鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因转染小鼠黑色素瘤B16F1细胞

目的：探讨基因转移载体脂质体介导转染的鼠粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（mGM-CSF)基因在B16F1细胞的表达动态及表达产物的生物活性。方法：脂质体和质粒DNA复合，转染10^6 B16F1细胞，连续5d换细胞培养液，并检测其中的mGM-CSF含量。采用[^3HTdR]渗入法，测定DA1G细胞和转染后第一天收获的以1：10对倍稀释到1：640的上清液及[^3HTdR]混合培养后，渗入到DA1G细胞的[^3HTdR]量（cpm)，以分析表达产物的生物活性。结果：转染B16F1细胞的mGM-CSF基因得到有效表达。但随着时间的推移，表达由第1天的135ng/ml下降到第5天的42.2ng/ml。渗入到DA1G细胞的[^3HTdR]量（cpm)随上清液的稀释而逐步下降，由1：10稀释度的9371下降到1：640时的3251。和DMEM混合培养的DA1G细胞的[^3HTdR]渗入量（cpm)仅为472。结论：脂质体作为基因转移载体可有效地介导mGM-CSF基因转染B16F1细胞，并获得有生物活性的表达。     

编码hGM-CSF基因的慢病毒包装及表达

目的：构建编码人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)慢病毒载体转染小鼠结肠癌细胞CT26,建立持续高表达hGM-CSF基因的CT26细胞株。方法：采用PCR法获得hGM-CSF DNA片段,插入转移载体L166;用CaCl2法将载体L166－hGM CSF、L205和L311共同转染到慢病毒包装细胞293T中,72h后收集上清液。测定慢病毒的滴度;用ELISA法检测慢病毒感染后的CT26细胞上清液中hGM CSF的表达。结果：通过酶切电泳证实重组转移载体L166-hGM-CSF含有预期的hGM-CSF片段。收集慢病毒转染CT26细胞,滴度达4.69×105IU/ml。ELISA法检测慢病毒转染的CT26细胞上清液中有hGM-CSF的表达超过2个月。终浓度15μg/ml的嘌呤霉素成功筛选出单克隆CT26细胞株。结论：收集的慢病毒能够有效的将其所携带的目的基因导入CT26细胞并使其在细胞中高效持续表达2个月以上。     

重组鼠白细胞介素12与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因联合治疗小鼠B16黑色素瘤

目的：研究重组鼠白细胞介素12（AdCMVIL-12）与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（AdCMVGM-CSF）的腺病毒载体联合应用对B16黑色素瘤的抗肿瘤作用。方法：将B16黑色素瘤细胞接种于C57/BL6小鼠右侧背部皮下后,待瘤体直径达5mm时将荷瘤小鼠随机分为4组,分别为AdCMVIL-12组、AdCMVGM-CSF组、AdCMVIL-12加AdCMVGM-CSF组（联合治疗组）和AdC MVLacZ组（对照组）,每组12只,并于肿瘤组织局部分别多点注射相对应剂量的腺病毒载体,观察各组小鼠肿瘤的生长情况及其诱导的细胞免疫反应,检测各组小鼠血清IL-12和GM-CSF表达水平的变化。结果：病理学观察,联合治疗组肿瘤组织内可见大片凝固性坏死,有大量的淋巴细胞、巨噬细胞浸润。治疗30 d后,联合治疗组肿瘤平均体积为（60.73±11.36 ）mm³,与对照组、AdCMVIL-12组和AdCMVGM-CSF组［分别为（675.18±80.59）、（1 86.91±19.15）和（223.45±23.11）mm³］ 比较差异均有显著性（P>0.01）。同时,AdCMVIL-12与AdCMVGM-CSF联合基因治疗可有效延长IL-12和GM-CSF的表达时间,并且对B16黑色素瘤细胞具有很强的特异性杀伤作用,杀伤率为（69.53 ± 9.20）%。 结论：IL-12与GM-CSF联合基因治疗可增强荷B16黑色素瘤小鼠的抗肿瘤免疫反应,并能有效降低单独应用AdCMVIL-12的毒副作用。     

携带鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因腺病毒载体对B16黑色素瘤的抑制作用

目的 :观察携带鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因腺病毒载体 ( Ad CMVGM- CSF)对B1 6黑色素瘤的致瘤性及抑制作用。方法 :将 B1 6黑色素瘤细胞与 Ad CMVGM- CSF在 37℃、5 %CO2 培养箱中孵育 ( RPMI- 1 640培养基 ) 2 h后注射到 C5 7BL/ 6小鼠右侧背部皮下 ( MOI=5 0 0 ) ,观察 Ad CMVGM- CSF对 B1 6黑色素瘤致瘤性的抑制作用 ;观察瘤内一次注射及二次注射对 B1 6黑色素瘤的抑制作用。结果 :Ad CMVGM- CSF能有效地抑制 B1 6黑色素瘤细胞的致瘤性 ,抑瘤率达 60 %;瘤内一次注射 Ad CMVGM- CSF可延缓肿瘤的生长 ,二次瘤内注射 Ad CMVGM- CSF能够强化抗肿瘤效果。结论 :Ad CMVGM- CSF具有抑制肿瘤生长的作用     

小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的表达、纯化与鉴定

目的构建小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(mGM-CSF)工程菌,通过摸索其变、复性和纯化条件,得到高纯度高比活的重组mGM-CSF蛋白。方法以本实验室构建的hIL-2/mGM-CSF融合蛋白表达载体为模板,PCR扩增mGM-CSF基因,克隆入pET-11c表达载体,转化BL21,构建BL21/pET-11c/mGM-CSF工程菌,用本所专利方法提取包涵体,在含低浓度盐酸胍的复性液中复性,采用镍离子亲和层析纯化。结果工程菌采用TH肉汤培养,32℃、0.1mmol/LIPTG双重诱导,表达量达菌体蛋白总量的60.6%。提取包涵体在含1.5mol/L盐酸胍的谷胱甘肽复性液中复性效果最好,比活达4.2×106U/mg。经过亲和层析一步纯化,目的蛋白纯度达95%,比活与标准品相当。结论构建了高效表达mGM-CSF的工程菌,建立了其复性和纯化工艺,为进一步研究DC、GM-CSF体内抗肿瘤功能奠定了基础,并可为IL-2/GM-CSF双功能分子的生物学功能研究提供对照。     

小鼠骨髓树突状细胞体外扩增方法的建立

目的建立小鼠骨髓树突状细胞(DC)体外大量扩增方法。方法应用粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子联合白细胞介素-4诱导培养小鼠骨髓细胞，应用相差显微镜观察形态学变化，’H-TdR掺入法检测细胞增殖能力，FACS检测细胞表面分了，ELISA检测细胞因子。结果体外诱导培养8天后可获得大量形态学典型的DC，具有强烈的激活同种异体或自体T细胞增殖反应能力。FACS检测表明，扩增的DC表达IaK^b、CDllc、CD80、CD86、ICAM-1分子。DC接受LPS刺激后，可以促使DC成熟，分泌IL-12(p70)、IL-6、TNF-a和IL-1β水平增强。结论小鼠骨髓细胞体外诱导培养，可生成大量功能成熟的DC，为进一步开展DC基础和临床研究打下基础。     

不同刺激因子对树突状细胞未成熟状态影响的实验研究

目的探讨重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)在大鼠体内对树突状细胞(DC)数量及成熟度的影响,为诱导移植免疫耐受提供新途径。方法将Wistar雄性大鼠随机分成3组,对照组,GM-CSF预处理组,G-CSF预处理组。分别在给药的3,5,7,9,11d取脾脏并分离DC。采用流式细胞技术检测DC的数量及未成熟树突状细胞(imDC)及imDC/DC的比值。结果DC数量增长与两组药物刺激时间呈线性关系;两组imDC/DC与刺激时间呈正相关性,其中预处理后的第7d达最大值;两种刺激因子对大鼠体内DC增值的数量不具有统计学差异;两种预处理因素对大鼠体内DC成熟度的表达具有统计学差异。结论GM-CSF或G-CSF在大鼠体内作用时,可增加DC的数量及imDC/DC的比率。提示体内使用G-CSF在促进DC的未成熟状态以及诱导免疫耐受方面可能比GM-CSF更明显。     

小鼠骨髓来源的树突状细胞体外扩增与鉴定

目的改进目前体外大量扩增树突状细胞(DC)的方法,以获得大量高纯度的树突状细胞,从形态学和免疫表型等方面给予鉴定.方法用20 ng/ml重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)诱导小鼠骨髓细胞体外分化为树突状细胞,用相差显微镜观察形态学变化,进行扫描、电镜观察和FACS检测细胞表面分子.结果培养10 d,可获得大量典型DC,经流式细胞仪检测,DC表达表面分子CD11C、CD80、MHCⅡ.结论本实验方法可以获得大量高纯度的树突状细胞.     

腺病毒介导的细胞因子基因转染对小鼠巨噬细胞功能的影响

探讨重组腺病毒介导的细胞因子基因转染对巨噬细胞体外抗肿瘤免疫功能的影响。方法通过重组腺病毒的介导，将白细胞介素４（ＩＬ－４）及巨噬细胞集落刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）基因转染至小鼠腹腔内巨噬细胞，并检测其上清中ＩＬ－４及Ｍ－ＣＳＦ的水平；同时检测基因转染后巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，及其分泌的肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）、ＩＬ－１、一氧化氮（ＮＯ）水平与主要组织相容性抗原复合物（ＭＨＣ）Ⅱ类分子的表达情况。结果基因转染后４小时，巨噬细胞即可表达较高水平的ＩＬ－４和（或）Ｍ－ＣＳＦ，转染后１８小时，巨噬细胞上清中ＩＬ－４水平为９５Ｕ／ｍｌ，Ｍ－ＣＳＦ为３５Ｕ／ｍｌ；转染后巨噬细胞杀伤活性明显升高，两者联合应用并以内毒素脂多糖（ＬＰＳ）协同刺激时，这一升高更为明显；其上清中ＴＮＦ、ＩＬ－１及ＮＯ水平均有不同程度的升高；ＭＨＣⅡ类分子的表达在ＩＬ－４及Ｍ－ＣＳＦ联合转染组有所增强。结论巨噬细胞中ＩＬ－４及Ｍ－ＣＳＦ基因的表达可以增强其抗肿瘤免疫功能。     

含鼠GM-CSF基因的腺病毒载体对荷B16黑色素瘤小鼠免疫功能的影响

目的：研究含鼠GM-CSF基因的腺病毒载体（AdCMVGM-CSF）直接注射荷B16黑色素瘤小鼠瘤体内对小鼠免疫功能的影响。 方法：将B16黑色素瘤细胞（5×10⁶/只）接种于C57/BL6小鼠右侧背部皮下后,将荷瘤小 鼠随机分为2组,每组12只,待瘤体直径达5 mm时分别注射AdCMVGM-CSF、AdCMVLacZ （5×10⁸ PFU/只）,检测每组小鼠的免疫功能及其对B16黑色素瘤的抑制作用。 结果：AdCMVGM-CSF实验组小鼠注射后第10天,荷瘤鼠血清中GM-CSF水平［(1 563.72±136.58)ng·L^-1］高于对照组（P<0.01）,肿瘤组织周围的CD8＋ T细胞表达明显增强。 结论：AdCMVGM-CSF可增强荷B16黑色素瘤小鼠的抗肿瘤免疫反应,具有抑制肿瘤生长的作用。     

狼疮性肾炎外周血粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体表达的研究

目的:探讨粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体(GM-CSFR)在狼疮性肾炎(LN)发病中的意义.方法:运用流式细胞术对32例LN病人、15例正常人的外周血GM-CSFR水平进行测定分析.结果:LN外周血单核细胞GM-CSFR表达水平显著高于正常对照组(P＜0.01);外周血中性粒细胞GM-CSFR表达水平两组差异不显著(P＞0.05).外周血单核细胞GM-CSFR表达水平与蛋白尿程度呈正相关.结论:GM-CSFR与系统性红斑狼疮的发病及LN的肾脏损害密切相关.     

小剂量G-CSF联合GM-CSF动员外周血CD34+细胞

目的 探讨小剂量粒单巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)联合粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员外周血干细胞的效率。方法 20例成人恶性血液病按统计学配对方法等分为2组。非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)患者化疗方案为环磷酰胺2.0 g/d,静脉滴注,第1~2天,足叶乙甙0.2 g/d,静脉滴注,第1~3天;急性非淋巴细胞白血病(ANLL)患者用阿糖胞苷2.0 g/d,静脉滴注,第1~3天,足叶乙甙用法同NHL。当白细胞低于1.0×10⁹/L时研究组10例应用GM-CSF 2.5 μg/d·kg·b.w.联合G-CSF 2.5 μg/d·kg·b.w.;对照组单用G-CSF 5 μg/d·kg·b.w.,全部皮下注射5~6 d。白细胞5.0×10⁹/L以上时应用CS-3000 pluse分离外周血单个核细胞,流式细胞术计数CD34⁺细胞。结果 产品细胞分类计数单个核细胞占95%~99%,在研究组CD34⁺细胞平均采集9.4(8.4~10.2)×10⁶/kg·b.w.,CFU-GM 42.4(21.9~72.8)×10⁴/kg·b.w.,对照组平均采集CD34⁺细胞4.8(4.1~8.3)×10⁶/kg·b.w.,CFU-GM 28.1(7.1~60.2)×10⁴/kg·b.w.,2组差异显著(P<0.05)。副作用2组相似。结论 恶性血液病患者化疗后应用G-CSF联合GM-CSF动员CD34⁺细胞的效果优于单用G-CSF。     

慢病毒介导的hGM—CSF修饰的肿瘤疫苗免疫活性研究

目的构建编码人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（humangranulocyte—macrophage colony stimulating factor，hGM—CSF）的慢病毒载体，研究编码hGM—CSF的慢病毒载体对树突状细胞（dendritic cell，DC）疫苗抗肿瘤活性的增强作用。方法以质粒pORFhGM—CSF为模板，采用PCR方法扩增出hGM—CSF基因片段；通过BamHI和XhoI限制性内切酶位点。将hGM—CSF基因定向克隆到慢病毒连接载体L166中构建重组载体L166-hGM—CSF。将重组载体L166-hGM—CSF和包装载体L205以及包膜载体L311共同转染慢病毒包装细胞293T，72h后收集病毒上清液获得编码hGM—CSF的慢病毒颗粒Lenti—hGM—CSF。从脐血中分离出单核细胞，rhGM—CSF、rhIL-4和α—TNF诱导获得DC，通过相差显微镜和流式细胞仪鉴定。应用反复冻融法制备可溶性肿瘤抗原，分别将负载肿瘤抗原的DC疫苗和慢病毒Lenti—hGM—CSF感染的负载肿瘤抗原的DC疫苗与T淋巴细胞共同培养，MTT方法检测并比较两者所诱导的CTL对反应细胞的体外杀伤活性。结果编码hGM—CSF的慢病毒载体L166-hGM—CSF成功构建，获得了编码hGM—CSF的慢病毒。该慢病毒的Hela细胞上清液中hGM—CSF的表达明显高于未感染者。从脐血中分离出的DC，显示其高表达CD80（87.2％）和CD86（92．8％），而单核细胞标志CD14的表达率较低（3．56％o慢病毒介导的分泌hGM—CSF的树突状细胞肿瘤疫苗刺激同种T淋巴细胞增殖的能力和抗肿瘤活性较普通DC疫苗明显增强（P〈0．01）。结论本实验制备的慢病毒Lenti—hGM—CSF感染反应细胞后能够显著增强DC肿瘤疫苗刺激同种T淋巴细胞增殖的能力及其诱导的CTL细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，为hGM—CSF修饰的DC肿瘤疫苗的临床应用提供了一定的实验依据。     

BALB/c小鼠黑色素瘤B 16移植肿瘤模型的建立

[目的]建立宜于进行早期观察及测量的小鼠黑色素瘤模型.[方法]将不同数量的处于对数生长期的B16细胞株黑色素瘤细胞接种于BALB/c小鼠背部及足垫皮下,建立移植肿瘤动物模型.观察小鼠肿瘤的生长特点,应用病理学和免疫组织化学染色方法进行鉴定,归纳总结接种细胞数与肿瘤发生率的关系及肿瘤生长对小鼠生活状态的影响.[结果]接种5d后BALB/c小鼠皮肤浅表部位相继出现黑色的点或线状改变,发展为结节状改变直至肿瘤破溃、出血、死亡或破溃、出血、结痂、愈合,部分小鼠出现肿瘤消退.在接种细胞数大于5×105个时BALB/c小鼠的肿瘤模型全部建立成功.[结论]B16细胞株黑色素瘤细胞接种于BALB/c小鼠的肿瘤模型成功率与接种细胞数成正比,它具有建立肿瘤模型成功率高,观察及测量方便等优点,接种部位以背部皮下为宜.     

Serum profiles of circulating granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in acute myocardial infarction and relation with post-infarction left ventricular function

METHODS Patients ThirtypatientsofAMI[(STsegmentelevations≥2mm intwoormorecontiguous,significantreleaseof creatininekinaseisoenzyme(CK MB),troponinT (TNT)]wereselectedaccordingtothefollowingcriteria: ①takingnoanti inflammatoryandimmunosuppressive drugswithinthepreceding2weeks;②nopreviousAMI orpercutaneoustransluminalcoronaryangioplastyor coronaryarterybypassgraftsurgery;③noacuteor chronicinfection;④noliver,pulmonarydiseaseorrenal failure;⑤nothyroidorcollagendiseaseorBiochemicalme…     

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子在急性肺损伤发病机制中的研究进展

急性肺损伤（ALI）是机体炎症介质过度表达导致的自身破坏性反应的结果。最近研究表明，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）与肺泡巨噬细胞功能、肺宿主防御反应、表面活性物质稳态有关。在ALI发病机制中，GM-CSF能影响炎症和细胞凋亡调控及其信号转导途径。作者对此作一综述。     

重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子栓在大鼠和Beagle犬中的免疫原性

目的在大鼠和Beagle犬阴道给予重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,rhGM-CSF)栓3个月的长期毒性试验中,检测给药后动物血清中是否产生抗rhGM-CSF抗体和抗体的中和活性。方法 SD雌性大鼠设rhGM-CSF栓0(赋形剂对照组)、0.24、0.96和3.84 mg/kg 4个组;Beagle雌性Beagle犬设0(赋形剂对照组)、0.07、0.28和1.12 mg/kg 4个组。每天给药1次,连续3个月,恢复期1个月。间接ELISA法检测动物血清中抗rhGM-CSF的结合抗体,TF-1细胞/MTT比色法检测抗体的中和活性。结果①大鼠从给药1个月起至恢复期结束,3个剂量组动物血清中均能检测到抗rhGM-CSF的抗体;低剂量和中剂量2组间动物血清的抗体滴度差异无统计学意义,但与高剂量组相比低剂量组和中剂量组差异有统计学意义。体外测活法显示,各剂量组在给药1个月后有部分动物产生中和抗体;给药3个月或恢复期1个月时全部受检动物均产生中和抗体。②Beagle犬的各剂量组动物血清中均未检测到抗rhGM-CSF的抗体。结论 rhGM-CSF栓经阴道局部连续给予3个月的长期毒性试验中,啮齿类动物大鼠血清中各剂量组均产生抗rhGM-CSF的抗体,且抗体可中和GM-CSF的生物活性;而非啮齿类动物Beagle犬血清中则未检测到抗rhGM-CSF抗体。rhGM-CSF栓对大鼠具有免疫原性。