9 ku颗粒溶素真核表达质粒的构建与分泌表达

目的:构建能分泌表达人9 ku颗粒溶素(granulysin)的真核质粒,为下一步利用颗粒溶素基因治疗肿瘤奠定基础.方法:以含有颗粒溶素cDNA序列的质粒为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得含分泌肽编码基因的9 ku的颗粒溶素基因片段后,定向插入真核表达载体pBudCE4.1中,获得重组表达质粒pBudCE4.1-S9K,通过PCR,双酶切及插入片段序列测定对重组质粒进行鉴定;采用RT-PCR,免疫细胞化学与Dot-ELISA法检测pBudCE4.1-S9K在RAW264.7细胞的瞬时表达与分泌.结果:成功扩增出含分泌肽编码基因的9 ku的颗粒溶素基因片段;经酶切,PCR及测序鉴定证明得到读码框正确的重组质粒;转染细胞证实可分泌表达9 ku颗粒溶素.结论:成功构建能分泌表达9 ku颗粒溶素真核表达质粒pBudCE4.1-S9K.     

人颗粒溶素活性肽和小鼠白细胞介素-12基因真核穿梭共表达质粒的构建与真核表达

目的 构建含分枝杆菌复制子Orim,可分泌表达人颗粒溶素相对分子质量为9 000的活性肽与小鼠白细胞介素-12(mIL-12)的真核穿梭共表达质粒,并检测其蛋白表达.方法 以含有颗粒溶素cDNA序列的质粒为模板,通过PCR扩增获得相对分子质量为9 000的颗粒溶素活性肽基凶片段后,定向插入真核表达载体pBudCE4.1中,获得重组表达质粒pBudCE4.1-S9K,经双酶切及插入片段测序对质粒进行鉴定.同时,将mIL-12哑克隆入pBudCE4.1另一多克隆位点,构建真核共表达质粒pBudCE41-S9K/mIL-12.然后,将分支杆菌复制子Orim亚克隆入真核共表达质粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12,形成穿梭共表达质粒.采用RT-PCR、免疫细胞化学法,检测颗粒溶素活性肽在RAW264.7细胞的瞬时表达与分泌.ELISA检测mIL-12的表达.结果 酶切、PCR及测序鉴定证实,颗粒溶素活性肽基因插入片段正确;RT-PCR和免疫细胞化学检测表明其可以在细胞中瞬时表达;ELISA检测细胞培养上清有mIL-12表达.结论 成功构建穿梭共表达质粒pBM9,并能体外表达.     

Cystatin M,Cathepsin B双基因共表达载体的构建及鉴定

目的:构建半胱氨酸蛋白酶抑制剂M(Cystatin M,CST6),反义组织蛋白酶B(CB)单/双基因共表达载体.方法:从人胎盘组织中用TRIzol试剂提取总RNA,巢式PCR扩增人Cystatin M基因全长cDNA片段,RT-PCR扩增CB基因cDNA片段.将扩增的Cystatin M插入到真核表达载体pBudCE4.1的Hind Ⅲ位点上,将CB插入到带有及不带Cystatin M基因真核表达载体pBudCE4.1的Xho I位点上.构建pBudCE4.1/CST6,pBudCE4.1/CB单基因表达载体及pBudCE4.1/CST6-CB双基因共表达载体.利用PCR、酶切分析和序列测定方法进一步验证所构建质粒的准确性.结果:人CST6,CB的RT-PCR扩增产物片段大小分别为447,257bp.对pBudCE4.1/CST6,pBudCE4.1/CB,pBudCE4.1/CST6-CB进行测序分析证实CST6,CB序列均正确,酶切鉴定及PCR结果显示,CST6,CB的大小分别为447,257 bp且已克隆至pBudCE4.1中.结论:成功构建了pBudCE4.1/CST6,pBudCE4.1/CB,pBudCE4.1/CST6-CB表达载体,为深入探讨2种基因在肿瘤侵袭中的生物学作用机制奠定了基础.     

锌离子依赖的金属蛋白酶-1体内抑制分枝杆菌的抗原处理

目的：在小鼠体内观察卡介苗的锌离子依赖的金属蛋白酶-1（Zinc metalloprotease-1,Zmp1）对结核分枝杆菌抗原PPE68处理的影响。方法：6～8周龄BALB/c小鼠随机分为5组,分别为pBudCE4.1空质粒对照组（n=7）、表达PPE68抗原肽的pBud－CE4.1-PPE68p质粒组（n=9）、表达PPE68抗原的pBudCE4.1-PPE68质粒组（n=9）、PPE68抗原和Zmp1共表达的pBudCE4.1-PPE68-Zmp1质粒组（n=10）及PPE68抗原肽和Zmp1共表达的pBudCE4.1-PPE68p-Zmp1质粒组（n=8）。各组质粒电转化减毒沙门菌株SL7207构建相应的重组沙门菌。以灌胃方式将各组沙门菌免疫小鼠3周。收集小鼠血液和肺肠灌洗液,采用ELISA法测定血清中IFN-γ、IL-12含量及肺与肠道sIgA的含量;分离培养脾细胞,用CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖情况。结果：与PPE68抗原组相比,PPE68和Zmp1共表达组的IFN-γ（117.29±16.86,P=0.034）、IL-12（40.46±7.11,P=0.0037）、淋巴细胞刺激指数SI（3.30±0.49,P=0.004）均降低;与PPE68抗原肽组相比,PPE68抗原肽和Zmp1共表达组相应因子含量下降不明显,IFN-γ（132.75±28.40,P=0.070）、IL-12（55.43±11.78,P=0.198）、SI（4.70±1.57,P=0.124）。结论：卡介苗的Zmp1影响结核分枝杆菌抗原PPE68的处理过程,这可能是影响BCG免疫效果的重要原因。     

IL-35重组卡介苗的构建及鉴定

目的构建分泌性表达白细胞介素（IL）-35真核载体pZM03（pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM）-重组卡介苗（BCG）。方法在化学合成的IL-35基因片段中插入pBudCE4.1/GLS/OriM,将合成后序列插入到IL-12真核共表达载体pBudCE4.1/GLS/IL12/OriM的质粒酶切回收产物pBudCE4.1/GLS/OriM中,构建表达IL-35的穿梭/共表达质粒重组质粒pZM03（pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM）,再以重组质粒电转化到BCG,构建表达IL-35和BCG的重组pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM-BCG。结果重组质粒pZM03（pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM）经PCR扩增、测序鉴定,以及在CHO 293T细胞中表达产物的Western blotting检测,从转录和翻译水平对目标基因产物进行检测验证,pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM-BCG在细胞水平经抗酸染色验证,证实基因IL-35正确插入载体pBudCE4.1/GLS/OriM中,且pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM-BCG构建成功。结论重组质粒pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM-BCG可正确表达IL-35,为进一步研究IL-35功能及其应用价值奠定了良好的基础。     

弓形虫重组质粒pBudCE4.1-AMA1-ROP18的构建及鉴定

目的 构建pBudCE4.1-AMA1-ROP18 DNA重组质粒,并对其进行克隆及鉴定。方法 采用PCR法对目的基因进行扩增,构建pBudCE4.1-AMA1-ROP18重组质粒,转染至人包皮成纤维细胞（HFF）进行表达并用SDS-PAGE和β-actin进行鉴定。 结果 经测序、双酶切和PCR鉴定,重组质粒pBudCE4.1-AMA1-ROP18构建正确;经RT-PCR和SDS-PAGE鉴定, AMA1、ROP18基因均在哺乳动物细胞中正确转录与表达。结论 成功构建pBudCE4.1-AMA1-ROP18重组质粒,并可在HFF细胞中稳定表达。     

结核分枝杆菌PPE68基因真核表达载体的构建、表达和鉴定

目的：建立结核分枝杆菌PPE68蛋白基因重组质粒的真核表达载体,为以后对PPE重组蛋白的免疫原性分析奠定基础。方法：提取结核分枝杆菌总DNA,PCR法扩增出PPE68编码基因,通过线性T克隆载体pGEM—T连接,亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）后,转染至I-IeLa细胞中表达,Westernblot鉴定表达产物。结果：PCR产物、pGEM-T—PPE68及pcDNA3．1（＋）一PPE68分别经双酶切后均获得同一大小基因片段,表达产物经Westernblot鉴定相对分子质量约为40000。结论：成功构建了结核分枝杆菌PPE68基因真核表达载体,并获得了表达产物。     

结核分枝杆菌Ag85B与MPT64真核共表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Ag85B和MPT64编码基因的共表达载体pBud85B-MPT.方法:将结核分枝杆菌Ag85B、MPT64基因同时克隆进多启动子共表达载体pBudCE4.1中,得到真核共表达质粒pBud85B-MPT;将pBud85B-MPT转染COS-7细胞,通过RT-PCR方法检测目的基因的表达.结果:在COS-7细胞中同时检测到Ag85B、MPT64的表达.结论:pBud85B-MPT共表达质粒构建成功,为进一步研究新型结核病疫苗奠定基础.     

tPA和VEGF165基因共表达质粒的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的 构建携带人组织纤溶酶原激活物(tPA)和血管内皮细胞生长因子165(VEGFl65)基因的真核表达质粒pBudCE4．1／tPA-VEGF165,并观察其在血管平滑肌细胞(VSMC)中的表达。方法从人心脏组织中克隆tPA和VEGF165基因。将tPA和VEGF165基因克隆至真核表达质粒pBudCE4．1中,构建共表达质粒pBudCE4．1／tPA-VEGF165。将pBudCE4．1／tPA-VEGF165转染VSMC,用RT-PCR法检测转染的VSMC中tPA和VEGFl65mRNA的表达,用ELISA法检测转染的VSMC培养液中tPA和VEGF165蛋白质。结果人tPA和VEGF165基因的RT-PCR产物分别为1．9kb和576bp。经酶切鉴定证实,tPA和VEGF165基因已克隆至真核表达质粒pBudCE4．1中。以其转染VSMC后,经RT-PCR和ELISA检测发现,tPA和VEGF165在mRNA和蛋白质水平均有表达。结论成功地构建了真核共表达质粒pBudCE4．1／tPA-VEGF165,并在VSMC中表达tPA和VEGF165。     

靶向递送人颗粒溶素与小鼠单链IL-12真核共表达质粒耻垢分枝杆菌的构建及鉴定

目的:构建携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠单链IL-12基因的真核共表达载体pZM03,并构建可将其靶向递送入巨噬细胞中进行表达的重组耻垢分枝杆菌菌苗.方法:将人GLS,小鼠单链IL-12基因和分枝杆菌复制子OriM同时克隆进多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,得到穿梭质粒pZM03.以pZM03电转化耻垢分枝杆菌mc2-155,通过PCR方法检测重组菌中携带的真核共表达质粒;通过与小鼠巨噬细胞株RAW264.7共孵育检测重组菌的靶向性.结果:成功得到了可靶向递送GLS/IL-12真核共表达质粒pZM03进入巨噬细胞的新型重组菌.结论:利用耻垢分枝杆菌作为减毒生物体载体向巨噬细胞中靶向递送真核表达质粒是可能的.     

巨噬细胞LRG47/EBP50真核共表达质粒的构建及表达鉴定

目的:构建能共表达LRG47和EBP50的重组质粒pBud-LE,实现目的基因LRG47、EBP50在真核细胞中的表达,以便于后续从分子和细胞水平研究其抗结核分枝杆菌(Mtb)感染的效果和机制.方法:用RT-PCR方法从RAW264.7细胞中扩增获得小鼠的lrg47基因和ebp50基因,分步克隆入真核共表达质粒pBUDCE4.1中,构建真核共表达质粒pBud-LE.同时构建ebp50和红色荧光蛋白表达基因(rfp)的融合基因,置换pBud-LE中的ebp50基因,构建共表达LRG47和EBP50-RFP的重组质粒pBud-LER;将pBud-LE、pBud-LER通过脂质体转染入293T细胞,以pBud-LER转染观察转染效果,再分别采用RT-PCR和免疫印迹法鉴定质粒在真核细胞系中表达LRG47和EBP50的能力.结果:成功构建了真核共表达质粒pBud-LE和pBud-LER;转染293T细胞后,LRG47和EBP50在RNA水平和蛋白水平都明显升高.结论:成功的构建了真核共表达质粒pBud-LE.     

弓形虫ROP18 MIC2重组真核质粒的构建与表达

目的 构建弓形虫棒状体蛋白18(ROP18)和微线体蛋白2(MIC2)的基因融合的重组真核表达质粒,并在转录和翻译水平进行鉴定。方法 利用分子克隆技术构建重组真核表达质粒pBudCE4.1-ROP18-MIC2,经PCR、酶切及测序鉴定正确后,体外转染人包皮成纤维细胞(HFF),采用RT-PCR在48h时检测转录水平, SDS-PAGE在72h时检测蛋白表达。结果 重组真核表达质粒pBudCE4.1-ROP18-MIC2构建正确,经RT-PCR、SDS-PAGE鉴定,弓形虫ROP18、MIC2可在HFF细胞中瞬时表达。结论 成功获得重组真核表达质粒pBudCE4.1-ROP18-MIC2,为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。     

慢性粒细胞白血病bcr/abl的糖基化磷脂酰肌醇锚定修饰及在COS-7细胞膜上的表达

目的 构建与糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol,GPI)锚定序列相连的bcr/abl真核表达质粒,并检测其在COS-7细胞中基因和膜蛋白的表达.方法 以编码慢性粒细胞白血病bcr/abl融合蛋白全长序列的migP210质粒为模板,通过PCR扩增获得654 bp的bcr/abl融合基因片段,双酶切后定向插入真核表达载体pBudCF4.1中,经鉴定获得重组质粒pBB.同时用RT-PCR扩增人外周血淋巴细胞CD24分子中的GPI获得约243 bp的锚定序列,双酶切后克隆人pBB质粒中与ber/abl基因下游羧基端相连,获得重组质粒pBBG.在多聚阳离子介导下将pBBG质粒转染COS-7细胞,采用RT-PCR和Western blot检测bcr/abl融合基因和蛋白的表达.结果 经酶切和测序鉴定证实,由GPI锚定连接的ber/abl融合基因插入片段正确;RT-PCR检测到转染细胞中有bcr/abl融合基因,Western blot检测到转染细胞膜上有hcr/abl融合蛋白的表达.结论 成功构建由GPI锚定修饰的bcr/abl重组质粒pBBG,并能在COS-7细胞膜上表达出bcr/abl融合蛋白.     

5-LO真核表达载体的构建及其在RAW264.7细胞中的表达的初步研究

目的构建5-LO真核表达载体并初步研究其在RAW264．7细胞中的表达,为建立5-LO高表达转基因小鼠模型提供表达载体。方法从人全血标本中提取细胞总RNA,以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法扩增5-LO基因,分别构建5-LO目的基因的克隆载体与表达载体,提取质粒,进行酶切、PCR和DNA测序鉴定,将重组融合表达载体pEGFP-5-LO稳定转染RAW264．7细胞,RT-PCR、western blot方法检测pEGFP-5-LO的表达情况。结果构建了重组克隆载体pUCm-5-LO和真核表达载体pEGFP-5-LO,经酶切、PCR及测序鉴定正确;转染细胞后,在荧光显微镜下观察到pEGFP-5-LO融合蛋白的表达,RT—PCR和Westemblot结果表明转染pEGFP．5-LO的RAW264．7细胞中有5-LO的表达。结论成功克隆了5-LO基因,构建的表达载体pEGFP-5-LO在RAW264．7细胞中表达5-LO蛋白,为进一步5-LO高表达转基因鼠模型的建立和临床应用奠定了基础。