日本血吸虫BBC1基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆和表达日本血吸虫BBC1(SjBBC1)基因,为寻找新的抗日本血吸虫感染候选抗原分子提供实验基础。方法用PRIMER5.0引物设计软件自行设计引物,PCR扩增SjBBC1基因,将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接,经蓝白筛选、双酶切分析和PCR鉴定后,亚克隆入pQE30原核表达载体中。对原核表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果PCR扩增产物约为650bp,与预期大小相符。将该基因克隆入原核表达载体pQE30,表达蛋白分子质量单位约为23.6ku,并能被日本血吸虫感染兔血清识别。结论构建了pQE30/SjBBC1原核表达重组体载体,表达了具有抗原性的BBC1抗原。     

日本血吸虫BBC1基因的克隆、表达及鉴定

目的 克隆和表达日本血吸虫BBC1（SjBBC1）基因，为寻找新的抗日本血吸虫感染候选抗原分子提供实验基础。方法用PRIMER5．0引物设计软件自行设计引物，PCR扩增SjBBC1基因，将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接，经蓝白筛选、双酶切分析和PCR鉴定后，亚克隆人pQE30原核表达载体中。对原核表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果PCR扩增产物约为650bp，与预期大小相符。将该基因克隆人原核表达载体pQE30，表达蛋白分子质量单位约为23．6ku，并能被日本血吸虫感染兔血清识别。结论构建了pQE30／SjBBC1原核表达重组体载体，表达了具有抗原性的BBC1抗原。     

日本血吸虫10.6 kDa膜蛋白基因的克隆及表达

目的　寻找新的预防日本血吸虫感染疫苗候选分子。　方法　用具保护性的抗血吸虫膜单抗及免疫血清筛选日本血吸虫 c DNA文库 ,PCR扩增 c DNA插入片段 ,A - T连接法将筛选获得的 3个基因片段克隆到p GEM- T载体上 ,自动测序仪测序 ,序列送 BL AST基因服务站进行同源性分析。重新设计引物扩增编号为 B8克隆的开放阅读框碱基序列 ,先将其克隆入 p GEM- T载体质粒 ,再定向亚克隆入 p BK- CMV表达质粒 ,IPTG诱导表达后用 SDS- PAGE和 Western blotting分析表达产物。　结果　经双酶切及 PCR法均证实基因重组成功。其特异性表达产物约为 10 .6 k Da蛋白抗原。表达产物可被免疫血清及单抗识别。　结论　构建了编码日本血吸虫 10 .6k Da蛋白基因表达克隆。     

日本血吸虫Tsunagi蛋白基因的获得、表达及初步鉴定

目的获得日本血吸虫Tsunagi蛋白基因的cDNA序列,克隆、表达和纯化原核蛋白并初步鉴定。方法应用简并引物PCR和5’端、3’端锚定PCR,扩增得到日本血吸虫Tsunagi基因的完整开放阅读框(Open reading frame,ORF)。将该基因亚克隆入原核表达载体pET28a(+),诱导表达并纯化融合蛋白。用纯化后的蛋白免疫小鼠,制备该蛋白的多克隆抗体,分别用ELISA和Western Blotting对表达蛋白进行初步鉴定。结果获得日本血吸虫Tsunagi蛋白基因的完整ORF,序列全长为531bp,编码177个氨基酸。构建的重组质粒pET28a-SjTsunagi在大肠杆菌中获得了可溶性表达;以重组蛋白免疫小鼠获得效价为1∶51 200的多克隆抗体,Western Blotting证实抗体可特异性识别目的蛋白。结论成功获得日本血吸虫Tsu-nagi蛋白编码基因的全长ORF,在大肠杆菌中克隆表达了Tsunagi基因,并制备了特异性多克隆抗体,为进一步研究其在日本血吸虫生殖生物学中的功能奠定了基础。     

日本血吸虫肌球蛋白调节轻链的原核克隆表达及虫期转录特异性

目的在原核系统中克隆表达日本血吸虫肌球蛋白调节轻链(SjMRLC)并分析其基因的虫期转录特异性。方法根据SjMRLC的核苷酸序列(GenBank登录号为AY815219)设计特异性引物,PCR扩增目的基因,并克隆入原核表达载体pGEX4T-3;转至大肠埃希菌BL21株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达;蛋白质印迹分析(Western blotting)鉴定表达产物;提取日本血吸虫各虫期总RNA,反转录成cDNA,PCR扩增分析SjMRLC基因的虫期转录特异性。结果构建pGEX 4T-3/SjMRLC重组质粒,测序表明插入的外源基因片段正确,诱导表达获得带有GST标签的可溶性蛋白(Mr49000);虫期转录特异性分析显示该基因在日本血吸虫各个虫期均有转录,且水平一致。结论成功获得可溶性的带有GST标签的SjMRLC;SjMRLC是管家基因。     

T载体的构建及日本血吸虫肌动蛋白基因PCR产物的快速克隆

目的构建快速高效克隆PCR产物的克隆载体(T载体),并对日本血吸虫肌动蛋白全长编码基因PCR产物进行快速克隆.方法日本血吸虫肌蛋白全长编码基因的扩增采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法.质粒pGEM5Zf ( )经限制性内切酶EcoR V 酶切,在仅含有脱氧胸苷三磷酸(dTTP)的PCR缓冲液中于70 ℃作用2 h,在每个片段的3'端加上一个脱氧胸苷(dT)碱基,构建成T载体.根据PCR扩增产物3'端存在一个非模板依赖的脱氧腺苷(dA)原理,将扩增产物直接克隆入T载体并测序.结果阳性克隆经琼脂糖凝胶电泳、限制性酶切分析、PCR及DNA序列测定等均证实克隆获得成功,且效率很高.与曼氏血吸虫肌动蛋白比较,核苷酸和推断的氨基酸的同源性分别是92.5%和99.7%.结论构建的pGEM5Zf-T载体对日本血吸虫肌动蛋白编码基因的PCR产物直接克隆既经济、简便,又快速、高效,所构建的T载体由于在插入位点两侧具有pUC/M13测序引物序列,可直接测定重组质粒中插入片段的核苷酸序列.所获得的日本血吸虫(大陆株)肌动蛋白编码基因与曼氏血吸虫有极高的同源性.     

日本血吸虫特异性IgE相关抗原编码基因的克隆和鉴定

目的　从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选并克隆日本血吸虫特异性IgE相关抗原编码基因。　方法　用ABC ELISA法从日本血吸虫病流行区筛选出高水平抗血吸虫成虫抗原IgE抗体的个体 15人 ,采集血清并混合。混合血清经Protein G柱吸收后 ,用于日本血吸虫成虫cDNA文库的免疫学筛选。PCR扩增阳性克隆插入cDNA片段。序列分析后 ,于该序列第一开读框两端设计引物并分别引入EcoRⅠ和NotⅠ位点 ,PCR扩增并纯化目的基因片段后克隆入质粒载体pGME T ,再亚克隆入表达载体pGEX 6p 1。经IPTG诱导表达 ,对表达产物进行SDS PAGE和Westernblotting鉴定。　结果　阳性克隆插入片段约 12 0 0bp ,第一开读框长 5 0 7bp ,编码 16 9个氨基酸 ,理论分子量为 19 3kDa。DNA序列分析显示 ,与已知序列同源性小于 4 0 %。重组质粒pGEX 6p 1/Sj4 3B能高效表达融合蛋白 ,且能被日本血吸虫特异性IgE抗体识别。　结论　成功构建的重组质粒pGEX 6p 1/Sj4 3B ,Sj4 3B可编码日本血吸虫特异性IgE抗体相关抗原     

日本血吸虫大陆株副肌球蛋白部分基因克隆

目的 :克隆日本血吸虫大陆株副肌球蛋白部分基因。方法 :用 PCR方法根据已发表日本血吸虫菲律宾株副肌球蛋白基因部分核苷酸序列扩增大陆株副肌球蛋白基因。结果 :获得一日本血吸虫大陆株 72 0 bp基因克隆。结论 :经核苷酸序列分析证实 ,本克隆基因与菲律宾株基因核苷酸同源性为 99.0 3%。     

日本血吸虫SjPGK基因克隆和序列分析

目的　克隆日本血吸虫磷酸甘油酸激酶 (Sj PGK)编码基因片段 ,分析其核苷酸序列。方法　根据曼氏血吸虫磷酸甘油酸激酶 (Sm PGK) c DNA序列设计并合成一对引物 ,以日本血吸虫成虫总 RNA为模板 ,采用逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)特异性扩增 Sj PGK基因片段 ,将其克隆入p MD18- T载体中 ,经双酶切分析和 PCR鉴定 ,将阳性克隆进行脱氧核糖核酸序列测定 ;运用BL AST程序 ,将测序结果及其推导的编码氨基酸序列与 NCBI数据库在核苷酸水平和氨基酸水平进行同源性比较。结果　 RT- PCR特异性扩增出一条长约 830 bp的条带 ;重组质粒的双酶切和以其脱氧核糖核酸为模板的 PCR均可见一条与 RT- PCR产物相同的条带 ;脱氧核糖核酸序列测定和分析结果表明 :Sj PGK基因片段长为 830 bp,与 Sm PGK的核苷酸同源性为 85 % ,分值为 6 72 ;氨基酸同源性为 94 % ,分值为 4 73。结论　成功地克隆了 Sj PGK编码基因片段 ,为寻找日本血吸虫新的抗感染疫苗候选分子奠定基础     

日本血吸虫(中国大陆株)20.2 kDa分子编码基因(Sj20.2)的克隆及序列分析

目的：克隆日本血吸虫中国大陆株20.2kDa分子的编码基因，方法：根据筛选到的日本血吸虫肝期童虫cDNA文库阳性克隆之一的插入片段序列，设计合成1对引物，通过PCR技术对其最大开放阅读框进行扩增，然后克隆人pGEM-T载体，并对克隆产物进行核苷酸序列测定和分析，利用在线软件推测其编码氨基酸的序列，结果：利用PCR方法从上述插入片段中扩增出1条单一的DNA条带，大小介于515bp与697bp之间，将此产物克隆入pGEM-T载体，双酶切和PCR反应结果都出现与前述结果一致的目的片段，核苷酸序列测定结果表明此开放阅读框全长564bp，在线软件分析结果表明，此片段编码187个氨基酸，编码肽段分子量大小约为20．0dDa，结论：本次实验成功扩增和克隆出目的基因片段，为下一步研究奠定了基础。     

血吸虫硫氧还蛋白免疫原性研究Ⅰ日本血吸虫硫氧还蛋白DNA疫苗的构建和鉴定

目的构建日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白(Trx)DNA疫苗(pcDNA3-SjcTrx),并进行分子生物学鉴定。方法根据日本血吸虫菲律宾株Trx基因序列设计一对引物,上游引物引入BamHI酶切位点和起始密码子ATG,下游引物引入EcoRI酶切位点和终止密码子TCA。以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增日本血吸虫大陆株Trx(SjcTrx)编码基因。经双酶切并纯化的PCR产物与经双酶切纯化的pcDNA3质粒DNA片段用T4DNA连接酶连接,克隆入真核表达载体pcDNA3,构建重组质粒pcDNA3-SjcTrx,并经限制性内切酶双酶切、琼脂糖凝胶电泳、PCR检测和核苷酸序列测定进行鉴定。结果SjcTrx编码基因RT-PCR产物约334bp,构建的pcDNA3-SjcTrx重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小基因片段,根据核苷酸序列测定结果推导的氨基酸序列与日本血吸虫菲律宾株和曼氏血吸虫Trx分别有97%和43%的同源性。结论日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白DNA疫苗构建成功,为开展动物保护性免疫试验创造了条件。     

日本血吸虫硫氧还蛋白编码基因的克隆和表达

目的克隆和表达日本血吸虫大陆株硫氧还蛋白(SjcTrx)的编码基因。方法根据日本血吸虫菲律宾株硫氧还蛋白基因序列设计一对引物,上游引物引入BamHI酶切位点和起始密码子ATG,下游引物引入SalI酶切位点和终止密码子TAA。以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增SjcTrx基因。经双酶切并纯化的PCR产物与同样双酶切并纯化的pET28a质粒DNA片段用T4 DNA连接酶连接,构建重组质粒pET28a-SjcTrx,转化BL21感受态菌并大量扩增。重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切、PCR、琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列测定进行鉴定。pET28a-SjcTrx/BL21用IPTG诱导表达。结果SjcTrx编码基因RT-PCR产物约334 bp,构建的重组pET28a-SjcTrx表达质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小基因片段。根据核苷酸序列测序结果推导的氨基酸序列与日本血吸虫菲律宾株和曼氏血吸虫Trx分别有97%和43%的同源性。表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,约14kDa。Western blotting显示该重组蛋白可被日本血吸虫感染兔血清和重组抗原免疫小鼠血清所识别。结论SjcTrx基因的表达获得成功,并获得纯化蛋白,为开展动物保护性免疫试验创造了条件。     

Sj28GST基因克隆和高效表达产物的纯化

目的　从日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库中克隆 2 8kDa谷胱甘肽 -S -转移酶 (Sj2 8GST)基因 ,获得用于疫苗和T细胞表位研究的高纯度重组融合蛋白 2 8GST -TRX。方法　应用引物特异性PCR技术 ,从日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库中扩增Sj2 8GST基因 ,经琼脂糖凝胶电泳结合碱基序列分析鉴定后 ,采用定向克隆技术构建Sj2 8GST -TRX融合蛋白重组表达载体并诱导其在大肠杆菌BL2 1(DE3)的表达 ,用Western -blotting测定以融合蛋白方式表达的Sj2 8GST的免疫原性 ,通过包涵体纯化结合Ni+柱亲和层析获得高纯度重组融合蛋白。结果　Sj2 8GSTPCR产物为约 6 4 0bp ,其碱基序列 (6 33bp)和推导的氨基酸序列 (2 11aa)与GenBank报道一致 ;获得了Sj2 8GST -TRX重组质粒 ;2 8GST -TRX融合蛋白在大肠杆菌以包涵体形式高效表达 ;在分子量为约 4 3kDa处有一能与羊抗Sj2 8GST抗体产生特异性反应的含 2 8GST融合蛋白条带 ;包涵体纯化法结合Ni+ 亲和层析可获得高纯度的重组融合蛋白。结论　获得到了日本血吸虫中国大陆株 2 8GST分子的全长基因和高纯度重组 2 8GST -TRX融合蛋白 ,该融合蛋白具有天然Sj2 8GST免疫原性。     

Mago nashi:一个日本血吸虫性别决定基因的发现与鉴定

目的　运用免疫学方法筛选日本血吸虫 (中国大陆株 )童虫cDNA文库 ,寻找血吸虫新基因 ,并克隆和鉴定一个日本血吸虫决定性别的Magonashi样蛋白基因。方法　用混合的血吸虫感染者血清免疫学筛选日本血吸虫童虫cDNA文库 ,随机挑取阳性重组克隆进行测序 ,以获得血吸虫基因 ,并通过BLAST程序进行比较及同源性分析 ,根据分析结果设计合成引物 ,用PCR法扩增出日本血吸虫Magonashi样蛋白基因 (SiM)编码序列 ,将其克隆入pGEM T载体和 pBKCMV载体 ,用双酶切、以质粒为模板进行PCR扩增和测序进行鉴定。结果　本研究共挑取 7个阳性克隆 ,通过测序获得了 5个有表达序列标签(ExpressedSequenceTag .EST)价值的序列 ,并进行了同源性分析 ;用PCR法扩增出大小为 4 4 1bpSjM开放阅读框 ,重组质粒pGEM SjM和 pBKCMV SjM经双酶切均可获得一条为PCR产物一致的DNA片段。 结论　本实验获得了 5个有EST价值的序列 ,并成功地克隆了其中SjM编码基因。     

日本血吸虫副肌球蛋白全基因克隆、测序及体内表达

目的： 将日本血吸虫大陆株副肌球蛋白（ Ｓｊｃ９７） 编码区全基因克隆及测序, 并研究 Ｓｊｃ９７ 全基因核酸疫苗在小鼠体内的表达。方法： 抽提日本血吸虫成虫总 Ｒ Ｎ Ａ, 逆转录 聚合酶链反应 （ Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ） 扩增编码 Ｓｊｃ９７的全基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ, 双脱氧链末端终止法测 Ｄ Ｎ Ａ 序列。构建含 Ｓｊｃ９７ 全基因的质粒表达载体 （ｐ Ｃ Ｍ Ｖ Ｓｊｃ９７） , 并用免疫荧光染色法研究ｐ Ｃ Ｍ Ｖ Ｓｊｃ９７ 在小鼠体内的表达特性。结果与结论： 用 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 扩增获得了 Ｓｊｃ９７ 的编码区全基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ, 并测定了该基因编码区的全序列。与日本血吸虫菲律宾株、日本株及曼氏血吸虫副肌球蛋白编码区全基因比较, 核苷酸序列同源性分别为： ９９４ ％ 、９９２ ％ 和９１０ ％ ; 推导的氨基酸序列同源性分别为：９９７ ％ 、９９８ ％ 和９６０ ％ 。ｐ Ｃ Ｍ Ｖ Ｓｊｃ９７ 核酸疫苗能在注射的小鼠局部肌肉组织表达 Ｓｊｃ９７ 。     

日本血吸虫酪氨酸羟化酶基因的克隆和序列分析

目的　克隆并鉴定日本血吸虫酪氨酸羟化酶(TH)基因,探讨其他信号蛋白在信号传导中对TH的调节及其之间的分子作用机制,从而为血吸虫新型疫苗的设计和药物开发开辟新的途径。　方法　以曼氏血吸虫的 TH cDNA为模板设计引物,以日本血吸虫成虫mRNA为模板逆转录合成cDNA链,将扩增出的日本血吸虫TH蛋白编码基因序列,克隆入 pGEM T easy载体,用单酶双切法和DNA测序进行鉴定,并与曼氏血吸虫的TH基因序列进行同源性比较。　结果　自日本血吸虫RNA经逆转录得到一长度为 480 bp的 DNA片段,经测序与曼氏血吸虫 TH的同源性为 87%。结论　成功扩增出日本血吸虫TH的中间编码区域,为进一步扩增日本血吸虫TH基因全长以及后续实验奠定了基础。     

日本血吸虫VCP基因的克隆表达及其在不同生活史期的mRNA表达水平

目的 目的 从原核表达日本血吸虫含缬酪肽蛋白 （VCP） 基因, 并分析其在不同生活史期的mRNA表达水平。方法 方法 提取日本血吸虫虫卵RNA, 逆转录为cDNA, PCR扩增日本血吸虫VCP基因, 亚克隆至原核表达载体pET15b; 重组质粒转 化入E. coli BL21, 异丙基硫代半乳糖苷 （IPTG） 诱导目的基因表达, 并采用包涵体纯化方法获取重组蛋白, 产物行十二烷基 硫酸钠?聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS?PAGE） 进行分析鉴定。提取日本血吸虫尾蚴、 童虫、 雌虫、 雄虫、 虫卵RNA, DNase消化, 纯化后逆转录为cDNA, 采用荧光实时定量PCR分析VCP基因在上述生活史期的表达水平。结果 结果 PCR扩增获得日本血 吸虫VCP基因, 经重组质粒表达和包涵体纯化成功获得重组蛋白。荧光实时定量PCR检测发现, 日本血吸虫VCP基因在 尾蚴中的mRNA表达水平最高, 在童虫、 虫卵、 雄虫、 雌虫中表达水平较低。结论 结论 获得日本血吸虫VCP基因编码的重组 蛋白; 日本血吸虫VCP基因mRNA在尾蚴阶段表达水平最高, 在童虫、 虫卵、 雄虫、 雌虫中表达水平较低。。     

日本血吸虫溶血磷脂酶编码基因真核表达载体的构建和表达及鉴定

目的 从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出溶血磷脂酶编码基因(Si1539),并亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),旨在提取重组抗原进行免疫原性分析,并用于免疫学诊断.方法 提取日本血吸虫成虫总RNA,反转录生成cDNA,PCR法扩增出Sj1539基因,通过克隆载体pGEM-T连接,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),然后转染至人宫颈癌细胞株(HeLa细胞)中表达,表达产物用Western印迹法进行鉴定.结果 Sj1539基因PCR扩增产物片段长度为684 bp.重组质粒pcDNA3.1(+)-Sj1539经BamH I、Xho I双酶切和PCR扩增鉴定,证实Sj1539基因已成功插入.重组质粒pcDNA3.1(+)-Sj1539在HeLa细胞中的表达产物经Western印迹法鉴定能够与日本血吸虫感染的兔血清反应,其相对分子质量(Mr)约为25×103.结论 成功构建了日本血吸虫Si1539基因真核表达载体,并获得了表达产物.

Abstract：

Objective Schistasoma japonicum(S.japonicum)lysophospholipase gene(Sjl539)from cDNA of S japonicum adult worms was amplified and subcloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)for expression of recombinant antigen and immunogenicity analysis.Methods Total RNA of S.japonicum was extracted to generato cDNA by RT-PCR.The Sj1539 gent was amplified.The DNA fragment was subcloned into eukaryofic expression vector pcDNA3.1(+)following insertion and amplification in pGEM-T.The recombinant plasmid was transfected into human cervical carcinoma cell strain(Hela cells)and expression products were identified by Western blotting.Results The size of PCR product was approximately 684 bp.It was confirmed that Sj1539 gene had been inserted successfully by the recombinant plasmid digested with two enzymes and PCR.It was verified that the expression product could react with S.japonicum-infected rabbit serum by Western blotting and the molecular weight was approximately 25×103.Conclusions The eukaryotie expression vector carrying Sj1539 gene has been established and the expression product has been obtained.     

Schistosoma mansoni tropomyosin: production and purification of the recombinant protein and studies on its immunodiagnostic potential

A cDNA that encodes Schistosoma mansoni tropomyosin, except for 10 amino acids at the amino terminus, has been cloned into a pOTSNCO plasmid vector. Induced expression resulted in a constant level of recombinant protein production. The recombinant S. mansoni tropomyosin was purified from preparative SDS-PAGE gel and by a combination of 20% ammonium sulfate fractionation and fast protein liquid chromatography-ion-exchange chromatography. The purified recombinant S. mansoni tropomyosin was tested as an immunodiagnostic reagent in Western blot and enzyme-linked immunosorbent assays. Sera from individual patients with chronic S. mansoni infection, but not S. haematobium, S. japonicum, parasitic infections other than schistosomiasis, and without infection reacted with the recombinant tropomyosin. The species specificity of S. mansoni tropomyosin suggests that further study of its potential as an immunodiagnostic reagent is warranted.