RNA干扰细胞黏附分子L1表达逆转胶质瘤U251细胞多药耐药

背景与目的：细胞黏附分子L1（cell adhesionmoleculeL1,L1CAM）是一种跨膜黏附蛋白,在神经系统发育及肿瘤发生中发挥重要作用。本研究运用RNA干扰（RNAinterference,RNAi）技术抑制L1CAM表达,并探讨其对胶质瘤U251细胞多药耐药的逆转作用及相关分子机制。方法：将针对L1CAM的小干扰RNA（siLl）和阴性对照siRNAfsiCon）转染人胶质瘤U251细胞。实验分3组：空白对照组（胶质瘤U251细胞）、阴性对照组（转染siCon的胶质瘤U251细胞）、实验组f转染siLl的胶质瘤U251细胞）。蛋白质印迹法（Westernblotting）~U251细胞中L1CAM、MRPl、pAKT及pERK1／2等蛋白表达。细胞增殖实验检测L1CAM对顺铂（cisplatin）和P13K／AKT抑制剂LY294002抑制U251细胞增殖的影响。免疫荧光染色法检测抑制LICAM表达对U251细胞系中AKT磷酸化情况的影响。结果：实验组L1CAM、pAKT．pERKl／2蛋白表达量明显低于阴性对照组和空白对照组（P〈0．01）,但实验组多药耐药蛋白MRPl表达量以及Bcl-2cdBax与阴性对照组和空白对照组相比无明显变化。实验组顺铂和LY294002对U251细胞增殖的抑制率高于阴性对照组和空白对照组,提示抑制LICAM表达后细胞对顺铂和LY294002的敏感性增加。免疫荧光结果显示,与阴性对照组和空白对照组相比,实验组细胞内AKT磷酸化信号明显降低。结论：RNAi抑制L1CAM表达能增强顺铂和LY294002对U251细胞增殖的抑制作用,并可抑制P13K／AKT和MAPK信号激活．一定程度上可逆转胶质瘤细胞的多药耐药性。     

LY294002抑制PI3K/AKT信号通路对胃腺癌SGC-7901 细胞的影响

目的:观察应用PI3K抑制剂2-(4-吗啉基)-8-苯基-4氢-1-苯并吡喃-4酮(LY294002)对胃腺癌细胞株SGC-7901中磷脂酰肌酸3-激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸激酶(AKT)信号通路的变化以及由此产生的细胞生长、侵袭及凋亡等方面的影响.方法:应用LY294002作用于胃腺癌细胞株SGC-7901,通过Western blot检测PI3K/AKT信号通路中相关蛋白质P-AKT、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、细胞周期素(CyclinD1)的表达情况.噻唑蓝比色法(MTT)和流式细胞法及Transwell等实验评价胃腺癌细胞增殖、侵袭、凋亡等变化.结果:与空白对照组和DMSO组相比,LY294002组能有效抑制P-AKT、MMP-2、MMP-9、Bcl-2及CyclinD1蛋白的表达.LY294002组自第2天起生存率明显下降(P<0.05).Transwell穿过细胞数结果分别为空白对照组(81.0±2.65)、DMSO组(81.3±1.52)、LY294002组(44.6±2.52),3组相比较差异具有统计学意义(F=255.1,P=0.000).LY294002组细胞周期被阻滞在G0/G1期,S期减少(P<0.05),早期凋亡的细胞数明显增多(F=149.66,P=0.000).结论:LY294002是一种对PI3K/AKT信号传导通路具有抑制作用的抑制剂,靶向PI3K的LY294002可以有效抑制胃腺癌SGC-7901细胞的PI3K/AKT信号通路中相关蛋白质的表达,在体外显著抑制细胞的增殖、侵袭,并促进细胞的凋亡,因此为临床肿瘤防治提供了新思路,针对信号传导通路的靶向治疗有望成为肿瘤治疗的新途径.     

CiRS-7/P13K/AKT轴对乳腺癌细胞生物学行为的影响及紫草素干预机制研究

摘 要：［目的］ 探讨小脑变性相关蛋白1反义转录物(cerebellar degeneration-related protein 1 antisense,CDR1as,又名 ciRS-7)调控磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol-3 kinase,P13K）/蛋白激酶B（protein kinase B,AKT）通路对乳腺癌细胞生物学行为影响及紫草素干预机制。［方法］ 选取河南黄河科技学院附属医院收治的41例乳腺癌患者癌组织及癌旁正常乳腺组织,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测ciRS-7、P13K及AKT 信使RNA（messenger RNA,mRNA）表达情况。选取乳腺癌细胞株MCF-7及正常乳腺细胞MCF-10A进行体外实验。采用RT-PCR法检测MCF-7和MCF-10A细胞ciRS-7、P13K及AKT mRNA表达水平。向MCF-7细胞株转染 ciRS-7抑制剂（转染组） 和ciRS-7 inhibitor 阴性对照（阴性对照组）48 h后,采用Western blot法检测细胞P13K、磷酸化P13K（phosphorylation- phosphatidylinositol-3 kinase,p-P13K）、AKT、磷酸化AKT（phosphorylation- protein kinase B,p-AKT）蛋白表达量,MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell小室体外侵袭和迁徙实验检测细胞的体外迁移及侵袭能力。采用不同浓度（0、4、8、16 μmol/L）紫草素对MCF-7细胞进行干预,48 h后检测细胞增殖抑制率及凋亡率,RT-PCR法检测ciRS-7、P13K及AKT mRNA表达,Western blot法检测细胞P13K、p-P13K、AKT、p-AKT蛋白表达量。［结果］ 相较于癌旁组织和MCF-10A细胞,乳腺癌组织和MCF-7细胞ciRS-7、P13K及AKT mRNA水平更高（P＜0.05）。MCF-7细胞转染后,相较于阴性对照组,转染组P13K、p-P13K、AKT和p-AKT蛋白相对表达量有所降低,且细胞迁徙及侵袭能力均降低;转染48 h后,转染组和阴性对照组增殖抑制率分别为36.71%±4.22%、0.09%±0.05%,两组凋亡率分别为27.84%±3.57%、5.44%±1.28%,差异具有统计学意义（P＜0.05）。随着紫草素干预浓度的增加,48 h细胞增殖抑制率及凋亡率也有所上升,ciRS-7、P13K及AKT mRNA水平以及P13K、p-P13K、AKT、p-AKT蛋白相对表达量有所降低（P＜0.05）。 ［结论］ ciRS-7可通过P13K/AKT通路对乳腺癌细胞生物学行为产生影响,紫草素抑制乳腺癌细胞的增殖,并促进其凋亡,其机制可能与ciRS-7/P13K/AKT通路有关。     

PI3K／Akt途径在朊蛋白介导胃癌耐药中的作用研究

目的：探讨P13K／Akt途径在朊蛋白（PrPc）介导胃癌耐药中的作用。方法：脂质体基因转染法建立高表达PrPc的胃癌细胞亚系。Western印迹检测转染细胞中Akt蛋白的表达。噻唑蓝（MTT）比色法测定单独或联用P13K抑制剂LY294002时转染细胞对化疗药物的敏感性。流式细胞仪检测单独或联用LY294002时转染细胞内阿霉素蓄积和潴留。结果：将PrPc正义载体pcDNA—PrP转入SGC7901,成功建立PrPc高表达胃癌细胞亚系并命名为PS;空载体转染细胞命名为BS。Western—Blot显示磷酸化Akt在PS中的表达较Bs及SGC7901增高,而三者的总Akt则无差别。未经LY294002处理时,在阿霉素或长春新碱的作用下,PS的存活率分别为91．4％±3．4％和89．4％±3．8％,较BS（79．2％±4．3％和75．9％±2．1％）明显增高（均）,PS细胞内阿霉素蓄积量和潴留量分别为4．4±0．3和4．2±0．4,明显低于BS（8．2±0．5和8．0±0．3）（均）;当联合LY294002处理后,PS在两种药物作用下的存活率均随着LY294002浓度的增加逐渐降低,并均在LY294002为30tLmol／L时接近BS（均）,PS细胞内阿霉素蓄积量和潴留量逐渐增高,并均在LY294002为30μmol／L时接近BS（均）。结论：PrPc介导的胃癌耐药与P13K／Akt途径活性密切相关,抑制P13K／Akt途径活性可逆转PrPc介导的胃癌耐药。     

miR-182激活PI3K/AKT信号通路促进肝癌HepG2细胞增殖、侵袭和迁移的机制研究

目的:探讨miR-182通过PI3K/AKT信号通路对肝癌HepG2细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其机制。方法:将体外培养的HepG2细胞分为对照组(未转染)、阴性组(转染阴性对照)、模拟物组(转染miR-182模拟物)和模拟物+抑制剂组(转染miR-182模拟物后,加入PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002),采用RT-PCR检测各组细胞中miR-182的表达水平,Western blot检测各组细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT和MMP-9、c-Myc、VEGF蛋白的表达,采用MTT法、克隆形成实验和Transwell小室分别检测各组细胞的增殖、侵袭和迁移能力。结果:与对照组相比,模拟物组细胞的存活率、克隆形成率和侵袭细胞数、迁移细胞数均明显升高,细胞中p-PI3K、p-AKT和MMP-9、c-Myc、VEGF蛋白的表达水平也均明显上升(P<0.05);而阴性组和对照组细胞相比无显著性差异(P>0.05)。与模拟物组相比,模拟物+抑制剂组细胞的存活率、克隆形成率和侵袭细胞数、迁移细胞数明显降低,细胞中p-PI3K、p-AKT和MMP-9、c-Myc、VEGF蛋白的表达水平也均明显下降(P<0.05)。结论:miR-182可通过激活PI3K/AKT信号通路上调MMP-9、c-Myc、VEGF蛋白的表达促进肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移。     

磷脂酰肌醇3激酶抑制剂LY294002对人胶质瘤U251细胞中HIF-1α表达和细胞生长的影响

目的:探讨低氧环境下磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositide3kinase,PI3K)抑制剂LY294002对人胶质瘤U251细胞中PI3K/丝氨酸-苏氨酸激酶(serine-threonine kinase,Akt)信号通路下游缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)mRNA和蛋白的表达以及细胞生长、细胞凋亡、细胞黏附和侵袭能力的影响。方法:应用LY294002作用于低氧环境中的人胶质瘤U251细胞(低氧+LY294002组),以低氧环境中未加LY294002的细胞作为对照(低氧组)。CCK-8试剂盒检测U251细胞生长,FCM检测细胞凋亡百分比,黏附实验检测细胞黏附能力,侵袭实验检测细胞侵袭能力,蛋白质印迹法检测p-Akt蛋白的表达,RT-PCR和蛋白质印迹法检测HIF-1αmRNA及蛋白的表达。结果:LY294002能明显抑制p-Akt蛋白以及HIF-1αmRNA和蛋白的表达,与低氧组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。LY294002能抑制低氧环境中U251细胞的增殖,抑制效果在药物作用后第2～6天时最为明显(P<0.05)。低氧+LY294002组中细胞凋亡百分比明显高于低氧组(P<0.01),而细胞黏附和侵袭能力明显低于低氧组(P<0.01)。结论:LY294002能抑制低氧环境中PI3K/Akt信号通路下游HIF-1αmRNA及蛋白的表达,抑制人胶质瘤U251细胞的生长,促进细胞凋亡,并抑制细胞黏附和侵袭能力。     

P13-K抑制剂LY294002逆转P-gP介导的白血病和胃癌细胞耐药

背景与目的：磷脂酰肌醇3-激酶／蛋白激酶B[phosphatidylinositol-3-kinase（P13-K）／proteinkinaseB（Akt）,P13-K／Aktl通路是调控细胞生存的重要信号转导通路之一。本研究旨在探讨P13-K抑制剂LY294002对P-gP过表达的人类白血病K562／DNR和胃癌SGC7901／ADR细胞多药耐药性的逆转作用。方法：将细胞分为单纯药物组和LY294002预处理组,单纯药物组分别以柔红霉素（daunorubicin,DNR）、阿霉素（adriamycin,ADR）、长春新碱（vincristine,VCR）和依托泊甙（etoposide,VP-16）处理,LY294002预处理组在加药前以LY294002进行预处理。用台盼蓝拒染法及MTT法检测药物敏感性及LY294002对细胞耐药性的影响。Westernblot检测K562／DNR和SGC7901／ADR细胞中P．gP及p-Akt的表达。流式细胞术检测细胞内药物浓度。结果：2．5μmol／LLY294002预处理显著降低DNR、ADR、VCR和VP-16对K562／DNR细胞的IC50,相对逆转效率分别为72．4％、64．9％、60．4％和52．8％。此外,LY294002部分逆转SGC7901／ADR对ADR的耐药性,相对逆转效率为31．0％。LY294002预处理可部分抑制p-Akt和P-gP的表达。随着处理时间的延长．K562／DNR、SGC7901／ADR细胞内DNR、ADR的蓄积效应有增强的趋势。结论：LY294002通过抑制P13-K／Akt信号转导通路,部分逆转P-gp介导的白血病和胃癌细胞的多药耐药。     

抑制P13K／Akt信号转导通路提高化疗效果的实验研究

目的：探讨通过抑制P13K／Akt信号转导通路提高抗癌药物对恶性肿瘤细胞的杀伤作用。方法：采用噻唑蓝（MTT）比色法检测塞莱昔布、顺铂及多西紫杉醇单独或联合P13K抑制剂LY294002对人官颈癌HeLa细胞和人乳腺癌MCF-7细胞的抑制率；采用流式细胞技术检测药物单独或联合作用对HeLa细胞和MCF-7细胞凋亡的影响。结果：①联合LY294002能够显著提高塞莱昔布、顺铂及多西紫杉醇对HeLa细胞和MCF-7细胞抑制率（P〈0．05）。②LY294002与塞莱昔布、顺铂及多西紫杉醇的协同治疗指数均小于1，具有协同治疗作用。③联合LY294002能够增加HeLa细胞和MCF-7细胞的凋亡水平。结论：抑制P13K／Akt信号转导通路能够显著提高塞菜昔布、顺铂及多西紫杉醇对HeLa细胞和MCF-7细胞的杀伤作用。     

抑制Notch和PI3K/Akt信号通路对食管腺癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响

目的 探讨Notch和PI3K/Akt两条信号通路对人食管腺癌细胞OE33增殖、侵袭及迁移能力的影响及两条信号通路之间的联系。方法 应用Notch信号通路阻滞剂DAPT和PI3K/Akt信号通路阻滞剂LY294002分别单独和联合处理OE33细胞,设置对照组;Western blot和实时定量PCR法检测OE33细胞中NICD、Hes1、p-Akt、PTEN蛋白和mRNA的表达变化;CCK-8法检测细胞的增殖抑制率;划痕实验用于检测细胞迁移能力的变化;Transwell细胞侵袭实验用于检测细胞的侵袭能力变化。结果 Notch1通路阻滞剂DAPT能减低Notch1通路相关蛋白NICD和Hes1的表达,并能提高p-Akt蛋白的表达;PI3K/Akt路阻滞剂LY294002不仅使p-Akt的蛋白表达水平减低,还能降低Hes1的蛋白表达水平,同时使NICD的蛋白和Hes1的mRNA表达水平增高。DAPT和LY294002联合处理组的NICD、Hes1、p-Akt的蛋白表达均较空白对照组和单药处理组降低,同时细胞的增殖、迁移和转移能力亦明显减弱。各处理组中PTEN的蛋白和mRNA表达水平较对照组均有一定程度的升高。结论 Notch和PI3K/Akt两条信号通路在食管腺癌细胞OE33中可能存在串话, 同时抑制这两种信号通路能有效的抑制OE33的增殖、侵袭及迁移。     

低表达DJ-1调控PI3K/AKT通路对肺癌细胞增殖、凋亡的影响

目的:探讨低表达DJ-1对肺癌细胞增殖凋亡及PI3K/AKT通路的影响。方法:采用Western blot检测肺癌细胞系中DJ-1蛋白的表达;以脂质体法转染干扰SK-MES-1细胞中DJ-1蛋白的表达后,MTT法检测细胞的增殖变化,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,Western blot检测细胞中p-AKT和AKT蛋白的表达水平;将PI3K/AKT通路抑制剂LY294002处理SK-MES-1细胞48 h后,MTT法和流式细胞仪分别检测细胞的增殖和凋亡情况,Western blot检测细胞中p-AKT和AKT蛋白的表达。结果:与正常肺上皮BEAS-2B细胞相比,肺腺癌A549细胞和肺鳞癌SK-MES-1细胞中DJ-1蛋白的相对表达量均显著升高,且SK-MES-1细胞中DJ-1蛋白的表达量高于A549细胞,差异均有统计学意义（P＜0.05）。转染后siRNA DJ-1组细胞中DJ-1蛋白的表达量明显低于对照组（P＜0.05）;与对照组相比,转染24 h后siRNA DJ-1组细胞的吸光值（OD值）变化不显著（P＞0.05）,而转染48 h和72 h后细胞的OD值明显降低（P＜0.05）;转染48 h后,与对照组相比,siRNA DJ-1组细胞的凋亡率显著升高（P＜0.05）,p-AKT/AKT值显著降低（P＜0.05）。SK-MES-1细胞经抑制剂LY294002处理48 h后,细胞的增殖凋亡趋势与下调DJ-1表达的结果相一致。结论:DJ-1在肺癌细胞中高表达,下调其表达能够抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,其作用机制可能与PI3K/AKT信号通路有关。     

CHKA基因沉默对胶质瘤细胞生物学行为的影响及其机制

背景与目的：胶质瘤是颅内常见的原发性恶性肿瘤之一,但发病机制不明,胆碱激酶A（choline kinase A,CHKA）与胶质瘤的恶性程度呈正相关,但具体作用途径尚不清楚。探讨下调CHKA基因的表达对胶质瘤细胞系U87和U251增殖、凋亡和迁移的影响及其作用机制。方法：使用慢病毒感染胶质瘤细胞系U87和U251,同时设置阴性对照组（shNC组）和空白对照组（control组）。为研究磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B,AKT）信号转导通路与CHKA的相互作用,另设DMSO组和LY294002组。采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR）检测CHKA基因mRNA的表达水平,采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）法检测细胞增殖能力,采用流式细胞术检测细胞周期和凋亡,采用transwell实验检测细胞侵袭能力,采用划痕实验检测细胞迁移能力,采用蛋白质印迹法（Western blot）检测胶质瘤细胞中CHKA、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白的水平。结果：Western blot结果显示,与control组和shNC组相比,shCHKA组胶质瘤细胞中p-PI3K、p-AKT和CHKA蛋白水平同步降低（P＜0.05）,PI3K、AKT蛋白水平无明显改变。在使用通路抑制剂后CHKA的表达量在control组和shNC组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。与此同时,shCHKA组胶质瘤细胞的侵袭、迁移能力均弱于control组和shNC组（P＜0.05）,细胞凋亡率明显增加,细胞周期主要停滞于G ₂ 期,细胞增殖明显降低（P＜0.05）。结论：CHKA基因可能是通过调控PI3K/AKT信号转导通路,从而影响胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为,且CHKA对PI3K/AKT信号转导通路的调控是单向的,PI3K/AKT信号转导通路中蛋白水平的降低对CHKA的表达无反馈作用。     

PTEN and phosphatidylinositol 3'-kinase inhibitors up-regulate p53 and block tumor-induced angiogenesis: evidence for an effect on the tumor and endothelial compartment

Previous work from our laboratory demonstrated that PTEN regulates tumor-induced angiogenesis and thrombospondin 1 expression in malignant glioma. Herein, we demonstrated the first evidence that the systemic administration of a phosphatidylinositol 3'-kinase (PI3K) inhibitor (LY294002) has antitumor and antiangiogenic activity in vivo. We show that PTEN reconstitution diminished phosphorylation of AKT, induced the transactivation of p53 (7.5-fold induction) and increased the expression of p53 target genes, p21(waf-1) and insulin-like growth factor binding protein 3 in glioma cells. PTEN and LY294002 induced p53 activity in human brain endothelial cells, suggesting that PTEN and PI3K pathways can suppress the progression of cancer through direct actions on tumor and endothelial cells. The capacity of PTEN and LY294002 to inhibit U87MG or U373MG glioma growth was tested in an ectopic skin and orthotopic brain tumor model. LY294002 inhibited glioma tumor growth in vivo, induced tumor regression, decreased the incidence of brain tumors, and blocked the tumor-induced angiogenic response of U87MG cells in vivo. These data provide evidence that both PTEN and PI3K inhibitors regulate p53 function and display in vivo antiangiogenic and antitumor activity. These results provide evidence that the two tumor suppressor genes, PTEN and p53, act together to block tumor progression in vivo. Our data provide the first preclinical evidence for the in vivo efficacy for LY294002 in the treatment of malignant gliomas.     

水通道蛋白3在表皮生长因子诱导的乳腺癌细胞迁移中的作用机制研究

目的研究水通道蛋白3（aquapofin3,AQm）与表皮生长因子（EGF）诱导的乳腺癌细胞迁移之间的关系,并对其可能的机制进行初步探索。方法采用Westernblot法检测4种乳腺癌细胞MDA—MB-231、T47D、MCF-7、ER—ZR-70中的AQP3与EGFR的表达情况,选取高表达的细胞株进行EGF诱导,观察细胞迁移（划痕愈合实验）及AQP3表达的变化。施加CuSO。（AQm抑制剂）后观察细胞迁移及AQP3表达的变化。为进一步证明EGF通过哪条通路来调节AQF3的表达,采用LY294002（P13K／AKT通路抑制剂）及U1026（MAPK／ERK1／2通路抑制剂）分别进行阻断,观察AQP3的表达变化。结果Western blot检测发现迁移性强的MDA—MB-231细胞具有EGFR和AQP3的高表达。针对此细胞用不同浓度的EGF进行诱导,发现AQ1Y3的反应性表达与伤口愈合程度呈现一致的趋势（r=0．885,P〈0．01）,采用不同浓度的CuSO。对AQP3的表达进行抑制,MDA—MB-231细胞的伤口愈合程度明显下降（r=0．959,P〈0．01）。采用LY294002阻断P13K／AKT通路后,AQm表达下降,而U1026作用后AQP3表达无明显变化。结论在乳腺癌细胞中存在AQP3表达;在EGF诱导的乳腺癌细胞迁移中,AQP3的反应性表达起到重要的作用,而EGF可能通过P13K／AKT通路来调节AQP3的表达。     

肝癌细胞中P13K信号通路对VEGF表达的影响

目的：研究磷脂酰肌醇3-激酶（P13K）信号通路在肝癌细胞血管内皮生长因子（VEGF）表达调控中的作用。方法：体外培养高转移性人肝癌细胞株HCCLM3,分为对照组、P13K特异性抑制剂LY294002浓度5μmol／L组,LY294002浓度10μmol／L及20μmol／L组,处理6小时后,采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术检测VEGF mRNA表达的变化。结果：LY294002可使肝癌细胞HCCLM3的VEGFmRNA的表达下降,且这种抑制作用随着LY294002浓度增大而增大（P〈0．01）,呈现剂量移赖性关系。结论：LY294002可以抑制肝癌细胞株HCCLM3中VEGF的表达,肝癌细胞VEGF的表达调控受P13K信号通路调控。     

NOTCH通路依赖PI3K/AKT通路调控胶质瘤干细胞增殖和自我更新能力

目的 探讨NOTCH通路对胶质母细胞瘤细胞增殖和自我更新能力调控及其潜在机制。方法 体外培养LN-229、U118-MG和A172胶质瘤干细胞球;MTT实验和单细胞成球实验分别检测胶质瘤干细胞增殖和自我更新能力;靶向AKT1慢病毒载体shRNA和PI3K抑制剂LY294002抑制PI3K/AKT信号通路活性,检测NOTCH通路功能是否依赖PI3K/AKT通路;Western blot检测NOTCH通路和PI3K/AKT通路活性;BLISS独立模型评价NOTCH抑制剂DAPT和LY294002的相互作用。结果 LN-229、U118-MG和A172体外培养形成胶质瘤干细胞球;DAPT抑制NOTCH通路活性同时降低PI3K/AKT通路活性,且NOTCH通路对PI3K/AKT通路的调控不依赖于PTEN介导;DAPT抑制胶质瘤干细胞增殖和体外单细胞成球能力;ShAKT1和LY294002抑制PI3K/AKT通路活性,同时显著减弱DAPT对胶质瘤干细胞增殖和体外单细胞成球能力的抑制作用（P<0.05）,DAPT和LY294002联合使用产生拮抗作用。结论 NOTCH通路依赖于PI3K/AKT通路调控胶质瘤干细胞增殖和自我更新能力。     

PTEN activation sensitizes breast cancer to PI3-kinase inhibitor through the β-catenin signaling pathway

Combination therapy is considered a promising therapeutic modality in enhancing treatment efficacy. The phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/AKT signaling pathway is almost universally dysregulated in breast cancer, with specific occurrence of PTEN mutations; thus, it has become an attractive target for cancer treatment. However, the use of single targeted therapeutics against the PI3K/AKT pathway has demonstrated only modest clinical benefits. In this study, recombinant adenovirus-mediated gene transfer of PTEN (AD-PTEN) combined with treatment with LY294002 was utilized to evaluate the effects of suppression of breast cancer cell proliferation. Herein, we show that AD-PTEN significantly enhanced the sensitization of breast cancer cells to LY294002. The 50% inhibitory concentration (IC50) values of LY294002 were significantly decreased to a greater extent in cells transfected with combination therapy. In addition, treatment of AD-PTEN-transfected cells with LY294002 resulted in significantly reduced cell viability and invasion ability compared to single LY294002 treatment. Using western blotting, we found that combination treatment resulted in lower levels of phosphorylated AKTSer473 and GSK-3βSer9 than single treatment with LY294002. Furthermore, we showed a significant decrease in nuclear β-catenin, Fra-1, Tcf-4 and c-Myc by combination treatment. Our results indicate that AD-PTEN sensitization of breast cancer to LY294002 is achieved by increased GSK-3β activity, thus resulting in inhibition of the β-catenin signaling pathway.