大鼠血管平滑肌细胞的培养和鉴定

目的:建立一种方便快捷的培养大量大鼠血管平滑肌细胞的方法,为心血管疾病的体外实验研究提供实验材料。方法:采用改良的组织块贴壁法进行原代培养,差异贴壁法纯化细胞,常规胰酶消化法传代,使用倒置相差显微镜进行形态学观察,通过检测平滑肌肌动蛋白对细胞进行免疫组化鉴定。结果:培养4代的平滑肌细胞纯度达96%以上。镜下可见培养细胞呈典型的"峰-谷"样生长,免疫组化染色显示胞质内平滑肌肌动蛋白阳性表达。结论:本研究所介绍的组织贴块培养法较为成熟,可为心血管疾病病因、机制的研究和防治提供一个理想的实验材料。     

血管平滑肌细胞的培养及鉴定

目的探讨以简便、高效的方法获取血管平滑肌细胞,为相关研究提供实验材料.方法采用改良组织贴块法进行原代培养,胰酶消化传代,综合运用自然纯化、机械刮除、差异贴壁法进行细胞纯化,并应用相差显微镜和SP试剂盒对细胞进行形态学和免疫组化鉴定.结果90%的组织块接种存活,5代的平滑肌细胞纯度达98%以上.镜下培养细胞呈典型的"谷峰状"生长,免疫组化染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达.结论本法简便、可靠,短期内可获大量高纯度、功能良好的血管平滑肌细胞.     

酶消化法急性分离大鼠主动脉平滑肌细胞及其鉴定

目的 探讨采用酶消化法快速分离SD大鼠胸、腹主动脉平滑肌细胞的方法,为膜片钳实验提供大量原代平滑肌细胞.方法 取SD大鼠胸、腹主动脉,用酶液Ⅰ(木瓜蛋白酶等)、酶液Ⅱ(胶原酶和透明质酸酶等)酶解分离平滑肌细胞,酶液Ⅰ、Ⅱ的消化时间分别选取10、15、20、25、30 min,并两两组合以确定最佳消化时间.分离的细胞经台盼蓝染色测定其活性并通过平滑肌特异性α-肌动蛋白(α-actin)免疫组化染色鉴定.结果 分离的平滑肌细胞在倒置显微镜下计数,酶液Ⅰ、Ⅱ的消化时间分别在30、15 min时平滑肌细胞数量最多为(18.3 1.5)个/低倍视野,与其他各时间点组合相比,差异有统计学意义(P＜0.05).镜下观察典型的平滑肌细胞呈长梭形,细胞膜完整,边缘光滑;台盼蓝染色,90%以上的细胞为活细胞;免疫组化染色鉴定为平滑肌细胞.结论 酶消化法分离获取SD大鼠平滑肌细胞方法简单、成本低,采用本法可获得较大量的平滑肌细胞供实验使用.     

组织贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞及鉴定

目的探讨以原代培养的方法获得活力稳定、高度纯化的大鼠血管平滑肌细胞的体外模型,并为相关研究提供所需的试验材料。方法采用组织贴块法进行细胞原代培养,胰酶消化传代,液氮冻存,并应用倒置相差显微镜和SP法免疫组化染色对细胞进行鉴定。结果85％的组织块接种存活,传代后90％以上的平滑肌细胞重新贴壁生长,冻存后细胞再行1～2次传代后可恢复增生活力。显微镜下细胞呈典型的“谷峰状”生长,SP法免疫组化染色显示胞质内“平滑肌肌动蛋白表达阳性。结论组织块贴壁法简便易行,短期内可获大量符合后续试验要求的血管平滑肌细胞。     

组织工程化血管的种子细胞在体外培养扩增方法的实验性研究

目的为培养组织工程化血管的实验研究提供细胞来源.方法采用酶消化法和组织块法培养人脐静脉血管内皮细胞、人脐动脉血管平滑肌细胞及成纤维细胞,并进行细胞的传代、纯化、鉴定以及形态学观察.结果培养细胞符合血管内皮细胞、血管平滑肌细胞及成纤维细胞的各有形态特征.结论所培养的细胞有望作为体外构建组织工程化血管的应用.     

大鼠腹主动脉平滑肌细胞的培养与鉴定

目的 探讨一种简单、经济获取腹主动脉血管平滑肌细胞的方法,为相关研究提供实验材料.方法 应用改良组织贴块法进行原代培养,胰酶消化传代,运用自然纯化法进行细胞纯化,并使用相差显微镜和SP试剂盒对细胞进行形态学观察以及免疫组化鉴定.结果 90%的组织块接种存活,培养细胞呈典型的"谷峰状"生长,免疫荧光化学技术检测显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达.结论 本法简便可靠,短期内可获大量高纯度、功能良好的血管平滑肌细胞.     

SD大鼠自体平滑肌细胞的获取和体外培养

目的建立从SD大鼠的输精管中提取、培养获得自体平滑肌细胞的方法.方法取SD大鼠的输精管,用酶消化法分离、提取平滑肌细胞,进行体外培养、扩增.倒置相差显微镜下观察体外培养的平滑肌细胞的生长情况,用平滑肌特异性的抗α-SMA做免疫组化染色,鉴定培养的细胞.结果平滑肌细胞体外培养呈长梭形,并出现"峰-谷"样生长特征.用抗α-SMA免疫组化染色的方法鉴定所培养为平滑肌细胞,其纯度为(91.3±5.2)%.结论成功建立了从SD大鼠的输精管中提取、培养获得自体平滑肌细胞的稳定模型.     

大鼠输精管平滑肌细胞的体外培养

目的建立从SD大鼠的输精管中提取、培养获得平滑肌细胞的方法.方法取SD大鼠的输精管,用酶消化法分离、提取平滑肌细胞,进行体外培养、扩增.倒置相差显微镜下观察体外培养的平滑肌细胞的生长情况,用平滑肌特异性的抗α-SMA做免疫组化染色,鉴定培养的细胞.结果平滑肌细胞体外培养呈长梭形,并出现"峰-谷"样生长特征.用抗α-SMA免疫组化染色的方法鉴定所培养为平滑肌细胞,其纯度为(91.3±5.2)%.结论成功地建立了从SD大鼠输精管中提取、培养获得自体平滑肌细胞的稳定模型.     

改良混合酶消化法培养大鼠主动脉平滑肌细胞

目的探讨改良酶消化法培养大鼠主动脉平滑肌细胞(VSMC)的方法,为动脉粥样硬化等血管硬化性疾病的发病机制和防治研究提供帮助。方法提取大鼠的胸主动脉,采用混合酶消化后,采用含10?S RP-M I1640培养基培养。通过细胞计数观察细胞增殖,倒置相差显微镜观察血管平滑肌细胞的生物学性状,免疫组织化学进行细胞鉴定。结果消化肌平滑肌细胞24h后贴壁,平均贴壁率为76%,第5 d后细胞数迅速增加,至第11 d形成单层时,光镜下出现"峰-谷"样生长;传代后,细胞的生长特性无改变,α-SMA免疫组化染色检测,证实细胞是VSMC。结论改良后酶消化法能短时、高效地培养生物学特征稳定的VSMC。     

SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代培养及鉴定

目的:研究SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞(RASMC)的培养方法及其生物学特性.方法:运用组织块贴壁法进行SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞培养,并用倒置相差显微镜观察、HE染色后形态学观察以及用免疫组化对培养细胞进行鉴定.结果:组织块贴壁法成功培养出SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞,培养的细胞呈典型"峰-谷"样生长,HE染色细胞呈梭形,胞浆丰富,核大而圆或椭圆,免疫组化S-P法检测a-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(a-SMActin)呈强阳性表达.传代纯化,细胞生长特性未见异常改变.结论:组织块贴壁法培养的SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞生长稳定,培养和纯化可同步进行,简单,方便.     

Differences in the primary culture, purification and biological characteristics between endothelial cells and smooth muscle cells from rat aorta

Objective: To investigate the differences of primary culture, purification and biological characteristics between endothelial cells and smooth muscle cells from rat aorta. Methods: Endothelial cells were obtained using the vascular ring adherence, collagenase digestion method and an improved vascular ring adherence method, while smooth muscle cells were separated from tissue sections of rat aorta. Clones of endothelial cells were selected by limiting dilution assay. Both cell types were identified using specific cell immunofluorescent markers,and phase contrast microscopy was used to observe the morphological disparity between endothelial cells and smooth muscle cells at the single cell and colony level. Cell proliferation was determined by the cell counting kit-8. Differences between endothelial cells and smooth muscle cells were evaluated in trypsin digestion 6me, attachment time and recovery after cryopreservation. Results: Endothelial cells were obtained by all three methods. The improved vascular ring method provided the most reproducible results. Cells were in good condition, and of high purity. Smooth muscle cells were cultured successfully by the tissue fragment culture method. Clonal expansion of singleendothelial cells was attained. The two cell types expressed their respective specific markers, and the rate of proliferation of smooth muscle cells exceeded that of endothelial cells. Endothelial cells were more sensitive to trypsin digestion than smooth muscle cells. In addition, they had a shorter adherence time and better recovery following cryopreservation than smooth muscle cells. Conclusion: The improved vascular ring method was optimal for yielding endothelial cells. Limiting dilution is a novel and valid method for purifying primary endothelial cells from rat aorta. Primary rat endothelial cell and vascular smooth muscle cell cultures exhibited different morphological characteristics, proliferation rate, adherence time, susceptibility to trypsin digestion and recovery after cryopreservation. Our research can be a good foundation for further application in the regeneration of blood vessel.     

酶联合消化法培养小鼠主动脉平滑肌原代细胞

目的建立一种适用于体外有效分离培养小鼠主动脉血管平滑肌细胞的技术方法。方法分离主动脉,用优化的酶联合消化法获取主动脉平滑肌细胞,用形态学法、免疫细胞化学法鉴定。结果该方法所分离的主动脉平滑肌细胞生长旺盛,细胞活性好,7～9d后细胞总量可达到5×105个/瓶,细胞纯度可达85%以上,细胞呈长梭形、放射状、束状生长,平行排列呈峰谷状,免疫荧光显示胞浆内α-SMA蛋白表达阳性。结论该酶联合消化法可在体外短时间内获取数量可观、高纯度的主动脉平滑肌细胞。     

人妊娠子宫平滑肌细胞培养消化法与组织块法效果比较

目的寻求简单有效的人妊娠子宫平滑肌细胞原代培养方法,建立稳定、高纯度、高产量的子宫平滑肌细胞原代培养体外模型。方法利用20例妊娠子宫组织,分别使用组织块法和胶原酶消化法分离及纯化人子宫平滑肌细胞,通过免疫荧光方法检测平滑肌细胞的肌动蛋白(α-SMA)及钙调节蛋白(calponin)的表达。结果组织块法和胶原酶消化法培养的平滑肌细胞均呈梭型,峰谷样生长,α-SMA及calponin的免疫荧光化学检测结果为阳性,胶原酶消化法较组织块培养法稳定且缩短原代培养时间。结论胶原酶法简便,快速,稳定,可建立稳定、高纯度的子宫平滑肌细胞体外培养体系。     

组织块消化法原代培养大鼠输精管平滑肌细胞及鉴定

目的 建立一种稳定高效、存活率高的大鼠输精管平滑肌细胞体外分离及培养方法,为相关研究提供理想的细胞模型。方法 采用组织块消化法对大鼠离体输精管平滑肌细胞进行原代培养。采用形态学观察、HE染色、抗α-SMA免疫细胞化学荧光染色对细胞进行鉴定,台盼蓝染色计算细胞存活率及细胞总数,胰酶消化传代并绘制生长曲线。结果 对照实验表明胶原酶Ⅱ消化效果优于胶原酶Ⅰ,最佳消化时间为60min,同时控制吹打次数、沉淀时间及培养环境,获得了理想的平滑肌细胞总数及存活率。平滑肌细胞呈典型的梭形、长条形,可传代,且出现平滑肌细胞培养典型的“峰-谷”状特征,生长曲线为“S”型。经抗α-SMA免疫荧光鉴定,培养细胞为平滑肌细胞,纯度为(92.6±4.3)%。结论 采用组织块消化法成功建立了大鼠输精管平滑肌细胞的体外分离及培养方法。     

建立一种改良方法分离大鼠肝星状细胞

目的建立一种经济、稳定可靠的HSC分离方法,为体外研究提供细胞模型.方法 Hanks液在体灌洗大鼠肝脏,离体后用Ⅳ胶原酶、链蛋白酶、DNaseI消化肝脏,12%Nycodenz连续梯度液分离大鼠HSC,计数细胞得率,0.2%台盼蓝染色计算细胞活率.自发荧光、Desmin、α-SMA免疫荧光染色对HSC进行鉴定和纯度分析.结果分离HSC得率(3.7±0.6)×107/只大鼠,细胞活率>90%,分离第1天自发荧光和第3天desmin染色阳性细胞>90%.HSC随着体外培养形态明显改变,分离培养7 d后α-SMA阳性细胞>90%,培养14 d或传代后>95%.结论肝脏离体后消化能达到在体消化同样的效果,应用Nycodenz密度分离介质可获得满意的HSC得率和纯度.     

小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良

目的建立一种简单方便但高效的血管平滑肌细胞原代培养方法。方法改良酶消化法。结果用该法培养细胞传代生长快,细胞纯度达98%以上,足以满足各种细胞试验需求。结论与传统方法相比该法简单经济,试验成功率高,节省材料和时间,而且可获得更多纯度较高的细胞。     

大鼠胸主动脉平滑肌细胞的组织贴块法培养及鉴定

目的:建立大鼠胸主动脉平滑肌细胞的组织贴块培养法.方法:取大鼠胸主动脉,切成1 mm×1 mm×1 mm的小块,均匀地种植于培养瓶壁上,约50 min后加入含有20%小牛血清的PRMI-1640培养基进行培养.结果:培养第5天时,可见少量梭形或长梭形细胞自组织块周围游出,至培养3周细胞融合成片,呈"峰、谷"状生长.肌动蛋白免疫组化染色,＞98%的细胞染色阳性,透射电镜观察,于基膜下和胞浆内可见密斑和密体.VG染色也证实几乎所有的细胞均为平滑肌细胞.结论:应用细胞贴块法培养大鼠平滑肌细胞,操作简单,结果稳定,纯度较高,具有应用价值.     

大鼠主动脉平滑肌细胞体外培养及其临床意义

目的:建立大鼠主动脉平滑肌细胞的组织贴块培养法,进一步探讨其临床应用价值。方法:取大鼠主动脉切成1mm3的小块,均匀的贴在细胞培养瓶壁上,用RPMI1640培养基培养,并用透射电镜和相差显微镜进行鉴定。结果:相差显微镜下可见细胞呈梭形或长梭形,培养3周后细胞可重叠生长达多层,高低起伏呈“峰”“谷”状;透射电镜下见到平滑肌细胞的胞浆内有很多与细胞纵轴平行的肌丝及其相连的致密体,部分细胞周围可见肌膜。结论:贴块法培养平滑肌细胞具有方法简单、成功率高、稳定性强等优点,适于临床进行心血管疾病病因和机理的研究。     

改良组织块法培养SD大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞

目的应用改良植块法体外培养大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞。方法15只SD雄性大鼠,随机分成3组,每组5只,分别采用组织块法、酶消化法及改良组织块法分离大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,在含双抗及20%胎牛血清DMEM,37℃、5%CO2、95%空气的细胞培养箱静置中培养,相差显微镜观察细胞形态及扩增情况,用α-平滑肌肌动蛋白(a-SM-Actin)及结蛋白(desmin)免疫组织化学染色,鉴定细胞类型。结果α-平滑肌肌动蛋白在阴茎海绵体平滑肌细胞阳性率为96.3%,在成纤维细胞中阳性率为23.8%,结蛋白在阴茎海绵体平滑肌细胞阳性率为74.4%,在成纤维细胞中呈阴性。三组间结蛋白阳性细胞率具有显著差异,改良组织块法组结蛋白阳性细胞率高于组织块法和酶消化法组。结论结蛋白是鉴定海绵体平滑肌细胞的特异性指标,改良组织块法可获纯度更高、结构和功能良好的阴茎海绵体平滑肌细胞。     

大鼠胃平滑肌细胞的体外分离与三维支架培养方法

目的:探讨复合胶原酶和胰蛋白酶解离大鼠胃平滑肌细胞,建立稳定的胃平滑肌细胞体外培养模型,并探讨其三维复合培养的可行性。方法:0.2%Ⅰ型胶原酶和0.05%胰蛋白酶酶解大鼠胃平滑肌,用相差显微镜观察细胞学形态与生长情况,免疫组化鉴定平滑肌细胞;采用纤维蛋白胶作为细胞外基质建立三维PLGA复合物培养模型,荧光显微镜观察复合物中的细胞活性。结果:平滑肌组织裂解充分均匀,细胞接种成功率高,1～2周细胞可传代,传代后细胞呈典型的"峰-谷"样生长;α-平滑肌肌动蛋白免疫组化染色证实所获得的平滑肌细胞,荧光显微镜下观察到PLGA支架内细胞均匀分布,存活率达90%以上。结论:酶解分离法可获得高纯度大鼠胃平滑肌细胞,三维支架培养在体外成功培养胃平滑肌细胞复合物,为深入研究胃组织工程再生奠定了基础。