反义IGF-1RNA基因治疗脑胶质瘤的实验研究

目的 构建反义胰岛素样生长因子-1（IGF-1）表达质粒（pcEP4-IGF-1A）治疗大鼠C6脑胶质瘤。方法 RT-PCR扩增300bpIGF-1 cDNA，测序，构建反义IGF-1表达质粒，体外转染C6细胞，观察其体外增殖速率及对C6胶质瘤的治疗作用。结果 反义IGF-1序列正确，反义IGF-1A转染的C6细胞生长明显受抑，体内成瘤性消失，荷瘤鼠肿瘤全部消失，6个月观察期内肿瘤无复发。结论 反义IGF-1表达质粒能抑制C6细胞体外生长，体内杀伤肿瘤效果明显。     

腺病毒介导的HSV-tk基因治疗人膀胱癌的动物实验研究

目的　探讨带有HSV -tk基因的重组腺病毒 (Ad -tk)结合GCV对人膀胱癌的治疗作用。方法　建立人膀胱癌裸鼠移植瘤模型 2 1只 ,采用肿瘤原位注射Ad -tk结合GCV治疗。结果　 5× 10 8PFU的Ad -tk肿瘤原位注射结合GCV治疗 ,能明显抑制肿瘤生长 ,肿瘤平均重量为 0 .2 1g ,病理检查表明肿瘤组织坏死、出血伴纤维组织增生 ;而 3个对照组Ad -tk/PBS组、PBS/GCV组、PBS组肿瘤平均重量分别为 1.6 0、1.5 2、1.71g。与对照组比较 ,肿瘤生长抑制率分别为 86 .9%、86 .2 %、87.7% ,有显著性差异 (均P <0 .0 1)。结论　Ad -tk/GCV系统对人膀胱癌的敏感性较高 ,疗效显著。     

环丙氧苷诱导转导有外源HSV-tk基因的C6胶质瘤细胞的凋亡

目的　观察单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (HSV - tk) -环丙氧苷 (GCV )系统在胶质瘤基因治疗过程中 ,GCV能否诱导转导有 HSV- tk基因的胶质瘤细胞凋亡。方法　采用光镜、电镜和荧光显微镜观察转导有 HSV- tk基因的大鼠 C6 /tk胶质瘤细胞形态学的改变 ,以未转导 HSV- tk基因的 C6细胞作为对照 ,并以流式细胞术、DNA凝胶电泳分析进一步验证细胞凋亡的发生。结果　在 5μg/ml GCV作用 72 h后 ,C6 /tk细胞呈现凋亡状态。光镜和电镜下可见细胞皱缩 ,染色质浓集贴边 ;荧光显微镜下可见染色质浓集、断裂 ;DNA凝胶电泳可见 DNA呈梯状带型 ;流式细胞术分析显示有凋亡峰出现 ,凋亡细胞占 2 3%。对照组未见有细胞凋亡现象。结论　 GCV能诱导转导有 HSV- tk基因的 C6 /tk细胞凋亡 ,以上结果为胶质瘤基因治疗的研究提供依据     

HSV-tk/GCV自杀基因系统对视网膜母细胞瘤的体外抗肿瘤效应

目的 研究单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶／更昔洛韦(herpes simplex virus thymidine kinase／ganeyclov—ir,HSV—tk／GCV)自杀基因系统对视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,Rb)细胞的体外杀伤作用以及旁观者效应发生的机制。方法 应用脂质体将pCMV／hytk-IRES-hrGFP质粒导入HXO-Rb44细胞株。用潮霉素筛选出阳性细胞克隆并命名为HXO-Rb44／tk。RT—PCR鉴定hytk基因在HXO-Rb44／tk细胞中的转录结果。比较HXO-Rb44和HXO-Rb44／tk细胞的形态特征及生长特性。通过MTT法检测GCV对不同比例HXO-Rb44／tk和HXO-Rb44混合细胞的杀伤作用(“旁观者效应”)。并通过上清移换实验研究旁观者效应发生的机制。结果HXO-Rb44／tk细胞经RT—PCR可检测出530bp的hytk基因片段。HXO-Rb44／tk和HXO-Rb44细胞的形态特征及生长特性无明显差异。HXO-Rb44／tk细胞仅占很低比例时即可观察到明显的旁观者效应,而GCV作用的HXO-Rb44／tk细胞上清对HXO-Rb44细胞无杀伤作用。结论 HSV—tk基因转移联合GCV治疗可作为Rb基因治疗的一种有效方法,旁观者效应可能是GCV代谢产物通过缝隙连接进行细胞间转运来实现的。     

胶质瘤患者血清IGF-1的表达及临床意义

目的 探讨胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)与脑胶质瘤发生的关系.方法 67例脑胶质瘤患者按病理分级标准分为高级别组和低级别组,以30例健康人作为对照组.比较正常人及胶质瘤患者手术前后血清IGF-1含量.结果 高级别组脑胶质瘤患者血清中IGF-1水平显著高于低级别组IGF-1水平,且均显著高于正常人;脑胶质瘤患者手术后血清IGF-1水平较手术前显著下降.结论 脑胶质瘤患者血清IGF-1表达水平可以反映肿瘤恶性程度及治疗预后.     

腺病毒介导HSV-tk/GCV系统杀伤脑胶质瘤C6细胞

目的 :观察腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶 /丙氧鸟甘 (herpessimplexvirusthymidinekinase/ganci clovir HSV tk/GCV)系统对脑胶质瘤细胞的杀伤作用 .方法 :将AdCMVLacZ感染胶质瘤细胞C6,X gal染色 ,测定腺病毒的转染率 .AdCMVtk感染C6细胞后加入 10mg·L-1GCV ,观察肿瘤细胞存活率及旁观者效应 .结果 :tk基因对C6细胞的转染率随着腺病毒的感染复数 (MOI)量增加而增加 (r=0 .819,P<0 .0 5 ) ,10 0 %转染所需要的MOI为 10 0 .AdCMVtk/GCV对C6细胞的杀伤强度与AdCMVtk的量成正相关 (r =0 .870 ,P <0 .0 5 ) .此杀伤作用存在旁观者效应 ,且较强 .结论 :腺病毒介导的HSV tk/GCV系统具有杀伤脑胶质瘤的作用     

脑胶质瘤基因治疗中丙氧鸟苷对细胞系的毒性分析

目的 :研究丙氧鸟苷 ( GCV)对 C6BPBAG脑胶质瘤细胞、psi2细胞、psi2 STK细胞的毒性。方法 :将 C6BPBAG脑胶质瘤细胞、psi2细胞、psi2 STK细胞分别在不同浓度 GCV的培养基中培养 ,观察以上 3类细胞对 GCV的毒性反应。结果 :在有效浓度 ( 0 .0 1～ 1 0 μmol·L-1 )中 ,GCV对C6BPBAG脑胶质瘤细胞、psi2细胞几乎无伤害 ,而经改造后的 psi2 STK细胞对 GCV毒性明显提高。结论 :通过体外实验证实由逆转录病毒载体 ( STK)传导的 HSV- TK基因 ,在培养的 C6胶质瘤细胞中 ,可提高 GCV对 psi2 STK细胞的敏感性     

胃癌中PTEN、IGF-1、IGF-1R蛋白表达及其预后意义评价

目的 探讨PTEN、IGF-1、IGF-1R蛋白表达在胃癌发生、发展、侵袭转移及预后评价中的作用.方法 随访手术胃癌患者,应用免疫组化方法检测有随访资料的胃癌组织和正常胃黏膜组织中PTEN、IGF-1、IGF-1R蛋白的表达.结果 胃癌组织中PTEN表达降低,IGF-1、IGF-1R表达增高;PTEN、IGF-1、IGF-1R表达与胃癌临床生物学行为有关,PTEN蛋白表达在无淋巴结转移组高于淋巴结转移组,Ⅰ～Ⅱ期组高于Ⅲ～Ⅳ期组.IGF-1、IGF-1R蛋白表达在进展期胃癌组高于早期胃癌组,低分化组高于高中分化组,有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组;Ⅰ～Ⅱ期组低于Ⅲ～Ⅳ期组;进展期胃癌中PTEN蛋白表达阳性患者生存率优于阴性患者,IGF-1、IGF-1R蛋白表达阳性患者生存率差于阴性患者.结论 PTEN、IGF-1、IGF-1R蛋白表达改变在胃癌发生、发展中起一定作用,可以帮助判断预后.     

IGF-1及其受体在老年大鼠甲状腺细胞表达的研究

胰岛素生长因子-1(IGF-1)广泛地存在于体内各组织器官,DHEA调节IGF-1分泌起到了重要的作用[1].本实验利用体外培养老年大鼠甲状腺细胞观察DHEA刺激IGF-1 mRNA转录量及提高IGF-1的浓度、IGF-1的IR(受体),报告如下.     

HSV-tk基因反转录病毒载体的构建及体外抗脑肿瘤细胞作用研究

构建了含有pgk启动子驱动的HSV-tk基因的反转录病毒载体pLNTK，PCR证实pLNTK成功地转移至SHG44及NBA2细胞。体外实验证实，表达HSV-tk次的细胞对ACV的敏感性明显高于未修饰的亲本细胞，SHGLNTK、NBALNTK细胞对ACV的敏感性分别是其亲本细胞的1000、500倍。3H－TdR掺入法证实转染HSV－tk细胞在ACV存在下，其DNA合成能力较亲本细胞明显受抑制。共培养实验证实存在旁观者效应。     

旁观者效应在肝癌基因治疗中的作用

目的：观察HSV－tk/ACV(Herpes Simplex Virus thymidine kinase gene/Acyclovir）系统基因治疗恶性肿瘤过程中旁观者效应的作用。方法：HSV－tk基因重组逆转录病毒载体转染PA317细胞为PA317－tk细胞。培养PA317－tk细胞即可获得有感染力的携带HSV－tk基因的病毒颗粒,然后转染肝癌细胞株SMMC－7721细胞为SMMC－tk细胞。SMMC－TK细胞与SMMC－7721细胞以不同百分比混合,用ACV（100ug/ml）培养基培养,MTT法检测ACV对各组细胞抑制率（Inhibit Rate,IR),根据各组IR与该组SMMC－tk细胞数的百分比值（IR／SMMC－tk%,IR/St）的大小判断旁观者效应作用的有无和强弱。结果：旁观效应试验表明,含SMMC-tk细胞10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,100％各组IR／St比值分别为2．15,1．91,1．83,1．47,1．30,1．11,1．02,0．93,0．84,0．76。10％－70％各组IR／St比值均大于1,存在明显旁观者效应,以10％,20％,30％,40％组最强,80％－100％三组IR／St比值小于1,旁观者效应不明显。结论：研究结果证实用HSV－tk/ACV系统基因治疗恶性肿瘤,适宜比例TK^ 细胞时,存在明显的旁观者效应,TK／细胞为10％时旁观者效应最强,这对于HSV－TK／ACV系统基因治疗恶性肿瘤具有重要意义。     

血清抑制素B、IGF-1和IGF-2水平与多囊卵巢综合征的关系及其临床意义

目的探讨血清抑制素B（INHB）、类胰岛素样生长因子-1（IGF-1）和类胰岛素样生长因子-2（IGF-2）水平与多囊卵巢综合征（PCOS）的关系及其临床意义。方法采用ELISA法检测60例多囊卵巢综合征患者血清中INHB、IGF-1和IGF-2浓度水平,并与60例健康人作对照。结果PCOS患者组的血清INHB、IGF-1和IGF-2水平高于正常对照组（t=-2．246,t=-2．552,t=-2．046,均P〈0．05）;血清INHB与IGF-1、IGF-2水平均呈显著正相关（r=0．535,r=0．623,均P〈0．05）,血清IGF-1与IGF-2水平也呈正相关（r=0．728,P〈0．05）。结论血清INHB、IGF-1和IGF-2可能参与了PCOS的发病过程和肥胖的形成,可能成为PCOS的预测因子。     

Epstein-Barr病毒LMP1-exonl反义表达载体对NPC细胞生长的抑制作用

目的　研究EB病毒LMP1反义基因对人鼻咽癌CNE2细胞恶性表型的逆转作用。方法　用反义LMP1DNA的真核表达载体anti—pcDNA3．1—LMP1转染人鼻咽癌细胞CNE2，G418筛选抗性克隆;Western-blot法检测转染前、后瘤细胞的LMP1表达；用MTT法、细胞生长曲线和软琼脂集落形成能力实验观察转染前后细胞体外生长增殖特性。结果建立反义CNE2细胞克隆；转染后LMP1蛋白表达降低；转染后细胞活力和生长速度均有下降，集落形成能力显降低。结论　将反义LMP1真核表达载体导入细胞能成功抑制NPC细胞的生长，逆转其恶性表型。本研究还为鼻咽癌的基因治疗提供了实验依据。     

重组腺病毒载体介导FasL治疗人脑胶质瘤实验研究

目的:研究以重组缺陷型腺病毒为载体的Fas配体(Fas-Ligand,FasL)基因治疗人脑胶质瘤。方法:用RT-PCR方法构建携带人FasL cDNA的缺陷型重组腺病毒载体(Ad-FL),在体外转导5株人脑胶质瘤细胞;体外检测Ad-FL对人脑胶质瘤细胞生长的影响;建立裸鼠皮下人胶质瘤模型,给予体内治疗。结果:体外实验证实Ad-FL能显著诱导5株胶质细胞瘤在体外凋亡或抑制其生长;体内试验表明重组腺病毒可以在体内有效表达FasL,且能有效通过诱导凋亡和/或炎症反应抑制U251胶质瘤的生长,使荷瘤鼠存活90天以上,而Ad-LacZ和对照组分别为(19.6±2.4)天和(15.8±1.9)天(P<0.01)。结论:以重组腺病毒为载体的FasL基因治疗脑胶质瘤效果显著,将是一种基因治疗脑胶质瘤的新手段。     

六味地黄丸增强黑色素瘤自杀基因系统旁观者效应的体外研究

【目的】探讨六味地黄丸含药血清对单纯疱疹病毒核苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-tk/GCV)系统杀伤小鼠黑色素细胞瘤B16细胞株的增效作用,为提高临床基因治疗肿瘤疗效提供新思路。【方法】构建并鉴定恶性黑色素瘤B16细胞HSV-tk/GCV治疗系统,制备六味地黄丸含药血清及对照血清,将B16、B16/tk细胞按20%(1:4)的比例混合制成细胞悬浮液接种于96孔培养板上,分为对照血清组、含药血清组、对照血清联合GCV组、含药血清联合GCV组,其中含药血清组及含药血清联合GCV组按血清体积分数计又分高(10%)、中(5%)、低(2.5%)3组,GCV的终浓度为25μmol/L,按分组添加相应的含药血清,每孔培养液总体积200μL,37℃、体积分数5%的CO2培养箱培养。48h后采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测杀伤效应。采用金正钧Q值法分析六味地黄丸含药血清与自杀基因治疗系统联合作用对旁观者效应是否具有协同性。【结果】MTT实验表明联合用药组对B16细胞的抑制率明显高于其他组,六味地黄丸含药血清对B16细胞株HSV-tk/GCV系统的增效作用存在量效关系:2.5%、5%、10%含药血清联合20%tk/GCV组的实际抑制率(48.75%、59.39%、69.28%)显著高于理论抑制率(38.13%、38.67%、39.92%),金正钧Q值分别为1.28、1.54、1.74,均大于1.15,具有协同增效作用。【结论】六味地黄丸含药血清对B16细胞株HSV-tk/GCV系统旁观者效应有明显的增效作用,且具有一定的量效关系。     

IGF-1及IGF-1R在SD大鼠前列腺组织中的表达

目的 研究不同饮食和丙酸睾酮对SD大鼠前列腺组织的改变及胰岛素生长因子( IGF)-1、IGF-1R 的表达强度. 方法 采用高脂高糖饲料饮食及去势后皮下注射丙酸睾酮建造前列腺增生模型,40 d后处死大鼠;取出前列腺组织,称重并HE染色观察前列腺增生情况;用免疫组化法检测前列腺组织中IGF-1、IGF-1R的表达强度. 结果 高脂高糖饮食组前列腺组织增生,IGF-1、IGF-1R的表达强度均高于普通饮食组(P<0. 05);去势+低剂量丙酸睾酮皮下注射组前列腺组织明显增生,IGF-1、IGF-1R的表达强度明显增加(P<0. 05). 结论 高脂高糖饮食及低剂量丙酸睾酮均可促进大鼠前列腺组织的增生,IGF-1、IGF-1R与前列腺增生的发展呈正相关性.     

胰岛素样生长因子-1受体基因多态性与系统性红斑狼疮相关性研究

目的:研究胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)基因rs2229765位点多态性与湖北汉族人群系统性红斑狼疮(SLE)易感性之间的关系。方法:SLE患者22例及70名健康对照者,采取聚合酶链反应和限制性片段长度多态性方法对IGF-1受体基因rs2229765位点多态性进行检测。结果:SLE组患者IGF-1受体基因rs2229765位点AA、AG、GG基因型频率分别0.182,0.636,0.182,正常人对照组为0.042,0.928,0.028。SLE组与对照组相比基因型频率具有统计学差异(χ2=3.891,P<0.05),A、G等位基因频率无统计学差异(χ2=0.544,P>0.05)。结论:IGF-1R基因rs2229765位点单核苷酸多态性与SLE明显相关,IGF-1R基因可能是SLE的易感基因。     

六味地黄丸对小鼠移植性肝癌自杀基因治疗增效作用的病理学研究

【目的】探讨六味地黄丸对小鼠移植性肝癌HSVt-k/GCV自杀基因治疗增效作用的病理学机制。【方法】昆明种小鼠90只,随机分为5组:正常对照组、模型对照组、六味地黄丸治疗组(剂量为10 g.kg-1.d-1)、自杀基因治疗组(腹腔注射丙氧鸟苷100 mg.kg-1.d-1)、联合治疗组;选用H22与H22/tk细胞株皮下接种建立小鼠荷肝癌模型,以自杀基因疗法联合六味地黄丸进行治疗并观察疗效;对肿瘤组织进行病理学观察和半定量分析;采用免疫组化技术及原位末端标记(TUNEL)技术观察肿瘤细胞增殖核抗原(PCNA)的表达及凋亡情况。【结果】HSVt-k/GCV自杀基因系统联合六味地黄丸治疗较单独应用HSVt-k/GCV系统或六味地黄丸能更显著地抑制肿瘤生长;免疫组化及凋亡TUNEL染色结果表明联合治疗组对肿瘤细胞增殖的抑制及对肿瘤细胞凋亡的诱导作用与模型对照组比较,差异均有显著性意义(P<0.05)。【结论】六味地黄丸对实验性肝癌的自杀基因治疗具有增效作用,其机制可能与六味地黄丸抑制了自杀基因治疗过程中肿瘤细胞的加速增殖有关,也与协同促进自杀基因治疗诱导的肿瘤细胞凋亡有关。     

IGF-2和IGF-1R在子宫内膜腺癌的表达及临床意义

目的检测子宫内膜癌中IGF-2及其相应受体IGF-1R蛋白的表达情况,探讨IGF-2及其相应受体在子宫内膜癌变中的表达及作用。方法采用免疫组化PV法检测20例正常增生期子宫内膜（对照组）、30例子宫内膜腺癌（腺癌组）组织中IGF-2I、GF-1R的表达情况。结果IGF-2的过阳性表达在子宫内膜腺癌要显著高于正常子宫内膜且随病理分级的增高而表达增强,随手术病理分期的增高逐级增强I。GF-1R的过阳性表达在子宫内膜腺癌显著高于正常子宫内膜,且随病理分级的增高而表达增强。结论IGF-2及IGF-1R的异常高表达在子宫内膜癌的发生发展过程中起重要作用。     

西藏小型猪IGF-1基因的克隆测序分析

目的 克隆西藏小型猪的肝脏组织中的IGF-1基因的cDNA序列,并与pubmed中查询到的猪cDNA进行比对分析。方法 本研究提取了西藏小型猪肝脏组织的总RNA,应用RT-PCR技术扩增了IGF-1基因的cDNA序列,将扩增出的片段克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒pMD18-T-IGF-1,进行测序分析。结果 首次克隆出了西藏小型猪肝脏组织中的IGF-1的cDNA序列,获得了大小为567bp长的片段,编码了186个氨基酸,与pubmed中查询到的猪（NM_214256.1）的IGF-1基因高度同源,比对序列发现,在440bp、455bp处发生了G→A、C→T的突变,该位点的突变引起相应编码氨基酸的变化,分别由组氨酸变成了精氨酸、亮氨酸转变成了丝氨酸。结论 本研究为西藏小型猪的生长发育机制研究提供了分子学依据,两个位点的突变引起的氨基酸的改变是否是导致西藏小型猪矮小的原因,需要进一步论证。