氟离子植入猪骨源羟基磷灰石对 MC3T3-E1 细胞黏附、增殖与成骨分化的影响

目的 检测氟离子植入猪骨来源羟基磷灰石（PHA）对小鼠前成骨细胞（MC3T3-E1）黏附、 增殖及成骨分化的影响。方法 取猪骨松质用高温烧结的方法制备PHA，使用氟化钠浸泡结合二次高温 烧结进行氟离子植入，制备获得氟化猪骨源羟基磷灰石（FPHA）骨块，进行研磨获得颗粒材料后制备 压片，采用PHA颗粒制备的压片为对照组，采用FPHA颗粒制备的压片为实验组。在压片材料表面接种 小鼠MC3T3-E1前成骨细胞株，通过扫描电镜SEM观察不同时间细胞黏附形态，CCK-8法检测细胞增 殖情况，RT-PCR法检测细胞成骨相关基因碱性磷酸酶ALP、骨钙素BGLAP、骨桥蛋白OPN mRNA 的表达情况。结果 扫描电镜SEM观察可见，PHA与FPHA组细胞黏附生长良好；两组细胞接种1、7d 后OD值比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；FPHA组接种3、5 d后OD值高于PHA组，差异有统计学 意义（P＜0.05）；RT-PCR结果显示，FPHA组细胞接种3、7 d后ALP、BGLAP mRNA表达水平均高于 PHA组，且两组细胞接种7 d后材料表面细胞ALP与BGLAP mRNA表达水平均高于细胞接种3 d后，差异 有统计学意义（P＜0.05）。结论 PHA与FPHA材料均具有良好的细胞相容性，氟离子植入猪骨羟基磷灰 石可促进小鼠前成骨细胞早期增殖与成骨分化。     

镁合金AZ31B对骨骼肌细胞黏附及增殖的影响

[目的]研究镁合金AZ31B对骨骼肌细胞黏附及增殖的影响.[方法]用扫描电镜明确镁合金AZ31B的表面形态,采用兔骨骼肌细胞与合金直接接触培养,研究其黏附率,采用扫描电镜研究其黏附情况.采用浸提液培养细胞,研究其1、3、5、7d的细胞相对增殖率,并采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况.[结果]镁合金表面形态粗糙,有利于细胞的黏附,结果提示骨骼肌细胞在合金表面具有良好的黏附率,且随着培养时间的延长,黏附率逐渐增高,扫描电镜见到骨骼肌细胞在镁合金表面黏附良好.细胞增殖率结果提示镁合金促进骨骼肌细胞增殖,且未见明显细胞凋亡.[结论]镁合金AZ31B具有良好的生物相容性,适合于骨骼肌细胞的早期黏附,且促进骨骼肌细胞的增殖,为镁合金AZ31B适用于骨科置入材料提供了理论支持.     

同种异体骨共价枝接精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽对成骨细胞黏附和增殖的影响

目的观察同种异体骨共价枝接精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp,RGD）多肽对大鼠成骨细胞黏附和增殖的影响。方法以RGD多肽在同种异体骨片表面进行共价枝接反应,用X线光电子能谱分析仪（XPS）进行表面分析,以大鼠成骨细胞在骨片表面进行组织培养,MTY法及细胞计数法评价成骨细胞的黏附效力及增殖活性,通过相差显微镜、扫描电镜观察细胞形态及增殖情况。结果以碳二亚胺（EDC）为交联剂能够将RGD多肽有效固定于同种异体骨片表面,成骨细胞在同种异体骨片表面培养4h、加h后,实验组细胞黏附效力（0．322±0．014、0．447±0．030）均明显强于对照组（0．240±0．012、0．337±0．048）,培养4d、6d、8d后,实验组成骨细胞增殖情况（0．510±0．054、0．612±0．075、0．629±0．098）亦强于对照组（0．405±0．054、0．340±0．030、0．339±0．018）。结论RGD多肽共价修饰同种异体骨能够有效促进成骨细胞的黏附和增殖。     

含SrCaP涂层镁合金ZK60对小鼠前成骨细胞功能的影响

目的探讨含锶钙磷（SrCaP）涂层镁合金ZK60对小鼠前成骨细胞黏附、增殖和成骨分化等功能的影响。方法制备含SrCaP涂层的镁合金ZK60材料,以不含SrCaP涂层的ZK60和钛合金材料作为对照,扫描电镜观察材料表面的超微结构;以小鼠MC3T3-E1细胞为对象,扫描电镜、荧光显微镜、MTT法、p-NPP法等观察上述材料对细胞黏附、增殖和成骨分化的影响。结果扫描电镜可见含SrCaP涂层镁合金ZK60表面的粗糙多孔结构。与ZK60组相比,前成骨细胞在该材料上铺展面积更大,黏附更好;死活细胞染色显示培养24 h时SrCaP-ZK60组活细胞数最多;浸提液培养5 d时SrCaP涂层镁合金组细胞增殖显著高于钛合金组（P＜0.05）;培养7 d后,SrCaP涂层镁合金表面成骨细胞碱性磷酸酶表达显著高于ZK60组及钛合金组（P＜0.05）。结论含SrCaP涂层镁合金ZK60具有良好的促成骨细胞黏附、增殖和成骨分化作用。     

构建大段可控微结构组织工程骨的实验研究

目的 应用仿生设计和光固化快速成型间接构造方法 构建大段可控微结构组织工程骨,观察其与成骨细胞在体外培养条件下的生物相容性.方法 基于对密质骨哈佛系统的简单仿生,应用计算机辅助设计(CAD)软件设计具有微丝架结构的圆柱形支架模型.建模后输入光固化快速成型机,制成树脂模具,充填磷酸钙骨水泥(CPC),800℃下加min熔去模具,制成CPC支架.将兔颅骨成骨细胞与支架复合培养3、7、14d后,于共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)、扫描电镜下观察细胞在支架表面及微孔道内部的黏附、生长和增殖情况.结果 支架CAD模型为直径16 mm,长10 mm的圆柱体,内部由5层微丝网平行叠加形成相互连通的三维网架,微丝直径分别为200μm和500μm.制成支架的大体形态及内部三维微结构与设计模型一致,所构成的微孔道孔径范围260～580μm.CLSM下观察:特异性荧光探针标记显示细胞骨架成网状贯穿整个细胞和细胞突起;SEM下观察:培养3d时支架表面有梭型细胞铺展生长,有多个突起,大小10～30μm;7d后细胞在支架表面基本汇合,并向微孔内爬行生长;14d后大量细胞爬行人微孔内.结论 基于哈佛系统简单仿生设计和快速成型技术制备的大段组织工程骨,实现了微结构的完全精确调控,其微孔利于成骨细胞进入,具有良好的生物相容性,为大段组织工程骨的仿生制造提供了实验依据.     

新型钽铌多孔支架材料的细胞生物相容性研究

[目的]研究多孔钽铌(Ta-Nb)材料的细胞相容性。[方法]将兔成骨细胞与多孔钽铌材料共培养,采用CCK-8法检测细胞增殖、扫描电镜观察细胞在材料上的黏附、RT-PCR检测Ⅰ型胶原和骨钙素基因的表达。[结果]CCK-8检测显示实验组多孔钽铌材料上细胞的增殖与空白对照组没有差异性(P﹥0.05);扫描电镜观察到细胞在多孔钽铌的表面和孔隙内大量黏附、增殖和生长,随着共培养时间的增加,材料表面的细胞数量明显增多;RT-PCR显示随着共培养时间的增加,Ⅰ型胶原基因的表达增强(P﹤0.05),骨钙素的表达无明显差异(P﹥0.05)。[结论]多孔钽铌支架材料适于成骨细胞的黏附、生长和分化,具有良好的细胞相容性。     

墨鱼骨转化羟基磷灰石多孔陶瓷表面纳米结构调控及其对成骨细胞作用的研究

目的探索墨鱼骨转化羟基磷灰石多孔陶瓷(cuttlefish bone transformed hydroxyapatite,CB-HA表面纳米结构的制备与调控,以及不同尺寸纳米结构对成骨细胞黏附、增殖以及ALP表达的影响。方法取墨鱼骨制备成直径10 mm、厚2 mm的注水骨片后分为4组,分别与不同浓度磷源溶液混合,置于水热釜,放入烘箱于120℃反应24 h后,组1~3样品不作处理,组4进一步于1 200℃下烧结3 h,去除表面结构作为对照。采用X射线衍射仪、傅里叶红外光谱仪、电感耦合等离子体原子发射光谱分析各组CB-HA化学成分,扫描电镜、比表面测试仪、孔隙率测试仪分析其物理结构。取第4代MC3T3-E1细胞分别与4组CB-HA共培养,培养1 d后扫描电镜观察细胞形态,1、3、7 d后用MTT法分析细胞增殖情况,7、14 d后用p NPP法测试细胞ALP表达情况。结果 4组CB-HA X射线衍射光谱均见羟基磷灰石的峰形,红外线吸收光谱示红外吸收峰与羟基磷灰石一致,电感耦合等离子体原子发射光谱分析显示钙磷比为1.68~1.76。扫描电镜观察见组1~3 CB-HA表面分别为大、中、小尺寸团簇结构,组4表面没有明显纳米结构。4组CB-HA比表面积比较差异有统计学意义(P0.05),孔隙率比较差异无统计学意义(P0.05)。与组4相比,组1~3孔径50 nm的微孔更多,并且随着纳米团簇结构尺寸的减小,微孔逐渐增多。与细胞共培养后,扫描电镜及MTT检测示,与组1、4相比,组2、3 CB-HA表面细胞黏附及增殖均更好,并且细胞有更多的ALP表达(P0.05)。结论通过控制磷源溶液中铵根离子浓度能够调控CB-HA表面纳米团簇结构的尺寸,并且在CB-HA表面引入小尺寸团簇纳米结构能够改善材料的细胞黏附、增殖以及ALP表达,这种作用可能与纳米结构引起比表面积增加有关。     

复合类新型骨基质材料生物相容性研究

目的 评价一种新型无机—有机复合类骨基质材料(NBM)的生物相容性。方法 应用组织培养技术对NBM体外复合兔成骨细胞培养1—14天，然后进行形态学观察、细胞增殖、细胞蛋白含量与碱性磷酸团(ALP)活性测定；对NBM采用同种兔体内植入观察2、4和8周，通过倒置显微镜、扫描电镜及组织学观察其体内成骨情况。结果 体外培养时NBM对成骨细胞的体外增殖和ALP的表达无明显抑制作用，成骨细胞与材料可良好黏附、增殖，并分泌大量细胞外基质成分；而细胞—材料复合体肌内植入后4周可见大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润，8周仍未见新生骨组织生成。结论 NBM材料的体内外生物相容性差异可能与NBM免疫原性有关，体内植入后引起宿主免疫反应，影响体内成骨。无机—有机复合材料引起的移植免疫排斥反应应引起组织工程研究的注意。     

Cdc42在种植体纳米化影响成骨细胞功能中的作用

目的 研究Cdc42在纳米化种植体促进成骨细胞功能中的作用.方法 将纳米化种植体与成骨细胞联合培养,通过Western Blot检测Cdc42活性蛋白含量,以及荧光染色检测成骨细胞内F-actin分布,扫描电镜观察成骨细胞形态,MTT检测成骨细胞增殖.结果 纳米化种植体使成骨细胞内Cdc42活性蛋白含量明显增多,Toxin B抑制后其活性明显下降,纳米化种植体表面成骨细胞形态不规则,细胞骨架明显,伸出较多伪足,采用Toxin B处理后细胞形态变圆,伪足减少.成骨细胞增殖功能随种植体纳米化而明显增高,在Toxin B处理后下降.结论 种植体粗化使Cdc42表达增加,可能通过Cdc42调节成骨细胞的黏附及增殖.     

剂量因素对羟基磷灰石/磷酸三钙成骨细胞相容性的影响

目的　检测不同剂量的羟基磷灰石 /磷酸三钙 (HA/ TCP)对兔成骨细胞增殖及碱性磷酸酶(AL P)活性的影响 ,明确材料的剂量因素在研究 HA/ TCP细胞相容性中的作用规律。方法　以兔成骨细胞为正常对照 ,细胞加入钛合金材料组为阴性对照 ,细胞加入聚氯乙烯材料组为阳性对照。选择三种材料剂量 ,以材料占细胞面积的比例表示 ,分别为 10 %、4 0 %和 70 %。将各组材料与兔成骨细胞复合培养 ,MTT法检测不同时间点、不同剂量材料作用下兔成骨细胞增殖的情况 ;偶氮偶联法检测不同时间点、不同剂量材料作用下兔成骨细胞表达 AL P的变化。结果　正常兔成骨细胞的生长呈现时间 -效应关系。与正常对照相比 ,10 % HA/ TCP不会对兔成骨细胞的生长产生影响 (P>0 .0 5 ) ;当 HA/ TCP剂量增大为 4 0 % ,细胞的生长速度明显变缓 (P<0 .0 5 ) ,细胞的生长仍呈现时间 -效应关系 ;70 %的 HA/ TCP使细胞生长趋于停滞 (P<0 .0 1)。 10 % HA/ TCP可造成细胞 AL P活性可逆性损伤 ,HA/ TCP浓度达 4 0 %时 ,AL P活性损伤至共培养 6天不可逆转。相对而言 ,惰性金属硬组织材料钛合金在检测三种剂量下均对细胞生长及细胞 AL P活性不会产生影响。结论　评价材料的细胞相容性应向材料接触剂量个体化、特异化的方向发展 ;除增殖指标之外 ,AL     

MC3T3‐E1 Cells Behavior on Surfaces Bombarded by Argon Ions in Planar Cathode Discharge

To evaluate the effect of topography in nanoscale, titanium surfaces were bombarded by argon ions (a chemically inert gas), in an atmosphere of plasma. The effects of surface parameters on morphology, adhesion, proliferation, and MC3T3‐E1 preosteoblasts differentiation were analyzed. Nontreated (smooth) surfaces were used as a control. The levels of average roughness (Ra) observed in bombarded and smooth titanium surfaces were of 95 and 14 nm, respectively. The wettability increased on treated surfaces. The number of attached cells (30 and 60 min) was significantly higher on the bombarded surface. The cell proliferation after 3 and 7 days was also significantly higher on the ion‐bombarded surface. In addition, the ALP activity and expression of osteocalcin were higher in cells grown on the treated surface. The results showed that bombardment with argon ions increased the roughness and the wettability of the Ti surface, promoting a significant increase in the adhesion, proliferation, and differentiation of preosteoblasts.     

A Bone Replaceable Artificial Bone Substitute: Osteoinduction by Combining with Bone Inducing Agent

Bone inducing agent (BIA) isolated from Saos-2 human osteosarcoma cells was added to an artificial bone substitute composed of 980 degrees C-heated carbonate apatite (CAp) and Type I atelocollagen (AtCol) extracted from bovine tail skins (88/12 in wt/wt %), and a CAp-AtCol-BIA substitute was prepared as an osteoinductive bone substitute. Rat calvaria osteoblasts treated by the isolated BIA demonstrated significantly increased alkaline phosphatase (ALP) activity after 3 days (p < 0.05). In vitro cell attachment and proliferation and ALP activity were investigated for the bone substitute combined with BIA. Osteoblasts cultured onto the surface of the CAp-AtCol-BIA substitute demonstrated remarkable morphological changes such as radial spreading, flattening, and projecting filopodia after 5 days. In comparison with the substitute without BIA, osteoblasts grown in the BIA-combined CAp-AtCol substitute expressed significantly increased proliferation and ALP activity, respectively (p < 0.05). Both the substitutes combined with and without BIA were implanted into artificial defects created in rabbit radii. After 4 weeks, the CAp-AtCol-BIA substitute implanted lesion was completely replaced by regenerated host bone in radiological observation whereas the substitute without BIA was partially resorbed. No histologic abnormalities appeared in the substitute either with or without BIA.     

可控微结构EBM钛合金支架与成骨细胞的体外三维复合培养

[目的]探讨可控微结构EBM钛合金支架作为成骨细胞体外培养载体的可行性,并观察载体类蜂巢状孔结构在成骨细胞培养中的作用.[方法]应用直接金属快速成形技术一电子束熔化成形(electron beam melting,EBM)过程直接构建和制备可控性微结构钛合金支架.分离培养1 d龄胎兔颅骨成骨细胞,以兔颅骨源性成骨细胞复合支架作为实验组,以单独培养的兔颅骨源性成骨细胞作为对照组.将成骨细胞与支架复合培养1、7、14 d后,进行倒置相差显微镜、扫描电镜及组织切片染色观察细胞与材料复合情况,以MTT比色法及碱性磷酸酶的定量检测研究材料结构对细胞增殖、分化的影响.[结果]成骨细胞/支架复合培养7d后,大量细胞通过伸出多个伪足粘附在支架表面以及孔周围并与支架牢固结合;培养14 d后支架表面及孔隙内有大量细胞分布,细胞伸出数个突起沿着孔隙壁逐渐向孔隙内延伸、汇集.支架上的细胞增殖、分化以及转移明显增加,与对照组比较有明显统计学差异(P<0.05).[结论]EBM钛合金支架有利于细胞的贴附、生长及增殖,并对细胞的功能无不良的影响.支架类蜂巢状孔结构能够调节成骨细胞在支架内的分布.     

铁饱和乳铁蛋白对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响

目的 探讨铁饱和乳铁蛋白对体外培养的大鼠成骨细胞增殖和分化的影响.方法 用酶消化法分离大鼠颅盖骨成骨细胞进行原代培养;乳铁蛋白螯合Fe~(2+)获得铁饱和乳铁蛋白;将其稀释到不同浓度作用于成骨细胞,四唑盐比色法(MTT)测定细胞增殖;碱性磷酸酶法(ALP)测定细胞碱性磷酸酶活性.结果 随着时间的增加,各浓度组均可促进成骨细胞增殖及增强碱性磷酸酶活性.其中100 μg/mL浓度组在72 h时细胞增殖数目最大、碱性磷酸酶活性最高,较对照组有统计学意义(P＜0.01).结论 铁饱和乳铁蛋白能促进大鼠成骨细胞的增殖和分化.     

改良复合磷酸钙骨水泥诱导分化成骨作用的体外研究

目的 通过体外实验观察兔骨髓基质干细胞(BMSCs)与改良复合磷酸钙骨水泥(BCPC)共培养的生物相容性及诱导成骨活性,探讨其可能的机制.方法 配制相同大小规格的BCPC及普通磷酸钙骨水泥(CPC)块,实验分为4组:空白对照组(不加载体)、普通CPC组、BCPC组、加BMP组(加BMP的BCPC).将各组材料与兔BMSCs复合培养,倒置显微镜下观察细胞生长情况,进行细胞计数,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测细胞合成ALP活性变化,扫描电镜观察细胞在材料表面的生长及长入情况,real-time PCR检测成骨及成软骨相关基因mRNA表达情况并比较表达差别.结果 复合培养后倒置显微镜观察各组细胞与载体边缘接触良好,各组细胞增殖差异无统计学意义(P＞0.05);扫描电镜观察细胞在BCPC表面生长增殖良好,逐渐伸出伪足并长入材料孔隙;复合培养7 d后,BCPC组及加BMP组比CPC组和空白对照组表达更高的ALP活性,差异有统计学意义(P＜0.05);复合培养第10天,BCPC组及加BMP组分别与CPC组及空白对照组比较,其成骨及成软骨相关基因mRNA表达差异有统计学意义(P＜0.05).结论 配制的BCPC具有良好的生物相容性和一定的成骨诱导能力,其疏松的结构及更大的孔径适宜细胞长入材料内部.     

煅烧骨与诱导的MSCs复合的实验研究

目的：观察大鼠骨髓基质干细胞（MSCs）与经胶原涂层处理的煅烧骨（CCB）复合行体外培养时贴附、增殖能力的变化,探讨构建组织工程骨体外培养的最适时间。方法：制备鼠尾胶原（I型胶原）,无菌条件下,将煅烧骨置于胶原液中,2h后取出骨块,置滤网中将孔内外的胶原溶液沥干。体外培养的大鼠MSCs经矿化液诱导向成骨细胞分化。将分化后的成骨细胞滴加到涂胶原的煅烧骨块上,同时以未涂胶原的煅烧骨块为对照组。3天,7天时取材,扫描电镜下观察实验组与对照组成骨细胞在煅烧骨表面的贴附数量及形态,用细胞计数法测定细胞在两组材料的生长曲线,组织化学方法检测成骨细胞的ALP活性。结果：扫描电镜发现实验组成骨细胞的贴附数量显著高于对照组（P〈0．01）。细胞计数认为实验组细胞在材料上粘附数量多,增殖速度快。实验组ALP活性明显高于对照组（P〈0．01）。结论：胶原修饰的煅烧骨具有良好的组织相容性,能明显提高成骨细胞的贴附,并且促进成骨细胞活性维持,体外培养7～8天时,材料上的细胞数达到最大,应尽快植入体内。