的抑制作用。方法 设计合成特异性靶向生存素的反义寡核苷酸。胃癌细胞株SGC7901分为4组：空白对照组、单纯脂质体对照组、正义链转染对照组、ASODN转染组。作用48h后收获各组细胞。Westernblot法检测各组细胞生存素表达情况，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，MTT法检测各组细胞的生长抑制率。结果 脂质体介导生存素反义寡核苷酸转染后的胃癌细胞出现生存素蛋白表达明显下降；ASODN转染组细胞凋亡率明显高于各对照组（P〈0．05），而各对照组问差异无显著性（P〉0．05）；ASODN转染组细胞的抑制率明显高于各对照组（P〈0．05），而各对照组问差异无显著性（P〉0．05）。结论 生存素反义寡核苷酸转染胃癌细胞能下凋生存素蛋白表达，诱导胃癌细胞凋亡，抑制细胞增殖，具有明显的抗癌作用。     

Survivin反义核酸影响A549肺癌细胞增殖和凋亡的研究

目的 研究Survivin反义寡核苷酸对A549细胞增殖和凋亡的影响.方法 针对Survivin mRNA序列设计了反义寡核甘酸,转染A549细胞,PT-PCR检测细胞中survivin基因的mRNA含量;Western印迹显示Survivin蛋白水平;以MTT法检测细胞增殖,TUNEL法检测细胞凋亡.结果 Survivin反义寡核苷酸可明显降低A549细胞中survivin的mRNA和蛋白水平.MTT比色法结果说明人Survivin反义寡核苷酸抑制A549细胞增殖,抑制率远高于无义寡核苷酸组和空白对照组.TUNEL法检测结果显示,反义寡核苷酸还显著增强A549细胞对抗肿瘤药高三尖杉酯碱的敏感性,在较低高三尖杉酯碱浓度下,反义寡核苷酸转染细胞的凋亡率明显高于其它对照组.结论 sur-vivin反义寡核苷酸有望应用于肿瘤的辅助治疗之中.     

细胞周期素A在肾癌细胞增殖中的作用

目的研究细胞周期素A在肾癌组织中的表达及其在肾癌细胞增殖中的作用.方法应用免疫组化SABC法检测肾癌及正常肾组织中细胞周期素A及Ki--67基因的表达,运用统计学方法分析其差异,并通过Ki-67表达指数评价细胞周期素A在肾癌细胞增殖中的作用.结果细胞周期素A在肾癌及正常肾组织中的阳性表达率分别为12.12%和5.09%(P＜0.01).在肾癌组织中,病理分级较高、术后生存时间＜5年者呈高表达(P＜0.01),不同临床分期及有(无)局部淋巴结转移的肿瘤之间表达无显著差异(P＞0.05).Ki-67指数较高者,细胞周期素A呈高表达(P＜0.01),细胞周期素A阳性表达率与Ki-67指数显著相关(r=0.757,P＜0.01).结论细胞周期素A可能参与肾癌的恶性转化,但与肿瘤的临床进展过程无关.检测细胞周期素A的水平可反映肾癌细胞的增殖活性,并可作为肾癌预后估计的参考指标.     

韧粘素反义寡核苷酸对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的探讨韧粘素 (TN)反义寡核苷酸 (ODN)对培养大鼠血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖的抑制作用。方法采用细胞计数及快速竞争性逆转录聚合酶链反应 (RT -PCR)等方法 ,观察不同剂量 ( 5、10、2 0 μg/ml)TN反义ODN和正义ODN对体外培养大鼠VSMC的增殖以及TNmRNA表达水平的影响。　结果TN反义ODN可有效抑制大鼠血管平滑肌细胞的增殖 ,作用呈剂量依赖性 (反义组 5、10、2 0 μg/ml剂量细胞计数分别为 10 5/ml× ( 4 .99± 0 .2 1)、( 4 .0 8± 0 .14 )、( 2 .85± 0 .39) ,对照组为 10 5/ml× ( 5 .95± 0 .41) ,(P <0 .0 5 ) ;TN反义ODN亦可下调TNmRNA表达水平 (反义组 0 .32± 0 .0 5 ,对照组为 0 .5 2± 0 .0 8;P <0 .0 1) ;而TN正义ODN则无上述作用。　结论TN反义ODN可能通过下调TNmRNA表达水平而抑制血管平滑肌细胞的增殖。     

韧粘素反义寡核苷酸对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的探讨韧粘素(TN)反义寡核苷酸(ODN)对培养大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的抑制作用. 方法采用细胞计数及快速竞争性逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)等方法,观察不同剂量(5、10、20μg/ml)TN反义ODN和正义ODN对体外培养大鼠VSMC的增殖以及TNmRNA表达水平的影响. 结果TN反义ODN可有效抑制大鼠血管平滑肌细胞的增殖,作用呈剂量依赖性(反义组5、10、20μg/ml剂量细胞计数分别为105/ml×(4.99± 0.21)、(4.08±0.14)、(2.85±0.39),对照组为105/ml×(5.95±0.41),(P＜0.05);TN反义ODN亦可下调TN mRNA表达水平(反义组0.32±0.05,对照组为0.52±0.08;P＜0.01);而TN正义ODN则无上述作用. 结论TN反义ODN可能通过下调TNmRNA表达水平而抑制血管平滑肌细胞的增殖.     

脂质体介导hTERT反义寡核苷酸对HL60细胞增殖及凋亡的影响

目的 研究经脂质体介导转染端粒酶逆转录酶(hTERT)反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞增殖、凋亡的影响.方法 运用四唑盐比色(MTT)法检测HL-60细胞的增殖、Annexin VFITC/PI双标记法细胞早期凋亡流式检测法检测HL-60细胞的凋亡.结果 hTERT ASODN组(终浓度10 μmol/L)、脂质体介导hTERT ASODN组(终浓度0.5 μmol/L)均能抑制HL60细胞增殖,诱导HL-60细胞凋亡,两组比较差异无显著性.各ASODN组对HL-60的抑制作用及诱导凋亡作用均弱于阿糖胞苷(终浓度10 μmol/L)(P<0.01).结论 脂质体的介导增强了hTERT AS0DN抑制HL-60细胞增殖及诱导凋亡的作用效果.脂质体介导hTERT ASODN有可能成为化疗外治疗急性白血病的有益补充.     

热休克蛋白70反义寡核苷酸对肝癌细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨热休克蛋白70反义寡核苷酸(HSP70 ASODN)对肝癌细胞增殖、凋亡的影响及其可能机制.方法 合成特异性靶向HSP70 ASODN,并将其转染SMMC-7721细胞;四甲基噻唑蓝(MTT)法检测HSP70 ASODN对SMMC-7721细胞增殖的影响,计算生长抑制率;荧光显微镜观察细胞凋亡形态;流式细胞仪分析细胞周期分布,计算细胞增殖指数;免疫细胞化学观察细胞内HSP70、Bcl-2、Bax的表达.结果 ASODN组细胞生长抑制率明显高于正义寡核苷酸(NSODN)组、转染试剂对照组及空白对照组(P＜0.05);形态学观察到典型瘤细胞凋亡特征;流式细胞仪分析证实HSP70 ASODN主要阻止瘤细胞进入S期,细胞增殖指数下降,出现明显的凋亡峰;免疫细胞化学显示可降低细胞内HSP70、Bcl-2水平(P＜0.05),提升Bax水平(P＜0.05).结论 HSP70 ASODN可抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖,诱导细胞的凋亡,可能机制为中和了HSP70和细胞周期调节蛋白间的相互作用,导致细胞周期阻滞,打破了肿瘤细胞逃逸凋亡平衡,促使细胞发生凋亡.     

生存素反义寡核苷酸对人子宫内膜癌细胞增殖的抑制作用

 目的 探讨生存素（survivin）反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide,ASODN）对人子宫内膜癌细胞HEC-1B增殖的抑制作用。方法 实验分空白对照组（control组）、单纯脂质体对照组（Lip组）、正义链转染对照组（SODN组）、ASODN转染组（ASODN组）4组。人工合成正、反义寡核苷酸,经脂质体将survivin正、反义寡核苷酸转染入子宫内膜癌细胞48 h后收集各组细胞。免疫印迹（Western blot）法检测各组细胞生存素表达情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,四甲基偶氮唑蓝试验（MTT）法检测细胞生长抑制情况。结果 脂质体介导生存素反义寡核苷酸转染后的子宫内膜癌细胞出现生存素蛋白表达明显下降;ASODN转染组细胞凋亡率和增殖抑制率均明显高于各对照组（P<0.05）,而各对照组间差异无统计学意义（P>0.05）。结论 生存素反义寡核苷酸转染子宫内膜癌细胞能下调生存素蛋白表达,诱导子宫内膜癌细胞凋亡,抑制细胞增殖,对子宫内膜癌是一种有效的基因疗法。