糖尿病大鼠表皮干细胞的分离培养及特性

背景：表皮干细胞作为皮肤组织特异性干细胞,在创面修复中发挥关键作用。但有关糖尿病皮肤来源的表皮干细胞体外分离培养及生物特性研究较少。目的：探索糖尿病大鼠表皮干细胞体外分离培养的方法及其生物特性,为糖尿病难愈创面的防治及机制研究提供实验依据。方法：SD大鼠随机分成糖尿病组和正常对照组。糖尿病组采用一次性腹腔注射链脲佐菌素制备糖尿病大鼠模型,正常对照组不作处理。分别取成模糖尿病和正常大鼠背部全层皮肤,采用酶消化联合Ⅳ型胶原黏附法分离培养大鼠表皮干细胞。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化和细胞克隆形成,细胞计数绘制生长曲线,计算克隆形成率,免疫细胞化学染色和图像分析软件鉴定K19、β1-integrin阳性表达和测定阳性细胞的积分吸光度（IA）值。结果与结论：糖尿病组大鼠表皮干细胞原代贴壁数量较少,其克隆形成率明显低于正常对照组（P〈0.01）。表皮干细胞的K19、β1-integrin均呈阳性表达,糖尿病组阳性细胞的IA值均低于正常对照组（P〈0.01）。结果提示,运用酶消化联合Ⅳ型胶原黏附法可以实现糖尿病大鼠表皮干细胞的体外分离培养;糖尿病大鼠表皮干细胞体外增殖能力较正常皮肤增殖能力弱,这可能是导致糖尿病创面难愈合的重要因素之一。     

表皮干细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤促进创面愈合的实验研究

目的探讨表皮干细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤促进创面愈合的可行性。方法（1）用胰蛋白酶和EDTA联合消化法分离表皮,用Ⅳ型胶原快速黏附法分离、纯化人表皮干细胞,以含表皮生长因子、角质细胞无血清培养液等组成人表皮干细胞培养基进行体外培养,测定克隆形成率。（2）将培养人表皮干细胞接种于制备的脱细胞真皮支架中,构建组织工程人工皮肤,移植治疗兔全层皮肤缺损创面,观察创面修复效果。（3）取新西兰白兔常规制作背部全层皮肤缺损创面,随机分为4组：A、B、C组分别用含表皮干细胞的组织工程皮肤、含角质细胞的组织工程皮肤和单纯脱细胞真皮移植于皮肤缺损创面;D组用创面空置为对照。观察创面修复情况、局部炎症反应,并记录创面愈合时间。结果体外培养的人表皮干细胞增殖稳定,克隆形成率明显高于角质细胞对照组（P〈0．05）。移植后A组创面愈合良好,局部炎症反应轻微,无出血、积脓、坏死,创面愈合时间较B、C、D组明显缩短（P〈0．05或P〈0．01）。结论以表皮干细胞作为种子细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤可用于皮肤缺损创面的修复治疗。     

皮肤组织工程中表皮干细胞培养的实验研究

目的:通过表皮干细胞对基底膜的黏附性,利用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原作为递质,探索提取和培养表皮干细胞的技术方法。方法:取新生1～3d的Wistar大鼠全层皮肤,通过酶消化法获得幼鼠表皮,并制成单表皮细胞悬液。以层粘连蛋白和Ⅳ型胶原作为基底膜的替代物,利用表皮干细胞对基底膜的吸附性筛选表皮干细胞。结果:与角质细胞对照,表皮干细胞对层粘连蛋白和Ⅳ型胶原的吸附性很好,克隆形成率较高。用SABC法对其进行整合素β1单抗的免疫组化染色;广谱角蛋白单抗的免疫组化染色观察细胞克隆的细胞浆内出现棕黄色的阳性表达。结论:用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原快速黏附法可从大鼠皮肤分离和富集表皮干细胞。     

皮肤组织工程中表皮干细胞培养的实验研究

目的：通过表皮干细胞对基底膜的黏附性，利用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原作为递质，探索提取和培养表皮干细胞的技术方法。方法：取新生1～3d的Wistar大鼠全层皮肤，通过酶消化法获得幼鼠表皮，并制成单表皮细胞悬液。以层粘连蛋白和Ⅳ型胶原作为基底膜的替代物，利用表皮干细胞对基底膜的吸附性筛选表皮干细胞。结果：与角质细胞对照，表皮干细胞对层粘连蛋白和Ⅳ型胶原的吸附性很好，克隆形成率较高。用SABC法对其进行整合素β1单抗的免疫组化染色；广谱角蛋白单抗的免疫组化染色观察细胞克隆的细胞浆内出现棕黄色的阳性表达。结论：用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原快速黏附法可从大鼠皮肤分离和富集表皮干细胞。     

应用表皮干细胞构建组织工程皮肤及移植实验

目的:探讨应用人表皮干细胞和猪脱细胞真皮构建组织工程皮肤修复全层皮肤缺损的可行性。方法:实验于2004-06/2005-12在南昌大学医学院烧伤研究所完成。①取环状切除后幼儿包皮(家属知情同意)用中性蛋白酶与胰蛋白酶混合消化液消化,收集细胞,接种在已包被Ⅳ型胶原的培养皿中,快速黏附,保留快速黏附细胞继续培养,培养体系为低钙高糖DMEM培养基,待融和状态时,再次消化,离心收集细胞,再次经过Ⅳ型胶原快速黏附,保留黏附细胞,培养20d左右,用作构建表皮干细胞并进行细胞鉴定。②将第2代细胞接种于铺好Ⅳ型胶原的猪无细胞真皮上,每3天换液。10d后将其转移至不锈钢网架上,行气液界面培养5d左右,构建复合皮。③取SD大鼠20只,随机分2组。于动物背部尾侧正中作2.5cm×2.5cm的全层皮肤至肌筋膜的切除。实验组10只创面覆盖表皮干细胞构建的复合皮移植物,对照组10只覆盖无细胞真皮移植物。④移植后7,10,14,21和35d,两组动物均活检取材,进行创面大体观察、组织学观察及免疫组织化学、免疫荧光鉴定等。结果:①表皮干细胞的分离、扩增及鉴定:在扩增的细胞拟接种于无细胞真皮前,进行角蛋白19免疫组织化学鉴定、以流式细胞术进行α6、CD71鉴定。经胶原Ⅳ黏附的细胞培养后形成较大集落,拟接种的种子细胞中α6briCD71dim细胞占总细胞的(39±7)%;鼠抗人角蛋白19阳性细胞率为(53±6)%。②组织工程皮肤的建立结果:表皮干细胞种植于无细胞真皮上1d后,细胞便贴壁并开始生长增殖,8d左右透过间隙见无细胞真皮上表皮干细胞渐增殖融合成片;2周时无细胞真皮表面可见菲薄皮片状生长的细胞膜片物。复合皮组织学检查可见无细胞真皮表面覆盖多层融合的表皮层细胞,无细胞真皮内细胞成分去除完全。③创面愈合情况:术后2周,实验组移植物成活,创面上已上皮化,移植物柔软,而对照组无细胞真皮表面未上皮化,较干燥,色暗、触之较硬,两组创面均未见明显收缩。4周,实验组创面愈合,未见明显排斥反应。对照组无细胞真皮干燥脱落而创面暴露,创面收缩明显,创面边缘因自体表皮细胞爬行而缩小创面。④组织学检查及免疫组织化学染色结果:实验组2周时创面已全部上皮化,但细胞分层少;3,4周表皮层分化良好,多层结构,真皮纤维内见成纤维细胞长入,见少许炎症细胞,大鼠自体正常皮肤见毛囊及毛发结构。对照组2周创面尚未上皮化,无细胞真皮干燥变性,3,4周后创面仍未愈合,可见大量炎症细胞。实验组愈合创面抗人人类白细胞抗原-Ⅰ型抗原直接免疫荧光染色呈阳性,证明新生表皮由移植的人表皮细胞形成。而对照组阴性。实验组愈合创面广谱角蛋白免疫组织化学染色见整个表皮层细胞胞浆染呈棕黄,为阳性反应。结论:利用体外纯化扩增的表皮干细胞及制备的猪脱细胞真皮可体外联合构建具有复层结构的组织工程皮肤,该组织工程皮肤可用于修复动物全层皮肤缺损。     

羊膜负载表皮干细胞促进糖尿病大鼠创面的愈合

背景:表皮干细胞作为皮肤组织的特异性干细胞,具有强大增殖及多向分化潜能,与创面修复紧密相关.近期研究表明糖尿病皮肤创面愈合过程中表皮干细胞数量减少、活性降低是导致其创面难愈的重要原因.目的:观察表皮干细胞在糖尿病大鼠创面愈合中的作用.方法:分离培养及鉴定SD大鼠表皮干细胞,并以BrdU标记.建立糖尿病SD大鼠创面模型,抽签法随机分为3组:表皮干细胞组创面移植羊膜负载BrdU标记的表皮干细胞;羊膜组创面移植羊膜;空白对照组创面未给予干预. 观察创面愈合情况、计算创面愈合率,苏木精-伊红及免疫组织化学SP法检测创面愈合组织中BrdU及增殖细胞核抗原表达.用图像分析软件测量阳性细胞积分吸光度平均值.结果与结论:表皮干细胞组治疗后7d创面缩小明显,治疗后14 d创面基本愈合,创面愈合率明显高于羊膜组、空白对照组 (P < 0.01).表皮干细胞组创面及新生表皮中可见BrdU阳性细胞,而另两组皮肤创面组织中始终未见BrdU阳性细胞.各组创面组织中可见增殖细胞核抗原阳性细胞表达,但表皮干细胞组的阳性细胞积分吸光度平均值与羊膜组、空白对照组比较差异有显著性意义(P < 0.01).结果证实糖尿病大鼠创面愈合过程中表皮干细胞与创缘表皮移行、创面的上皮化有直接关联,可有效促进其创面愈合.     

Ⅳ型胶原快速黏附法体外分选人胎儿表皮干细胞

背景:发育生物学研究表明,表皮干细胞是皮肤及其附属器发生、修复、重建的关键性源泉,如何从皮肤组织中分离获得更多的表皮干细胞,并在体外培养过程中保持干细胞特性是其在皮肤组织工程中应用的重要前提。目的:观察Ⅳ型胶原快速黏附法分选的人胎儿表皮干细胞体外生长状态及克隆形成情况,并与角质细胞进行对照。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/06在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。材料:因创伤等原因致意外流产的妊娠24~26周龄胎儿皮肤标本,由南昌大学第一附属医院产科提供。Ⅳ型胶原为美国Sigma公司产品,角质细胞无血清培养基为美国Gibco公司产品。方法:将Ⅳ型胶原用磷酸盐缓冲液稀释成100mg/L,均匀涂被培养板后于超净工作台中风干备用。无菌条件下取胎儿皮肤标本,剪成3.0mm×5.0mm皮条片,4℃胰蛋白酶 EDTA联合消化8~10h,表皮真皮分离,用角质细胞无血清培养基将表皮反复吹打,获得单细胞悬液接种于预处理好的Ⅳ型胶原培养板,置37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中,20min后吸去培养液和未黏附细胞,加入含体积分数为0.1的胎牛血清、10μg/L表皮生长因子及角质细胞无血清培养基的表皮干细胞培养液,细胞约70%~80%融合后传代扩增;将未黏附细胞接种于另一培养板中,相同条件下作为角质细胞对照培养。主要观察指标:表皮干细胞的形态变化、免疫细胞化学染色鉴定结果及克隆形成率。结果:经贴壁筛选的表皮干细胞接种后呈圆形,折光性较强;1d后细胞略伸展为扁平的多角形,胞质近中央处有圆形核;3d时出现表皮干细胞克隆;5d时克隆数量明显增多,细胞之间紧密衔接,呈铺路石状;14d左右细胞基本融合。分离培养的人表皮干细胞克隆β1整合素、角蛋白19、p63均呈阳性表达。表皮干细胞克隆形成率明显高于角质细胞克隆形成率(t=1.972,P<0.05)。结论:采用Ⅳ型胶原快速黏附法成功筛选出纯度较高的人胎儿表皮干细胞,且呈明显克隆性生长,具有典型的干细胞生物学特性。     

体外分离、纯化人表皮于细胞促进皮肤的功能生理性修复

目的 表皮干细胞是皮肤发生、修复、重建的关键“种子细胞”，因而研究建立人表皮干细胞体外分离、培养及鉴定的方法非常重要。方法 通过本科消化法，分离小儿包皮的表皮与真皮层，表皮制成单细胞悬液，以高糖低钙的DMEM培养基，补充100ml/L的干细胞培养专用胎牛血清（FBS），0.05mmol/L氯化钙，10ng/ml表皮生长因子，1&;#215;10^-6mol/L氢化可的松进行培养，在实验之前用胶原Ⅳ包被直径35mm的培养皿，其中有些放置消毒盖坡片以制“细胞玻片”，置4℃冰箱中放置30min以上，吸干胶原Ⅳ，再将培养皿置室温下自然干燥半小时以上，备用。调整细胞含量为2&;#215;10^6/ml，接种于包被好胶原Ⅳ的培养皿中快速黏附10-15min（37℃），弃去未黏附细胞，保留快速黏附细胞继续培养。培养至21d对所培养细胞进行流式细胞仪α6、CD71表型鉴定，角蛋白19（K19）、角蛋白5（K5）免疫细胞化学染色鉴定以及形态学观察、克隆计数。结果 在胶原Ⅳ包被的细胞化学染色鉴定以及形态学观察、克隆计数。结果 在胶原Ⅳ包被的培养皿中快速贴壁细胞经继续培养，可见细胞克隆数增多，细胞传代次数达8-10次，培养时间达2个月。K19，K5免疫化学染色阳性，α6^briCD71^dim细胞占细胞总数的40%左右。结论 研究表明用胶原Ⅳ快速黏除法可从包皮分离和富集表皮干细胞，用此体外培养体系，可较好地扩增表皮干细胞。     

人表皮干细胞的体外分离和培养

背景：如何获得高纯度的表皮干细胞以及维持其干细胞表型和体外增殖特性，是目前表皮干细胞体外培养过程中急需解决的问题。目的：建立人表皮干细胞体外分离和培养的技术方法。设计、时间及地点：细胞观察，于2005-03／2006-05在南昌大学第一附属医院烧伤科完成。材料：所用包皮来自2～12岁行包皮环切术的患者，患者无泌尿系统感染等疾病。方法：取包皮皮片，采用DispaseⅡ酶和胰蛋白酶两步法分离出角朊细胞和成纤维细胞，Ⅳ型胶原快速黏附法富集分离表皮干细胞。收集处于指数生长期第二三代成纤维细胞的上清液，过滤后与角朊细胞无血清培养基等比例混合，并加入胎牛血清、表皮生长因子、牛垂体提取物等组成表皮干细胞培养液，用以人表皮干细胞的体外扩增培养，以角朊细胞作对照。主要观察指标：传至第2代，通过平板克隆形成实验计算克隆形成率和克隆维持时间，采用免疫组织化学染色检测β1整合素和角蛋白19的表达。结果：①与同一标本同一批次培养的角朊细胞相比，人表皮干细胞的克隆形成率明显升高，克隆维持时间延长（P〈0．01）。②表皮干细胞β1整合素及角蛋白19免疫组织化学染色均呈阳性。结论：应用Ⅳ型胶原快速黏附法及人成纤维细胞条件培养基，对人表皮干细胞成功进行了体外分离和培养。     

鼠表皮干细胞的稳定分选方法及其体外培养体系建立

背景:采用多种人工合成材料构建的组织工程皮肤,存在着创面愈合后不耐受摩擦、瘢痕增生及挛缩严重、缺乏皮肤附件等不足.而表皮干细胞尽管在体内可无限增殖分化以维持皮肤更新,但在体外普通培养条件下易发生终末分化.目的:为抉得稳定生长的鼠表皮干细胞,拟建立或完善能够调控其增殖分化的体外培养体系.设计、时间及地点:细胞观察,于2007-05/11在广州市创伤外科研究所完成.材料:清洁级1～3 d龄Wistar大鼠20只用于制备表皮于细胞.方法:采用两步酶消化法获得单个表皮细胞悬液,Ⅳ型胶原快速贴壁法分选贴壁细胞,加入含胎牛血清、0.05 mmol/L CaCl2以及表皮细胞生长因子、腺苷、胰岛素、氢化可的松、霍乱毒素等复合的DMEM培养基进行培养,原代分离细胞时胎牛血清体积分数为0.2以维持细胞活性,第2次换液时改为0.1.主要观察指标:光镜下观察细胞生长情况,免疫组化法检测目的细胞角蛋白19和P63整合素的表达,流式细胞仪检测β1整合素和CD71的表达,通过细胞周期及生长曲线观察其增殖能力.结果:①Ⅳ型胶原筛选的细胞在复合DMEM培养基中生长良好,细胞活性>98%,培养6 d后形成含100-200个细胞的大克隆,呈鹅卵石样铺满瓶底.②角蛋白19和P63均呈阳性表达,β1整合素表达率为98.57%,CD71表达率为9.05%.③94.99%细胞处于G0/G1期,细胞呈指数增长.结论:两步酶消化 Ⅳ型胶原快速黏附法可成功分选稳定生长的鼠表皮干细胞.含霍乱毒素、腺苷、胰岛素等因子的复合DMEM培养基可维持表皮干细胞的增殖能力,其中合适的血清浓度及Ca2 浓度至关重要.     

昆明鼠胚胎干细胞系的建立及其特性

背景:到目前为止,国际上通用的动物胚胎干细胞细胞系大多是从129品系和C57BL/6系小鼠中获得的,少部分来自BALB/C系,来自于中国昆明鼠则鲜有报道.目的:分离培养昆明系小鼠胚胎干细胞,并对其生物学特性进行初步鉴定.设计、时间及地点:以细胞为对象的观察性实验,于2006-05/2007-06在南昌大学第一附属医院泌尿外科研究所完成.材料:昆明小鼠3.5 d胚龄的囊胚.方法:自昆明系小鼠3.5 d胚龄的囊胚分离内细胞团细胞,接种于小鼠原代胚胎成纤维细胞饲养层上,对分离的内细胞团细胞进行扩增、传代培养.主要观察指标:观察胚胎干细胞集落的生长情况,对其碱性磷酸酶表达进行染色分析,采用免疫荧光法检测其阶段特异性胚胎抗原1表达,以反转录-聚合酶链反应检测其特异性表达因子c-Myc,Nanog,Oct3/4和Sox2的基因表达情况,并对其体内外分化能力对进行鉴定分析.结果:分离、培养自内细胞团的细胞呈典型的胚胎干细胞集落样生长,碱性磷酸酶染色及阶段特异性胚胎抗原1荧光染色阳性,细胞表达c-Myc,Nanog,Oct3/4和Sox2等基因,细胞在体内外均能分化成来源于不同胚层的多种细胞类型.结论:成功从昆明小鼠囊胚中分离并建立一株胚胎干细胞系,其生物学特性与其他胚胎干细胞株相符.     

胚胎干细胞研究临床应用性的挑战

胚胎干细胞是存在于胚胎发育早期阶段，具有自我更新和多分化潜能的干细胞，是组成机体各种组织器官的起源细胞。在一定条件下，其在体外可以保持未分化状态，长期存活无限繁殖。有关胚胎干细胞在动物疾病模型中治疗作用的研究，尤其是在小鼠胚胎干细胞的研究，已趋于成熟。在此基础上，人们开始尝试将人类胚胎干细胞用于临床治疗各种疾病，探讨其可行性和安全性等问题。目前胚胎干细胞已经应用在治疗糖尿病、帕金森及心血管损伤等各种疾病中，虽然有很多技术问题和社会伦理问题需要解决与克服，相信随着胚胎干细胞定向分化机制的逐渐完善，优化培养体系的建立，致瘤性的解决，该细胞疗法作为一种新的治疗方式，将适用于临床使用。     

Insulin-producing Surrogate β-cells From Embryonic Stem Cells: Are We There Yet?

Embryonic stem cells (ESCs) harbor the potential to generate every cell type of the body by differentiation. The use of hESCs holds great promise for potential cell replacement therapies for degenerative diseases including diabetes mellitus. The recently discovered induced pluripotent stem cells (iPSCs) exhibit immense potential for regenerative medicine as they allow the generation of autologous cells tailored to the patients'' immune system. Research for insulin-producing surrogate cells from ESCs has yielded highly controversial results, because many steps and factors in the differentiation process are currently still unknown. Thus, there is no consensus on common standard protocols. The protocols presently used established the differentiation from pluripotent cells toward pancreatic progenitor cells. However, none of the differentiation protocols reported to date have generated by exclusive in vitro differentiation sufficient numbers of insulin-producing cells meeting all essential criteria of a β-cell. The cells often lack the crucial function of regulated insulin secretion upon glucose stimulation. This review focuses on past and current approaches to the generation of insulin-producing cells from pluripotent sources, such as ESCs and iPSCs, and critically discusses the hurdles to be taken before insulin-secreting surrogate cells derived from these stem cells will be of clinical use in humans.     

骨髓间充质干细胞促进胰岛再生的作用与研究现状

背景：研究发现,骨髓间充质干细胞移植入糖尿病大鼠后能够降低其血糖。目的：综述骨髓间充质干细胞在促进胰岛再生方面的作用与研究现状。方法：应用计算机检索2003年7月至2011年12月PubMed数据库相关文章,检索词为＂bone marrow derive mesenchymal stem cell,islet cells＂,并限定文章语言种类为English。同时计算机检索2003年7月至2011年12月万方数据库相关文章,检索词为＂骨髓间充质干细胞,胰岛细胞＂,并限定文章语言种类为中文。最终纳入符合标准的文献25篇。结果与结论：目前,移植胰岛治疗糖尿病已取得良好疗效,但由于胰岛来源匮乏和异种或异体来源的胰岛引起免疫排斥反应而难以使众多糖尿患者受益。骨髓间充质干细胞取材方便,容易进行体外分离、培养和纯化,且具有多向分化潜能。若将骨髓间充质干细胞诱导分化为胰岛细胞,可望解决胰岛细胞来源和免疫排斥问题。文章对骨髓间充质干细胞分化为胰岛细胞治疗糖尿病的研究进展进行综述,并指出了存在问题和今后的研究方向。     

不同分离方法及培养条件对兔骨髓间充质干细胞生物活性的影响

背景:骨髓间充质干细胞常被用作骨组织工程的种子细胞和基因治疗的载体细胞,如何获得纯度较高活性较好的骨髓间充质干细胞是很多研究者关心的问题.目的:观察不同分离方法及培养条件对兔骨髓间充质干细胞生物活性的影响.方法:分别用密度梯度离心法、全骨髓培养法和红细胞裂解液法提取兔骨髓间充质干细胞,48 h后观察各组获得的细胞量,记录各组首次传代时间,相差显微镜观察细胞的形态,流式细胞仪鉴定其CD44抗原表达.分别用DMEM-LG、MEM-HG和DMEM/F12 3种培养基培养第3代细胞和第7代老化细胞,MTT法和计数板计数法比较不同时间点3种培养基培养细胞的生长情况,相差显微镜观察老化细胞的形态变化.结果与结论:3种分离方法均能得到较均一的梭形或者多角形贴壁细胞,胞核大胞浆丰富,CD44抗原表达阳性.其中红细胞裂解液法获得的贴壁细胞的量较其他方法多,首次传代时间短(P＜0.05).用DMEM/F12培养的细胞活力更好,细胞生长更迅速,并且经过DMEM/F12培养一段时间后,部分静止期细胞开始分裂增殖.提示红细胞裂解液法能够提高骨髓间充质干细胞的贴壁效率,是一种方便、有效的提取方法;DMEM/F12更能够促进细胞的增殖,较适合于培养骨髓间充质干细胞.     

干细胞治疗1型糖尿病的研究与应用进展

背景:通过胰腺或胰岛移植等重建胰岛素分泌系统是治疗1型糖尿病的有效方法,但材料来源受限,移植后免疫排斥反应易导致治疗失败。目的:简要总结了胚胎干细胞、成体干细胞及诱导性多能干细胞等治疗1型糖尿病的研究进展。方法:应用计算机检索CNKI和PubMed数据库中2008-01/2011-12关于干细胞治疗1型糖尿病的文章,在标题和摘要中以"胚胎干细胞;成体干细胞;诱导性多能干细胞;1型糖尿病"或"Embryonic stem cells,somatic stem cells,induced plurip otent stem cells,type 1 diabetes"为检索词进行检索。选择文章内容与干细胞治疗1型糖尿病相关,同一领域文献则选择近期发表或发表在权威杂志文章。初检得到128篇文献,根据纳入标准选择33篇文章进行综述。结果与结论:目前,不同来源的干细胞在体内外均能被诱导为产生胰岛素的细胞,并且这种诱导细胞用于1型糖尿病动物模型治疗,具有一定治疗效果,甚至能使受体血糖恢复正常水平,但干细胞是否参与胰岛细胞再生或修复尚存在争议。     

高效制备昆明鼠胚胎成纤维细胞饲养层

背景:小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层是胚胎干细胞培养最常用的方法,能有效抑制胚胎干细胞分化并促进其增殖,但其制备过程繁琐,工作量大,准备周期长。目的:探索建立小鼠胚胎成纤维细胞饲养层简单、高效的培养体系。方法:取13.5d胎龄胎鼠用改良组织块法及简化酶消化法分离培养原代成纤维细胞,倒置显微镜下观察不同方法培养的原代和传代鼠胚胎成纤维细胞的生长形态、结构及细胞数量变化。收集鼠胚胎成纤维细胞进行冻存,复苏后细胞经不同浓度作用时间的丝裂霉素C处理,制备饲养层。结果与结论:两种简化方法培养的原代鼠胚胎成纤维细胞生长状态良好,得到高效优质足量细胞,操作过程简单,省去了多次消化、离心、细胞计数等繁琐操作,均适宜于鼠胚胎成纤维细胞的原代培养。简化复苏法复苏后的细胞,按其生长汇合情况,以丝裂霉素C10mg/L作用1.5～2.0h或1mg/L培养过夜,省时并可获得细胞生长状态最佳的饲养层。     

Notch1蛋白在胚胎干细胞向神经细胞诱导分化过程中的表达

背景:胚胎干细胞是体内各种成熟细胞的"种子"细胞,是神经移植和发育基因功能研究的有利工具.Notch1信号足多种神经细胞有序分化的关键性调控通路,目前对其在胚胎干细胞诱导分化过程中的动态表达尚无报道.目的:探讨胚胎干细胞向神经细胞定向诱导分化过程中,跨膜信号分子Notch1蛋向的表达.设计、时间及地点:细胞观察,于2003-10/2004-10在中山大学中山眼科中心完成.材料:中山大学实验动物中心自建BALB/C小鼠胚胎干细胞Ⅵ株,具备XY染色体,正常核型比例80%以上,由中山大学中山眼科中心黄冰教授惠赠.方法:胚胎干细胞复苏后,加入含20%胎牛血清、106 IU/L小鼠白血病抑制因子的高糖DMEM细胞培养基,置于37℃,5%CO2培养箱中,两三天常规消化传代.向传至11代的胚胎干细胞中加入含20%胎牛血清、5×10-7mol/L维甲酸的高糖DMEM诱导分化培养基,设立诱导1,5,9d 3个观察时间点.主要观察指标:倒置相差显微镜观察细胞形态变化.免疫荧光化学检测成熟神经元标志性抗原MAP-2的表达.免疫细胞化学、Western Blot法及流式细胞术检测Notch1蛋白的表达.结果:胚胎干细胞呈克隆样生长,至诱导第9天大部分克隆周围为单一密集的神经网络.随着诱导时间延长,胚胎干细胞分化出的MAP-2阳性神经细胞数逐渐增多.胚胎干细胞克隆内的细胞几乎均呈Notch1强阳性或刚性表达,诱导分化后Notch1蛋白的表达随时间延长而逐渐降低(P<0.01).结论:在胚胎干细胞向神经细胞的诱导分化过程中,Notch1信号逐渐关闭,提示Notch1可能对胚胎干细胞向神经细胞的特异性分化起重要作用.