大鼠心肌蛋白双向凝胶电泳技术的建立

[目的]建立大鼠心肌蛋白质组研究的双向凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoresis,2-DE）技术。[方法]提取SD大鼠心肌总蛋白,以载体两性电解质pH梯度等电聚焦为第一向电泳,垂直SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳为第二向电泳,完成2-DE,考马斯亮蓝染色后扫描获取凝胶图像并用PDQuest软件进行分析。对2-DE中关键环节,如调节pH3~10和pH4~6载体两性电解质的比例、样品离心处理、增加等电聚焦电压和离子强度等方面进行优化。[结果]通过样品处理后离心除去多糖成分,pH3~10和pH4~6载体两性电解质的比例调至1∶2,改变电泳条件,成功消除横向拖尾、分辨率较高的心肌蛋白双向电泳图谱。每张图谱可检测到超过150个蛋白质点,匹配率大于55%。[结论]建立了SD大鼠心肌蛋白的双向凝胶电泳分析技术,该方法可行、重复性好,所提供的方案具有一定参考意义。     

尿蛋白质组双向电泳的样品制备

目的 建立与优化非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者尿液全蛋白双向凝胶电泳技术(2-DE).方法 采用4种不同的方法制备尿液蛋白质样品,以非线性预制胶条进行第一向等电聚焦,12%的SDS-PAGE进行第二向电泳,银染显色.结果 以乙腈沉淀蛋白后经过超滤制备的蛋白质样品,在300μg上样量时,可获得图像清晰、分辨率高、重复性好的双向电泳图谱.结论 建立了较稳定的非小细胞肺癌患者尿蛋白质组双向凝胶电泳技术.     

重症肌无力胸腺组织蛋白质组双向电泳方法的建立

目的:建立和优化重症肌无力(MG)胸腺组织蛋白质组双向电泳技术方法.方法:提取MG患者(n=3)增生型胸腺组织蛋白,以固相pH梯度胶条做第一向等电聚焦电泳,SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳为第二向.在以上过程中分别对蛋白提取、等电聚焦程序(A、B、C、D)和凝胶染色方法等各个实验环节进行控制和优化,利用PDQuest 7.1.1软件分析获得的二维凝胶图像.结果:①采用一步法提取胸腺组织蛋白质,第一向等电聚焦采用7cm IPG胶条,聚焦程序选择B,硝酸银染色.3例标本重复4次,共获12幅二维凝胶图像.随机选取1例标本的2幅图像,利用软件对2幅中的蛋白点进行匹配,匹配率为82.1%;3份样品共12幅凝胶图像的对比,获得3个共同存在的标志蛋白点,相对分子质量和等电点分别为:A点(82 700,7.0)、B点(50 700,5.76)和C点(33 300,5.02).②进一步优化上述实验条件,选择1例标本,采用两步法提取胸腺组织蛋白质,选用17 cm IPG胶条,聚焦采用程序D,考马斯亮蓝染色,获得的二维凝胶图像与一步法(其他条件相同)比较.一步法可检测到蛋白质点326个,两步法可检测到562个蛋白点.结论:①建立了MG胸腺组织蛋白质组提取的方法.采用两步法可以更有效地提取胸腺组织蛋白质组.②利用优化后的实验方法,获得了MG胸腺组织蛋白二维凝胶图像,为开展MG胸腺组织蛋白质组学研究打下了基础.     

肝癌细胞株HepG2蛋白双向电泳条件的优化

目的优化双向电泳条件,以获得高分辨率、重复性好的蛋白质双向电泳图谱。方法比较不同的细胞总蛋白质裂解液、不同的蛋白上样量、不同的等电聚焦电泳条件,选择最佳双向电泳条件。结果确定了适合肝癌细胞株HepG2的最佳细胞总蛋白质裂解液5、最佳蛋白上样量650μg和最佳等电聚焦电泳条件为最大电压34kV、30min。结论优化双向电泳方法获得的肝癌细胞株HepG2蛋白质双向电泳图谱高分辨率、重复性好。     

3种方法提取胸腺组织蛋白双向电泳纯化结果比较

目的:选择合适的胸腺组织蛋白质提取和纯化方法.方法:分别采用组织裂解液法、丙酮沉淀法和蛋白纯化试剂3种方法提取7例重症肌无力患者胸腺组织蛋白质,上样量为1 mg蛋白,以17 cm pI 3～10 固相pH梯度胶条做第一向等电聚焦,SDS-PAGE垂直电泳为第二向进行双向电泳(2-DE),考马斯亮蓝染色,图像分析软件分析电泳图谱.结果:利用蛋白纯化试剂法提取的胸腺组织蛋白2-DE凝胶图像纵条纹、横条纹以及背景都明显减少,获得蛋白点数量较其他2种方法增加(P均＜0.05).结论:采用蛋白纯化试剂法提取胸腺组织蛋白,能够获得较好2-DE凝胶图像,为胸腺组织蛋白质组学的研究打下基础.     

先天性巨结肠组织蛋白质组成分的双向凝胶电泳分析

目的 分析先天性巨结肠(HD)狭窄段及正常段肠管组织双向凝胶电泳的蛋白质表达图谱,寻找差异表达的蛋白质.方法 采用固相pH梯度双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2-DE)分离20例HD患者配对狭窄段及正常段肠管组织的总蛋白,银染显色,ImageMaster 2D Platinum 6.0软件分析差异表达的蛋白质点.结果 获得了重复性较好的2-DE银染图谱.图像分析显示,狭窄段和正常段肠管组织凝胶的平均匹配率分别为78.1%和86.7%.差异分析共获得103个差异表达的蛋白质点.结论 采用2-DE分离HD肠管组织的总蛋白可获得重复性较好的结果.获得的差异蛋白质点为寻找HD早期诊断的分子标记物提供了基础资料.     

鼻咽癌细胞株HNE-1蛋白质二维电泳图谱的建立

目的建立及优化聚丙烯酰胺二维凝胶电泳技术,结合分析软件,全面展示鼻咽癌细胞株HNE-1的蛋白质表达谱,为进一步开展鼻咽癌的蛋白质组学研究奠定了基础。方法大规模培养HNE-1细胞,利用优化的蛋白质抽提技术获得HNE-1细胞的总蛋白。选用线性及非线性的不同pH梯度固相(IPG)干胶条对细胞总蛋白等电聚焦以及聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳,初步建立了HNE-1细胞株总蛋白质的二维电泳(2-DE)图谱。结果采用不同pH梯度范围的IPG胶条和优化的2-DE技术能够有效展示HNE-1细胞全蛋白质表达谱。结论重叠窄pH梯度范围的IPG胶条提高了2-DE中蛋白质的分离效果。     

结肠癌组织蛋白质组成分的双向凝胶电泳分析

目的 分析结肠癌病人癌组织、癌旁组织及正常结肠黏膜组织双向凝胶电泳的蛋白质表达图谱,寻找差异表达的蛋白质.方法 采用固相pH梯度双向凝胶电泳分离结肠癌病人配对癌组织、癌旁组织及正常结肠黏膜组织的总蛋白,银染显色,PDQuest 2DE软件分析差异表达的蛋白质点.结果 获得了重复性较好的双向凝胶电泳银染图谱.图像分析显示,3组胶的平均匹配率分别为:癌组织87.3%、癌旁组织80.3%、正常结肠黏膜组织84.0%.等电聚焦方向上的平均偏差为(1.16±0.29)mm,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方向上的平均偏差为(1.00±0.38)mm.差异分析共获得164个差异表达的蛋白质点.结论 双向凝胶电泳分离结肠癌组织的总蛋白可获得重复性较好的结果.获得的差异蛋白质点为寻找结肠癌早期诊断的分子标记物提供了理论依据.     

鼻息肉的2-DE图谱建立和蛋白质组学分析

目的:建立鼻息肉及鼻黏膜双向凝胶电泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2-DE)图谱,鉴定差异表达蛋白质。方法:收集鼻息肉及鼻黏膜样本各7例,采用固相pH梯度2-DE,凝胶银染,扫描图像,ImageMaster2-DE软件比较分析等方法,识别差异表达蛋白质,通过质谱分析得到相应肽质指纹图谱(peptide mass fingerprint,PMF),采用PeptIdent软件查询Swiss-Protand TreMBL数据库,鉴定差异表达蛋白质。结果:建立了鼻息肉和鼻黏膜蛋白质的2-DE图谱。鼻息肉和鼻黏膜3块凝胶的平均蛋白质点数分别为825±78和936±62;平均匹配点数为682±96和821±78,匹配百分率为82.7%和87.7%;同一鼻息肉的3块胶在蛋白质点位置上有较好的重复性,不同胶间蛋白质点在等电聚焦(IEF)方向偏差为(1.06±0.14)mm,在SDS-PAGE方向偏差为(1.45±0.21)mm。比较分析两种组织各7例样本的2-DE图谱,鼻息肉和鼻黏膜蛋白质点数为1458个和1617个,平均匹配点数为1026个。质谱分析差异蛋白质点40个,获取34张PMF,查询数据库鉴定出蛋白质24个。结论:建立了分辨率高和重复性好的鼻息肉及鼻黏膜2-DE图谱,识别鉴定出一些与鼻息肉病变相关的蛋白质。     

胃腺癌组织蛋白质双向电泳图谱分析

目的　利用蛋白质组学方法建立分辨率高和重复性好的人胃腺癌组织及其正常胃黏膜组织的双向凝胶电泳图谱 ,并分析其差异表达的蛋白质 ,以期用于早期诊断。方法　采用固相pH梯度(immobilizedpHgradient,IPG)双向凝胶电泳 (two -dimensionalgelelectrophoresis ,2 -DE)分离人胃腺癌组织及正常胃黏膜组织的总蛋白质 ,凝胶经银染显色后 ,ImagingMaster 2D图像分析软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质。结果　 ( 1 )得到了分辨率较高、重复性较好的人胃腺癌组织和正常胃黏膜组织的双向凝胶电泳图谱 ,癌组织和正常胃黏膜组织凝胶的平均蛋白质点数分别为 1 0 4 9± 67和 1 0 97± 73,平均匹配的点数分别为 835± 48和 95 3± 5 6,匹配率分别为 79.6%和 86.7% ;同一组织凝胶在蛋白质点位置上有较好的重复性 ,不同凝胶间蛋白质点在等电聚焦 (isoelectricfocusing ,IEF)方向的偏差是 0 .873±0 .1 2 5mm ,在十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sodiumdodecylsulfate -polyacrylamidegelelectrophore sis ,SDS -PAGE)方向上的偏差为 1 .0 2 5± 0 .2 1 3mm。 ( 2 )通过比较分析 5例胃腺癌组织及正常胃黏膜组织的双向凝胶电泳图谱 ,得到平均匹配蛋白质点数为 769± 45 ,差异表达蛋白质点数为 81 ,其中 1 7个点仅     

双向电泳分析失神经支配大鼠腓肠肌蛋白的表达变化

目的:建立骨骼肌蛋白分离的双向电泳(2-DE)技术体系,寻找失神经支配骨骼肌与正常骨骼肌蛋白的表达差异。方法:建立失神经腓肠肌模型,提取腓肠肌总蛋白,进行第一向等电聚焦(IEF)和第二向十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术分离总蛋白,使用PDQuest软件对凝胶图像进行分析,并测量了凝胶蛋白斑点在IEF和SDS-PAGE方向上的位置偏差。结果:失神经组和正常组腓肠肌组织3块凝胶的平均蛋白质点数分别为560±16和545±13,平均匹配点数分别为471±19和447±17,匹配率达84.1%和82.1%。对比分析了两种腓肠肌组织的双向电泳图谱发现,平均匹配点数为445±8;发现在失神经支配后有80个点发生了明显而稳定的质和量(大于10倍或小于0.1倍)的改变。不同凝胶间蛋白质点在IEF方向的偏差为(1.203±0.763)mm,在SDS-PAGE方向上的偏差为(1.062±0.529)mm。结论:失神经组和正常组腓肠肌的双向电泳图谱存在明显差异,失神经后表达下调的蛋白可能与维持肌肉正常功能相关,而表达上调的蛋白则可能与肌萎缩的发生过程相关。     

血清双向凝胶电泳体系的建立

目的:建立血清双向凝胶电泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2-DE)技术体系.方法:用Proteoprep blue albumin depletion kit将血清中高峰度蛋白去除.预冷丙酮沉淀蛋白质后,加入样品溶解液充分溶解,进行等电聚焦电泳(isoelectric focusing,IEF)和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel elecrophoresis,SDS-PAGE),行硝酸银染色后,运用ImageMaster软件行初步分析.结果:通过调整,优化2-DE技术条件,建立了稳定的2-DE技术.结论:建立了相对稳定的人血清蛋白质2-DE技术,其稳定性、重复性好,为开展疾病蛋白质组学的研究奠定了基础.     

双向电泳技术分析大鼠星形细胞和C6细胞的蛋白差异

目的：建立大鼠星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的双向电泳（2-DE）技术体系,寻找星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的蛋白表达差异。方法：提取大鼠星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞中的总蛋白,进行第一向等电聚焦（IEF）和第二向十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离总蛋白,GS-800获得凝胶图像,并测量不同凝胶间蛋白斑点在IEF和SDS-PAGE方向上的位置偏差,使用PDQuest7.3软件对凝胶图像进行分析,找出星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的差异表达蛋白。结果：星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的蛋白表达谱上,分别检测到523±16和550±20个蛋白点,平均匹配点数为452±18和472±21,匹配率达86.4%和85.8%,不同凝胶间蛋白质点在IEF方向的偏差为（0.67±0.48）mm,在SDS-PAGE方向上的偏差为（0.73±0.56）mm,对比分析了星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的2-DE图谱,发现有24个点发生了明显的表达变化（P〈0.01）,在星形胶质细胞中高表达的点有8个,在C6胶质瘤细胞中高表达的点有14个,星形胶质细胞中没有发现表达的点有2个。结论：建立了大鼠星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的双向电泳技术体系,发现两者的双向电泳图谱存在明显差异,C6胶质瘤细胞中表达上调以及星形胶质细胞中没有发现表达的蛋白可能与肿瘤的发生,神经干细胞的迁移有关,表达下调的蛋白可能与抑制肿瘤的发生有关。     

HeLa细胞蛋白质组双向电泳技术的建立

目的:建立和优化HeLa细胞蛋白质组分析所需的样品处理方法和双向电泳技术.方法:用三种不同配方的裂解液提取HeLa细胞中的蛋白质,进行双向凝胶电泳,用Amersham ImageMaster VDS-CL型凝胶成像系统获取凝胶图像,以PDQuest(7.4.0)软件进行比较分析.结果:联合使用硫脲和尿素有利于蛋白质的提取,增加碱性蛋白点的检出数量;广谱蛋白酶抑制剂的使用可大大增加双向电泳可检出的蛋白点数,同时使可检出的碱性蛋白点明显增加.结论:本文建立了HeLa细胞双向电泳分析方法,提高了2-DE图谱中蛋白位点的分辨率和重复性,获得了较为理想、清晰的双向电泳图谱,为其蛋白质组学进一步研究奠定了基础.     

双向电泳技术分析大鼠快慢肌蛋白的表达差异

目的：建立骨骼肌蛋白分离的双向电泳（2-DE）技术体系，分析趾长伸肌与比目鱼肌中快慢肌蛋白的表达。方法：提取大鼠趾长伸肌和比目鱼肌的总蛋白，定量，然后进行第一向等电聚焦0EF）和第二向十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术分离总蛋白，GS-800获得凝胶图像，并测量不同凝胶间蛋白斑点在IEF和SDS-PAGE方向上的位置偏差，使用PDQuest7．3软件对凝胶图像进行分析，找出趾长伸肌与比目鱼肌蛋白表达的差异。结果：在趾长伸肌和比目鱼肌组织的蛋白表达谱上，分别检测到680±19和660±27个蛋白点，平均匹配点数为590±13和580±17，匹配率达86．7％和87．8％，不同凝胶间蛋白质点在IEF方向的偏差为（0．51±0．48）mm，在SDS-PAGE方向上的偏差为（0．53±0．42）mm，对比分析趾长伸肌和比目鱼肌组织的2-DE图谱，发现有27个点存在明显的表达差异，在比目鱼肌中高表达的点有12个，在趾长伸肌中高表达的点有15个。结论：建立了骨骼肌蛋白分离的双向电泳技术体系，发现成年大鼠趾长伸肌和比目鱼肌的双向电泳图谱相似，但是有部分蛋白质点存在表达差异．这些差异表达的蛋白，可能与快慢肌本身的生理特性相关。     

人类精子蛋白质组分析的双向蛋白电泳技术研究

目的 :利用人类精子蛋白质组分析的双向蛋白电泳技术 (2 DE)建立正常精子的蛋白质图谱。方法 :比较不同蛋白质提取方法和上样量、不同的第一向等点聚焦方法所得图谱的差别 ,并初步建立人类正常精子的蛋白质图谱。结果 :用蛋白质提取方法一制得的样本电泳后有 6 70～ 70 3个蛋白质斑点 ;方法二所得样本电泳后仅有 194～ 2 10个蛋白质斑点。蛋白质提取方法一所制样本进行载体两性电解质pH梯度 SDS电泳技术 (ISO DALT)得到约 2 80～ 30 0个蛋白质斑点 ,用固相pH梯度 SDS电泳技术 (IPG DALT)得到多达 70 0个蛋白质斑点。结论 :采用蛋白质提取方法一制备精子蛋白质进行IPG DALT电泳的方法适用于建立精子全细胞蛋白质谱。     

人类精子蛋白质组分析的双向蛋白电泳技术研究

目的：利用人类精子蛋白质组分析的双向蛋白电泳技术（2-DE）建立正常精子的蛋白质图谱。方法：比较不同蛋白质提取方法和上样量、不同的第一向等点聚焦方法所得图谱的差别,并初步建立人类正常精子的蛋白质图谱。结果：用蛋白质提取方法一制得的样本电泳后有670-703个蛋白质斑点;方法二所得样本电泳后仅有194-210个蛋白质斑点。蛋白质提取方法一所制样本进行载体两性电解质pH梯度-SDS电泳技术（ISO-DALT）得到约280-300个蛋白质斑点,用固相pH梯度-SDS电泳技术（IPG-DALT）得到多达700个蛋白质斑点。结论：采用蛋白质提取方法一制备精子蛋白质进行IPG-DALT电泳的方法租用于建立精子全细胞蛋白质谱。     

不同分化喉鳞状细胞癌蛋白质组差异表达的研究

目的 研究不同分化程度喉鳞状细胞癌黏膜组织蛋白质组的差异表达.方法 用固相pH梯度双向凝胶电泳分离不同分化程度喉癌黏膜组织总蛋白质,行考马斯亮蓝染色,Image Master 2D软件分析所获得的双向凝胶电泳图谱,找出差异表达的蛋白质点.结果 获得分辨率和重复性均较好的双向凝胶电泳图谱,发现13种蛋白质与喉癌分化密切相关.其中有7种蛋白质在高分化喉癌组织中表达上调,6种蛋白质表达明显下调.结论 利用固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离不同分化喉鳞状细胞癌黏膜组织总蛋白质,建立了重复性较强的不同分化喉鳞状细胞癌黏膜组织蛋白质组表达图谱,且两者蛋白质的表达明显不同,可能与喉癌不同分化程度的发病机制有关.     

紫杉醇耐药与敏感细胞的差异表达蛋白分析

目的 比较人肺腺癌细胞系A549与肺腺癌紫杉醇耐药细胞系A549-Taxol的差异表达蛋白.方法 提取A549和A549-Taxol总蛋白,应用双向凝胶电泳技术(2-DE)分离,ImageMaster 5.0软件分析并筛选出两者间差异表达的蛋白点,质谱分析加以鉴定.结果 获得分辨率高且重复性好的肺腺癌耐紫杉醇细胞系及亲代细胞系2-DE图谱.ImageMaster软件分析差异大于2倍的蛋白质点共有80个,其中33个在耐药细胞系中上调,47个下调.质谱分析鉴定出19种差异表达蛋白,其中A549-Taxol中上调蛋白11种,涉及细胞骨架蛋白、代谢酶类、分子伴侣和信号转导相关蛋白质.结论 应用2-DE技术整体展示了紫杉醇耐药细胞系及敏感细胞系的蛋白表达谱,质谱法鉴定的差异蛋白为进一步从多因素角度研究紫杉醇耐药机制提供了新线索.